1.本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种木糖驹形氏杆菌培养基及利用该培养基制备细菌纤维素的方法。
背景技术：2.聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)是一种常见的合成纤维，具有织物和包装材料的理想特性，如可塑性、透明度和耐久性。据报道，2020年全球准备了3.59亿吨的pet，预计未来每年将增加3％。近年来，由于pet的生物降解性和光降解性较低，它已获得越来越多的关注。废物管理的传统做法导致大量的pet释放到环境中，這是一个严重的环境问题。例如，散落的pet废料阻碍了排水，恶化了土壤性质，并在燃烧时释放出有毒气体，从而干扰了环境。此外，pet废料对植物、动物和人类构成了严重的健康风险。已经制定了不同的策略来回收废弃的pet或将其转化为其他有用的产品。然而，由于处理成本高、消费者接受度高、安全管理等原因，只有不到30％的pet被回收。
3.细菌纤维素(bc)是由一些革兰氏阴性细菌分泌的，在空气-液体界面上产生的白色凝胶状bc颗粒，由于呈现出独特的特性，如高纯度(不含果胶、木质素和半纤维素)、结晶度(》80％)，而引起材料科学家和聚合物化学家的极大兴趣。杨氏模量(约25gpa)、抗拉强度(200-400兆帕)、热稳定性(热降解温度为355-375℃)和超细的三维(3d)纤维素纳米纤维网络(2-9纳米)。由于其独特的性能，bc作为一种重要的生物材料被广泛探索，其应用于许多领域，如食品、化妆品、生物医学、纺织品和高端声学膜片。尽管bc生产商利用各种基质生产bc，但其转换效率低，导致产量低，导致其生产成本高，从而限制了其广泛的应用。为了提高bc生产者的底物转化效率，最大限度地降低bc的生产成本，农工业废弃物的水解物，如小麦秸秆、葵花籽粕和彩色大米，这些都是不同糖类的丰富来源，已经被转化成bc。在bc的从头合成过程中，也会产生一些副产品，如以α-葡萄糖醛酸为基础的有机酸，会降低bc的总体产量。
4.如何利用富含碳的pet塑料作为生物技术过程的原料而不是废弃物，是改善pet回收可行的替代方法。目前还没有直接利用pet塑料作为添加剂促进细菌纤维素合成的报道。
技术实现要素：5.本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提供了一种木糖驹形氏杆菌培养基及利用该培养基制备细菌纤维素的方法。
6.为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
7.本发明的第一目的在于提供一种木糖驹形氏杆菌培养基，每升所述培养基中含有葡萄糖20g，酵母提取物5g，蛋白胨5g，一水柠檬酸1.15g，磷酸氢二钠2.7g，其余为聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液，ph值为6.5～7.0。
8.进一步的，所述聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液的制备过程为将聚对苯二甲酸乙二
醇酯整理成小块，然后加入0.4～0.8mol/l nh3·
h2o中进行水解，水解反应温度为160～180℃，反应时间25～30min，反应结束后，反应液中和至ph为6.5～7.5，得到聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液。
9.本发明的第二目的在于提供利用上述木糖驹形氏杆菌培养基制备细菌纤维素的方法，包括以下步骤：
10.步骤s1，木糖驹形氏杆菌的活化
11.将木糖驹形氏杆菌原种接种于固体培养基上获得木糖驹形氏杆菌菌落；
12.步骤s2，木糖驹形氏杆菌的扩大培养
13.将步骤s1得到的木糖驹形氏杆菌菌落接种于液体培养基上，获得木糖驹形氏杆菌种子液；
14.步骤s3，细菌纤维素发酵培养基的制备
15.采用所述的木糖驹形氏杆菌培养基；
16.步骤s4，细菌纤维素发酵液的制备
17.将步骤s2得到的木糖驹形氏杆菌种子液，按照5％～15％的接种量将木糖驹形氏杆菌种子液接种至步骤s3得到的细菌纤维素发酵培养基中，在28～30℃下，发酵8～10d，得到细菌纤维素发酵液；
18.步骤s5、细菌纤维素的制备
19.将步骤s4得到的细菌纤维素发酵液液面上层的细菌纤维素膜取出，先加入碳酸钠溶液中进行加热煮沸，后用水冲洗；再将细菌纤维素膜放入水中加热煮沸，最后冲洗得到纯净的细菌纤维素膜水洗到中性后，吸干水分，干燥至恒重，得到细菌纤维素。
20.进一步的，步骤s1中，所述固体培养基中含有酵母提取物5～6g、蛋白胨5g、葡萄糖15～20g、一水柠檬酸1～1.15g、2.5～2.7g na2hpo4、琼脂15～18.0g和蒸馏水1.0l。
