一种基于肠益生调控血糖稳态的桑叶益生元及其制备方法
【技术领域】
1.本发明涉及血糖调控的技术领域，特别是一种基于肠益生调控血糖稳态的桑叶益生元及其制备方法的技术领域。
背景技术：2.血糖紊乱是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，可能导致眼、肾、心脏、血管或神经的慢性损害和功能障碍，进而引起一系列的并发症。研究证实，肠道微生物与糖尿病发生发展存在显著相关性，因此调控肠道微生物成为控制血糖的重要手段之一(chen k,chen h,faas mm,haan b,li jh,et al.specific inulin-type fructan fibers protect against autoimmune diabetes by modulating gut immunity,barrier function,and microbiota homeostasis.molecular nutrition&food research,2017,61(8),1601006.)。膳食纤维和益生元等合理的饮食干预可通过调节肠道菌群使糖代谢紊乱得到改善，具有安全、经济和便捷的特点(glenn rg,robert h,mary es,susan lp,raylene ar,et al.expert consensus document:the international scientific association for probiotics and prebiotics(isapp)consensus statement on the definition and scope of prebiotics.nature reviews gastroenterology and hepatology,2017,14:491
–
502.)。桑叶是药食两用的中药材，在古代就被用来治疗消渴症(糖尿病)，且《本草纲目》明确记载有桑叶“煎之代茗，能止消渴”。现代药理学研究发现桑叶中的生物碱能够调节肠道微生物和维持血糖稳态(li y,ji d,zhong s,lin t,lv z,hu g,wang x.1-deoxynojirimycin inhibits glucose absorption and accelerates glucose metabolism in streptozotocin-induced diabetic mice.scientific reports,2013；3:1377；li y,zhong s,yu j,sun y,zhu j,ji d,wu c.the mulberry-derived 1-deoxynojirimycin(dnj)inhibits high-fat diet(hfd)-induced hypercholesteremia and modulates the gut microbiota in a gender-specific manner.journal of functional foods,2019；52:63
–
72.)，但是桑叶生物碱在体内半衰期短这一特点影响了其对血糖的持续控制效果，亟待解决。
技术实现要素：3.本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种基于肠益生调控血糖稳态的桑叶益生元及其制备方法，以桑叶生物碱和桑叶多糖为微粒核，以物理交联丝胶蛋白为缓释凝胶外膜，可利用药食两用活性物质桑叶生物碱与桑叶多糖的协同增效作用以及丝胶蛋白的缓释作用，共同实现桑叶益生元对血糖的持续控制效果，调控肠道菌群，维护糖尿病患者血糖稳态。
4.为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：
5.一种基于肠益生调控血糖稳态的桑叶益生元的制备方法，包括如下步骤：
6.a)制粒：将桑叶生物碱粉和桑叶多糖粉以1：0.5～4的重量比例均匀混合，加入溶
剂并搅拌成团状或糊状，再在先后经过烘干、研磨和过筛后，得到桑叶生物碱和多糖混合微粒；
7.b)制液：将浓度为50～100g/l的丝胶蛋白浓缩液和质量分数为2～5％为羟丙甲纤维素e50溶液以1：0.1～1的体积比例均匀混合，得到缓释凝胶包被液；
8.c)包被：将步骤a)中所制备的桑叶生物碱和多糖混合微粒以1：10～20的重量体积比投至步骤b)中所制备的缓释凝胶包被液内，搅拌成悬浊液并喷干，得到成品。