21.进一步的，步骤s1中，所述所述液体培养基配中含有酵母提取物5～6g/l，蛋白胨4～5g/l，葡萄糖15～20g/l，一水柠檬酸1～1.15g/l，2.5～2.7g/lna2hpo4，ph值为6.5～7.0。
22.进一步的，步骤s5中，碳酸钠溶液的浓度为1-3％。
23.进一步的，步骤s5中，加热温度为80℃～100℃。
24.本发明的第三目的在于提供一种采用上述方法制备得到的细菌纤维素。
25.进一步的，细菌纤维素的比表面积为33～37m2/g，平均孔径为19～29nm。
26.与现有技术比较，本发明提供的技术方案带来的有益效果是：
27.(1)本发明公开的利用pet氨解液促进细菌纤维素合成的方法，用于细菌纤维素发酵的培养基是以hs培养基配方为基础，添加聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液(petah)得到的，聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液作为促进剂，有效将木糖驹形氏杆菌(taonella.mepensis)的纤维素产量提高2倍，通过提高纤维素合成相关酶类活性，例如：udp-葡萄糖焦磷酸化酶(ugp)和葡萄糖磷酸变位酶(pgm)的活性分别提高30.63％与135.24％，抑制葡萄糖分解途径相关酶类如：丙酮酸激酶(pk)和磷酸果糖激酶(pfk)降低40.34％和52.63％，进而提高细菌纤维素产量至4.91g/l。
28.(2)采用本发明的发明制备得到的细菌纤维素(bc)表现出较低的结晶度、较优的表面积和较大的孔径，相较于采用hs培养基发酵培养木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)，本发明制备得到的细菌纤维素的比表面积提高约3.9倍，总孔体积增加约4倍。
29.(3)本发明通过高温氨解的方法有效地分解了聚对苯二甲酸乙二醇酯，并将获得的聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液“作为微生物发酵的营养添加剂”，加入到传统hs培养基中，得到本发明的细菌纤维素培养基，有效的利用聚对苯二甲酸乙二醇酯作为添加剂，不仅减少了聚对苯二甲酸乙二醇酯对环境的污染，还节省了制备细菌纤维素的成本，适宜于规模生产细菌纤维素。
附图说明
30.图1a为petah浓度对petah-hs培养基中dcw和bc产生的影响趋势图；
31.图1b为petah浓度对petah-hs培养基中的葡萄糖消耗和bc/葡萄糖转化率比较图；
32.图2为木糖驹形氏杆菌在petah-hs培养基和hs培养基中生长过程的分析对比图；(a)petah-hs培养基与hs培养基的ph值变化趋势图、(b)petah-hs培养基与hs培养基培养木糖驹形氏杆菌的细胞密度变化趋势图、(c)为petah-hs培养基与hs培养基培养木糖驹形氏杆菌的葡萄糖变化趋势图、(d)为petah-hs培养基与hs培养基培养木糖驹形氏杆菌的葡萄糖酸变化趋势图、(e)为petah-hs培养基与hs培养基培养木糖驹形氏杆菌的对苯二甲酸(ta)和乙二醇(eg)的化趋势图、(f)为petah-hs培养基与hs培养基培养木糖驹形氏杆菌的细菌纤维素产量的变化趋势图；
33.图3a为不同培养基产生的bc样品的红外光谱对比图；
34.图3b为不同培养基产生的bc样品的x射线衍射曲线对比图；
35.图3c为不同培养基产生的bc样品的tga热分析对比图；
36.图3d为不同培养基产生的bc样品的dtg热分析对比图；
37.图4为不同培养基对参与bc合成代谢和葡萄糖分解代谢分析图，(a)磷酸果糖激酶(pfk)活性影响图、(b)丙酮酸激酶(pk)活性影响图、(c)葡萄糖磷酸变位酶(pgm)活性影响图、(d)udp-葡萄糖焦磷酸化酶(ugp)活性的影响图。
具体实施方式
38.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例和附图，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
39.本发明用到的菌种：木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)生物保藏编号为：cicc10529。
40.实施例1
41.制备细菌纤维素：
42.1、木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)的活化
43.将0.5ml无菌水注入冻干管，轻轻吹打充分溶解成悬浮液。吸取菌悬液，200μl打入培养基表面，30℃下培养，两天后木糖驹形氏杆菌固体培养基上会长出新的菌落。木糖驹形氏杆菌的固体培养基：酵母提取物5g，蛋白胨5g，葡萄糖20g，一水柠檬酸1.15g，2.7g na2hpo4，琼脂18.0g，蒸馏水1.0l。
44.2、木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)的扩大培养
45.制备木糖驹形氏杆菌液体培养基，配方包括酵母提取物5g/l，蛋白胨5g/l，葡萄糖
20g/l，一水柠檬酸1.15g/l，2.7g/lna2hpo4，调节ph值为7.0，接种活化的木糖驹形氏杆菌于该培养基中，于30℃下振荡培养24小时，得到木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)种子液，木糖驹形氏杆菌种子液中的木糖驹形氏杆菌浓度为106个/ml～108个/ml。
46.3、细菌纤维素发酵培养基的制备
47.聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液(petah)的制备过程为：将聚对苯二甲酸乙二醇酯粉碎成3
×
3mm2小块，然后加入0.6mol/l nh3·
h2o中进行水解，水解反应温度为180℃，反应时间30min，反应结束后，反应液中和至ph为7.0，得到聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液(petah)。
48.取1l 1％的聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液，加入5g酵母提取物、5g蛋白胨、20g葡萄糖、1.15g一水柠檬酸和2.7g na2hpo4，调ph值为7.0，得到细菌纤维发酵培养基。
49.4、细菌纤维素发酵液的制备
50.取木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)种子液，按照每90ml接种10ml的接种量，将木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)种子液接入细菌纤维素发酵培养基中，在28℃静态发酵10d后结束发酵，得细菌纤维素发酵液。
51.5、细菌纤维素的制备
52.取细菌纤维素发酵液中的细菌纤维素膜，将细菌纤维素膜放入200ml，2％碳酸钠溶液中100℃水浴30min，用去离子水冲洗数次后，将细菌纤维素膜放入200ml去离子水中100℃水浴30min，再用去离子水冲洗数次至中性后得到纯净的细菌纤维素薄膜。按照细菌纤维素(bc)干重/培养基总体积计算产量，其产量为4.91g/l。
53.实施例2
54.1、木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)的活化
55.同实施例1。
56.2、木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)的扩大培养
57.同实施例1。
58.3、细菌纤维素发酵培养基的制备
59.聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液(petah)的制备过程为：将聚对苯二甲酸乙二醇酯整理成3
×
3mm2小块，然后加入0.4mol/l nh3·
h2o中进行水解，水解反应温度为160℃，反应时间25min，反应结束后，反应液中和至ph为7，得到聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液(petah)。
60.取1l 1.0％的聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液，加入5g酵母提取物、5g蛋白胨、20g葡萄糖、1.15g一水柠檬酸和2.7g na2hpo4，调ph值为7.0，得到细菌纤维发酵培养基。
61.4、细菌纤维素发酵液的制备
62.取木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)种子液，按照每90ml接种10ml的接种量，将木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)种子液接入细菌纤维素发酵培养基中，在28℃静态发酵10d后结束发酵，得细菌纤维素发酵液。
63.5、细菌纤维素的制备：
64.取细菌纤维素发酵液中的细菌纤维素膜，将细菌纤维素膜放入200ml，2％碳酸钠溶液中100℃水浴30min，用去离子水冲洗数次后，将细菌纤维素膜放入200ml去离子水中100℃水浴30min，再用去离子水冲洗数次后得到纯净的细菌纤维素薄膜。按照细菌纤维素(bc)干重/培养基总体积计算产量，其产量为3.07g/l。
65.实施例3
66.1、木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)的活化
67.同实施例1。
68.2、木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)的扩大培养
69.同实施例1。
70.3、细菌纤维素发酵培养基的制备
71.聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液(petah)的制备过程为：将聚对苯二甲酸乙二醇酯整理成3
×
3mm2小块，然后加入0.8mol/l nh3·
h2o中进行水解，水解反应温度为170℃，反应时间30min，反应结束后，反应液中和至ph为7，得到聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液(petah)。
72.取1l 1.0％的聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液，加入5g酵母提取物、5g蛋白胨、20g葡萄糖、1.15g一水柠檬酸和2.7g na2hpo4，调ph值为7.0，得到细菌纤维发酵培养基。
73.4、细菌纤维素发酵液的制备
74.取木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)种子液，按照每90ml接种10ml的接种量，将木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)种子液接入细菌纤维素发酵培养基中，在28℃静态发酵10d后结束发酵，得细菌纤维素发酵液。
75.5、细菌纤维素的制备
76.取细菌纤维素发酵液中的细菌纤维素膜，将细菌纤维素膜放入200ml，2％碳酸钠溶液中100℃水浴30min，用去离子水冲洗数次后，将细菌纤维素膜放入200ml去离子水中100℃水浴30min，再用去离子水冲洗数次后得到纯净的细菌纤维素薄膜。按照细菌纤维素(bc)干重/培养基总体积计算产量，其产量为4.58g/l。
77.实施例4
78.1、木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)的活化
79.同实施例1。
80.2、木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)的扩大培养
81.同实施例1。
82.3、细菌纤维素发酵培养基的制备
83.聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液同实施例1。
84.取1l 1.0％的聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液，加入5g酵母提取物、5g蛋白胨、20g葡萄糖、1.15g一水柠檬酸和2.7g na2hpo4，调ph值为6.5，得到细菌纤维发酵培养基。
85.4、细菌纤维素发酵液的制备
86.取木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)种子液，按照每85ml接种15ml的接种量，将木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)种子液接入细菌纤维素发酵培养基中，在30℃静态发酵8d后结束发酵，得细菌纤维素发酵液。
87.5、细菌纤维素的制备
88.取细菌纤维素发酵液中的细菌纤维素膜，将细菌纤维素膜放入200ml，2％碳酸钠溶液中100℃水浴30min，用去离子水冲洗数次后，将细菌纤维素膜放入200ml去离子水中100℃水浴30min，再用去离子水冲洗数次后得到纯净的细菌纤维素薄膜。按照细菌纤维素(bc)干重/培养基总体积计算产量，其产量为4.84g/l。
89.实施例5
90.1、木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)的活化
91.同实施例1。
92.2、木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)的扩大培养
93.同实施例1。
94.3、细菌纤维素发酵培养基的制备
95.聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液同实施例1。
96.取1l 1.0％的聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液，加入5g酵母提取物、5g蛋白胨、20g葡萄糖、1.15g一水柠檬酸和2.7g na2hpo4，调ph值为7.0，得到细菌纤维发酵培养基。
97.4、细菌纤维素发酵液的制备
98.取木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)种子液，按照每95ml接种5ml的接种量，将木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)种子液接入细菌纤维素发酵培养基中，在28℃静态发酵8d后结束发酵，得细菌纤维素发酵液。
99.5、细菌纤维素的制备
100.取细菌纤维素发酵液中的细菌纤维素膜，将细菌纤维素膜放入200ml，2％碳酸钠溶液中100℃水浴30min，用去离子水冲洗数次后，将细菌纤维素膜放入200ml去离子水中100℃水浴30min，再用去离子水冲洗数次后得到纯净的细菌纤维素薄膜。按照细菌纤维素(bc)干重/培养基总体积计算产量，其产量为3.58g/l。
101.实施例6
102.1、木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)的活化
103.同实施例1。
104.2、木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)的扩大培养
105.同实施例1。
106.3、细菌纤维素发酵培养基的制备
107.聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液同实施例1。
108.取1l 0.5％的聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液，加入5g酵母提取物、5g蛋白胨、20g葡萄糖、1.15g一水柠檬酸和2.7g na2hpo4，调ph值为7.0，得到细菌纤维发酵培养基。
109.4、细菌纤维素发酵液的制备
110.取木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)种子液，按照每90ml接种10ml的接种量，将木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)种子液接入细菌纤维素发酵培养基中，在28℃静态发酵10d后结束发酵，得细菌纤维素发酵液。
111.5、细菌纤维素的制备
112.取细菌纤维素发酵液中的细菌纤维素膜，将细菌纤维素膜放入200ml，2％碳酸钠溶液中100℃水浴30min，用去离子水冲洗数次后，将细菌纤维素膜放入200ml去离子水中100℃水浴30min，再用去离子水冲洗数次后得到纯净的细菌纤维素薄膜。按照细菌纤维素(bc)干重/培养基总体积计算产量，其产量为3.61g/l。
113.实施例7
114.1、木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)的活化
115.同实施例1。
116.2、木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)的扩大培养
117.同实施例1。
118.3、细菌纤维素发酵培养基的制备
119.聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液同实施例1。
120.取1l 1.5％的聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液，加入5g酵母提取物、5g蛋白胨、20g葡萄糖、1.15g一水柠檬酸和2.7g na2hpo4，调ph值为7.0，得到细菌纤维发酵培养基。
121.4、细菌纤维素发酵液的制备
122.取木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)种子液，按照每90ml接种10ml的接种量，将木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)种子液接入细菌纤维素发酵培养基中，在28℃静态发酵10d后结束发酵，得细菌纤维素发酵液。
123.5、细菌纤维素的制备
124.取细菌纤维素发酵液中的细菌纤维素膜，将细菌纤维素膜放入200ml，2％碳酸钠溶液中100℃水浴30min，用去离子水冲洗数次后，将细菌纤维素膜放入200ml去离子水中100℃水浴30min，再用去离子水冲洗数次后得到纯净的细菌纤维素薄膜。按照细菌纤维素(bc)干重/培养基总体积计算产量，其产量为3.89g/l。
125.对比例1
126.1、木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)的活化
127.同实施例1。
128.2、木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)的扩大培养
129.同实施例1。
130.3、细菌纤维素发酵培养基的制备
131.取1l蒸馏水，加入5g酵母提取物、5g蛋白胨、20g葡萄糖、1.15g一水柠檬酸和2.7g na2hpo4，调ph值为7.0，得细菌纤维发酵培养基。
132.4、细菌纤维素发酵液的制备：
133.取木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)种子液，按照每90ml接种10ml的接种量，将木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)种子液接入细菌纤维素发酵培养基中，在28℃静态发酵10d后结束发酵，得细菌纤维素发酵液。
134.5、细菌纤维素的制备
135.取细菌纤维素发酵液中的细菌纤维素膜，将细菌纤维素膜放入200ml，2％碳酸钠溶液中100℃水浴30min，用去离子水冲洗数次后，将细菌纤维素膜放入200ml去离子水中100℃水浴30min，再用去离子水冲洗数次后得到纯净的细菌纤维素薄膜。按照细菌纤维素(bc)干重/培养基总体积计算产量，其产量为2.28g/l。
136.对比例2
137.1、木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)的活化
138.同实施例1。
139.2、木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)的扩大培养
140.同实施例1。
141.3、细菌纤维素发酵培养基的制备
142.聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液同实施例1。
143.取1l 2.0％的聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液，加入5g酵母提取物、5g蛋白胨、20g
葡萄糖、1.15g一水柠檬酸和2.7g na2hpo4，调ph值为6.8，得到细菌纤维发酵培养基。
144.4、细菌纤维素发酵液的制备：
145.取木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)种子液，按照每90ml接种10ml的接种量，将木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)种子液接入细菌纤维素发酵培养基中，在28℃静态发酵10d后结束发酵，得细菌纤维素发酵液。
146.5、细菌纤维素的制备
147.取细菌纤维素发酵液中的细菌纤维素膜，将细菌纤维素膜放入200ml，2％碳酸钠溶液中100℃水浴30min，用去离子水冲洗数次后，将细菌纤维素膜放入200ml去离子水中100℃水浴30min，再用去离子水冲洗数次后得到纯净的细菌纤维素薄膜。按照细菌纤维素(bc)干重/培养基总体积计算产量，其产量为2.08g/l。
148.为了更好的说明聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液(petah)在一定浓度范围内对细菌纤维素的产量有促进作用，本技术人以实施例1、实施例6、实施例7、对比例1和对比例2制备得到细菌纤维素(bc)产量和培养物中的干细胞重量(dcw)进行了对比研究，其中实施例1制备的细菌纤维素发酵培养基简称petah-hs培养基，对比例1制备的细菌纤维素发酵培养基简称hs培养基。
149.结果如图1a所示，培养物中的干细胞重量(dcw)和bc产量随着petah浓度增加到1％而增加，随后产量急剧下降。结果进一步表明，当原始petah用水稀释两次时，在petah-hs培养基中，bc产量最高可达4.91g/l。相反，在hs培养基中产生了2.28g/l bc，表明在petah-hs培养基中的产量要高得多。在本发明中，最佳浓度的petah将bc产量提高了115％。还确定了petah-hs培养基中的残留葡萄糖含量，以计算bc生产过程中葡萄糖到bc的转化效率。
150.如图1b所示，随着petah含量从0上升到1％，葡萄糖消耗的百分比从96.05％下降到85.03％。随着bc产量的增加，葡萄糖消耗的减少导致bc到葡萄糖的转化效率从12.04％显着上升到29.22％。这表明petah已被用于部分替代葡萄糖作为能源；因此，更多的葡萄糖被用于bc合成。然而，随着petah浓度进一步增加到2％，bc到葡萄糖的转化效率急剧下降到5.47％，这可能是由于高底物浓度对木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)的生长抑制作用，最终导致降低bc产量。
151.为了更好的说明利用本发明的细菌纤维素发酵培养基发酵木糖驹形氏杆菌提高制备细菌纤维素的产量的原因，本技术人以实施例1制备的细菌纤维素发酵培养基(petah-hs培养基)发酵木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)探究了木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)分泌细菌纤维素的时间过程，还比较了不同培养基(petah-hs培养基或hs培养基)中生产的细菌纤维素的结构特征。
152.结果如图2所示，比较了在hs培养基和petah-hs培养基中生长的培养物的生长曲线，在整个发酵期间：如图(a)所示，添加petah的木糖驹形氏杆菌培养物的ph值远高于hs介质的；如图(b)所示，补充petah的培养物中的细胞密度要高得多；如图(c)和(d)所示，当在1％petah培养基中生长时，与在hs培养基中生长的菌株相比，木糖驹形氏杆菌吸收较少的葡萄糖并产生较少的葡萄糖酸；如图(e)所示，在最佳培养条件下(1％petah培养基中)，利用液相色谱检测发现：木糖驹形氏杆菌在6天内吸收了几乎所有的对苯二甲酸(ta)，而乙二醇(eg)一直保持到第8天；如图(f)所示，从petah-hs培养基获得的4.91g/l的最大bc产量远
高于从hs培养基获得的bc产量(2.28g/l)。
153.如图3a所示，为不同培养基产生的bc样品的红外光谱对比图。来自petah补充hs介质的光谱与从bc-hs获得的光谱几乎相似，其在556、1054、2895和3336cm-1处显示纤维素的特征峰，两种样品的ftir光谱没有明显差异。两种bc薄膜均在710和750cm-1处显示峰，对应于i型纤维素中存在的单斜iα和三斜iβ部分。从ftir光谱中，可以使用machado方法计算iα分数，与hs培养基(bc-hs)相比，在petah-hs培养基(bc-petah)中产生的bc样品中发现了低iα含量。这可能是因为补充剂扰乱了微纤维和微晶取向的形成。
154.如图3b所示，为不同培养基产生的bc样品的x射线衍射曲线对比图。两种不同培养基制备得到的两个bc薄膜均显示出相似的图案，在2θ＝14.5
°
、16.7
°
和22.5
°
处具有三个衍射峰，分别对应于(100)、(010)和(110)晶格平面。这是bc样品具有经典纤维素(i型)的所有特征条带。bc-petah(73.17％)的ci低于bc-hs(84.63％)，这可能是由于在培养过程中添加了petah添加剂可能破坏了bc的结晶。此外，该添加剂petah改变了bc的交联氢键网络，增加了纤维素链之间的距离，从而破坏了线性β-葡聚糖链排列成有序晶体结构的过程。
155.如图3c所示，为不同培养基产生的bc样品的tga热分析对比图。不同bc薄膜的tga热分析图显示，bc-petah(红色)的热解聚开始于240℃，bc-hs(黑色)的热解聚开始于250℃。
156.如图3d所示，为不同培养基产生的bc样品的dtg热分析对比图。表明bc-petah和bc-hs的最大降解温度分别为298℃和320℃，表明bc-petah的热稳定性低于bc-hs。在此温度下发生的bc最大降解可能导致左旋葡聚糖的释放。
157.bc-hs和bc-petah的平均聚合度(dp)值如表1所示。在hs培养基中加入petah后，bc的dp降低。bc-petah的dp值为1878，低于bc-hs(2088)，这与通过xrd确定的ci一致。
158.bc具有值得称道的机械特性，使其适用于各种用途，例如生物医学、食品添加剂和污水净化。通过测定杨氏模量、拉伸强度和断裂伸长率，研究添加剂对bc力学行为的影响，数据如表1所示。本技术人发现bc-petah的断裂伸长率略长与bc-hs相比(p》0.05)，而与bc-hs相比，bc-petah的杨氏模量和拉伸强度略有下降(p》0.05)。机械性能的小幅降低可能与dp和ci降低有关。
159.比表面积和孔径是控制bc吸附行为的关键参数。本技术人进行了bjh孔径和bet表面积分析。孔表面尺寸的增长导致比表面积的增加，本发明中bcpetah和bc-hs的孔径证实了这一点。表1显示bc-petah bc-hs的平均孔径分别为24.526nm和17.645nm。同时，bc-hs和bc-petah的总孔体积从0.049增加到0.211cm3/g。这导致比表面积从9.069m2/g(bc-hs)扩大到35.388m2/g(bc-petah)。bc-petah的比表面积是bc-hs的3.9倍。
160.表1.不同发酵液生产的bc的特性比较
[0161][0162]
本技术人为了探究petah促进纤维素生物合成的分子机理，还进行了糖代谢的关键酶的研究。结果发现葡萄糖分解代谢相关酶类：丙酮酸激酶(pk)、磷酸果糖激酶(pfk)的活性降低，糖分解收到抑制。同时纤维素合成关键酶：udp-葡萄糖焦磷酸化酶(ugp)和葡萄糖磷酸变位酶(pgm)活性增强，加快细菌纤维素的合成。
[0163]
如图4所示，为不同培养基对参与bc合成代谢和葡萄糖分解代谢的pfk(a)、pk(b)、pgm(c)和ugp(d)活性的影响图。添加petah的hs培养基分别提高了udp-葡萄糖焦磷酸化酶(ugp)和葡萄糖磷酸变位酶(pgm)的活性30.63％和135.24％，降低了丙酮酸激酶(pk)和磷酸果糖激酶(pfk)的活性40.34％和52.63％。
[0164]
综上所述，在传统的hs培养基中添加petah是一种非常简单有效的方法，可以在不显著改变其特征的情况下提高bc产量。在hs培养基中添加1％最佳剂量的petah将木糖驹形氏杆菌(t.mepensis)的葡萄糖转化效率提高到29.22％，进而促进bc产量增加到4.91g/l，相当于增加了2.15倍。bc产量的显着提高是由于四种关键酶(pfk、pk、pgm和ugp)活性的调节。本发明提供的方法使用具有成本效益的petah作为营养添加剂可以提高bc产量。
[0165]
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
[0166]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种木糖驹形氏杆菌培养基，其特征在于，每升所述培养基中含有葡萄糖20g，酵母提取物5g，蛋白胨5g，一水柠檬酸1.15g，磷酸氢二钠2.7g，其余为聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液，ph值为6.5～7.0。2.如权利要求1所述的木糖驹形氏杆菌培养基，其特征在于，所述聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液的制备过程为将聚对苯二甲酸乙二醇酯整理成小块，然后加入0.4～0.8mol/l nh3·
h2o中进行水解，水解反应温度为160～180℃，反应时间25～30min，反应结束后，反应液中和至ph为6.5～7.5，得到聚对苯二甲酸乙二醇酯氨解液。3.一种利用权利要求1或2中所述的木糖驹形氏杆菌培养基制备细菌纤维素的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、木糖驹形氏杆菌的活化将木糖驹形氏杆菌原种接种于固体培养基上获得木糖驹形氏杆菌菌落；s2、木糖驹形氏杆菌的扩大培养将步骤s1得到的木糖驹形氏杆菌菌落接种于液体培养基上，获得木糖驹形氏杆菌种子液；s3、细菌纤维素发酵培养基的制备采用如权利要求1或2中所述的木糖驹形氏杆菌培养基；s4、细菌纤维素发酵液的制备将步骤s2得到的木糖驹形氏杆菌种子液，按照5％～15％的接种量将木糖驹形氏杆菌种子液接种至步骤s3得到的细菌纤维素发酵培养基中，在28～30℃下，发酵8～10d，得到细菌纤维素发酵液；s5、细菌纤维素的制备将步骤s4得到的细菌纤维素发酵液液面上层的细菌纤维素膜取出，先加入碳酸钠溶液中进行加热煮沸，后用水冲洗；再将细菌纤维素膜放入水中加热煮沸，最后冲洗得到纯净的细菌纤维素膜水洗到中性后，吸干水分，干燥至恒重，得到细菌纤维素。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤s1中，所述固体培养基中含有酵母提取物5～6g、蛋白胨5g、葡萄糖15～20g、一水柠檬酸1～1.15g、2.5～2.7g na2hpo4、琼脂15～18.0g和蒸馏水1.0l。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤s1中，所述液体培养基配中含有酵母提取物5～6g/l，蛋白胨4～5g/l，葡萄糖15～20g/l，一水柠檬酸1～1.15g/l，2.5～2.7g/lna2hpo4，ph值为6.5～7.0。6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤s5中，碳酸钠溶液的浓度为1-3％。7.如权利要求6所述的制备细菌纤维素的方法，其特征在于，步骤s5中，加热温度为80℃～100℃。8.一种采用如权利要求3-7中任一项所述的制备细菌纤维素的方法制得的细菌纤维素。9.如权利要求8所述的细菌纤维素，其特征在于，所述细菌纤维素的比表面积为33～37m2/g，平均孔径为19～29nm。
技术总结本发明提供了一种木糖驹形氏杆菌培养基及利用该培养基制备细菌纤维素的方法。该培养基是以HS培养基配方为基础，添加PET氨解液得到的，该氨解液作为促进剂有效将木糖驹形氏杆菌的纤维素产量提高2倍，通过调控纤维素合成相关酶类活性，如UDP-葡萄糖焦磷酸化酶和葡萄糖磷酸变位酶的活性提高，抑制葡萄糖分解途径相关酶类如丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的活性降低，进而提高细菌纤维素产量至4.91g/L。用该方法制备得到的细菌纤维素表现出较低的结晶度、较优的表面积和较大的孔径。本发明对于废弃的PET进行处理后作为发酵细菌纤维素的碳源，不仅解决了废弃PET的处理问题，而且降低了发酵生产成本，节约了资源，减少了环境污染。减少了环境污染。减少了环境污染。
技术研发人员：周建刚 王权 张艳波 徐凯 李永强 徐卫林
受保护的技术使用者：武汉纺织大学
技术研发日：2022.07.22
技术公布日：2022/11/1