9.作为优选，在所述步骤a)中，桑叶生物碱粉的制备方式为先利用有机溶剂浸提桑叶粉，挥发除去浸提上清液内的有机溶剂，利用阳离子交换树脂进行吸附和洗脱，再干燥即得。
10.更进一步的，在所述步骤a)中，利用有机溶剂浸提桑叶粉具体为将桑叶粉以1：30～50的质量体积比投至50～70％的乙醇内，在40～60℃且超声功率为1000～1300w下提取4～6h。
11.再进一步的，在所述步骤a)中，桑叶粉的制备方式为采摘并切碎新鲜桑叶，室温静置1～4h，再自然晒干或利用烘箱于50～60℃下烘干，利用粉碎机再次粉碎并于30～80目下过筛，得到桑叶粉。
12.更进一步的，在所述步骤a)中，待浸提完成后，过滤去除滤渣并收集滤液，将滤液进行8000～10000rpm的离心并收集上清液，旋蒸上清液以去除酒精，利用酸型阳离子交换树脂吸附12～24h，先通过自来水对用酸型阳离子交换树脂进行冲洗去杂，再采用0.25～0.5mol/l的氨水洗脱酸型阳离子交换树脂并收集洗脱液，旋蒸洗脱液以去除氨水，浓缩至小体积后离心得上清液，再次对上清液进行如上吸附、洗脱和浓缩，然后冷冻或喷雾干燥即得。
13.作为优选，在所述步骤a)中，桑叶多糖粉的制备方式为先水提桑叶粉，过滤并浓缩提取液，醇沉浓缩液并利用透析膜进行分离，再干燥即得。
14.更进一步的，在所述步骤a)中，水提桑叶粉具体为在桑叶粉或提取完生物碱的桑叶粉残渣(按照原桑叶粉的重量)中加入料液比为1：30～50的水，煮沸提取4～6h。其中。桑叶粉的制备方式同上。
15.更进一步的，在所述步骤a)中，待水提完成后，过滤去除滤渣并收集滤液，将滤液进行8000～10000rpm的离心并收集上清液，将上清液浓缩至原有体积的1/5～1/10，缓慢加入浓缩液的2～4倍体积的乙醇，沉淀过夜后8000～1000r/min离心并倾出上清液，利用热水充分溶解沉淀，得到粗多糖溶液，利用10kda和100kda透析膜对粗多糖溶液进行分离，经旋转挥发浓缩至较小体积后，再冷冻干燥或喷雾干燥即得。
16.作为优选，在所述步骤a)中，所述桑叶多糖粉内的桑叶多糖的分子量介于10～100kda。
17.作为优选，在所述步骤a)中，在均匀混合的桑叶生物碱粉和桑叶多糖粉中，加入浓度为20～50％乙醇溶液并搅拌成团状或糊状，在60℃以下烘干后，利用研磨仪研磨，再过30～50目筛。
18.作为优选，在所述步骤b)中，丝胶蛋白浓缩液由丝胶蛋白粉溶于水中得到，所述丝胶蛋白粉的制备方式为先利用碱液溶解蚕茧壳，过滤并浓缩溶解液，利用透析膜进行分离，再干燥即可。
19.更进一步的，在所述步骤b)中，利用碱液溶解蚕茧壳具体为在蚕茧壳中加入料液比为1：40～100的质量分数为1～5％的碳酸钠溶液并加热煮沸1～3h，期间不断搅拌。其中，蚕茧壳为柞蚕茧壳或家蚕茧壳。
20.更进一步的，在所述步骤b)中，待溶解结束后，过滤去除滤渣并收集滤液，将滤液浓缩至原有体积的1/5～1/10，利用10kda透析膜对浓缩液进行分离，再冷冻干燥或喷雾干燥即得。
21.作为优选，在所述步骤b)中，所述丝胶蛋白浓缩液内的丝胶蛋白的分子量大于10kda。
22.作为优选，在所述步骤c)中，缓释凝胶包被液冷却至50～65℃。
23.作为优选，在所述步骤c)中，搅拌速度为800～1200r/min。
24.一种基于肠益生调控血糖稳态的桑叶益生元，由上述制备方法所制得。
25.本发明的有益效果：
26.本发明以药食两用植物部位桑叶和天然蚕丝为主要原料，先梯度分离提取桑叶生物碱以及具有抗氧化和降血糖等作用并可与桑叶生物碱共同发挥协同增效维护血糖稳态效果的桑叶多糖，再分离提取蚕茧内的具有吸水、凝胶化和可改性等物理特性的能够作为良好的功能性缓释基质的粘附性大分子丝胶蛋白，然后优化复配出桑叶内的桑叶生物碱和桑叶多糖的增效比例并制备成桑叶生物碱和多糖混合微粒，再将桑叶生物碱和多糖混合微粒包埋于由丝胶蛋白和羟丙甲纤维素物理交联形成的缓释凝胶外膜中，最终制成基于肠益生调控血糖稳态的桑叶益生元，与同类产品相比，具有高天然性和缓释作用，可调控肠道菌群，提高桑叶生物碱对血糖的持续控制效果，维护糖尿病患者血糖稳态。
27.本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。
【附图说明】
28.图1是本发明生产的基于肠益生调控血糖稳态的桑叶益生元对小鼠糖耐量的影响对比图；
29.图2是本发明生产的基于肠益生调控血糖稳态的桑叶益生元对小鼠肠道微生物多样性的影响。
30.图2中，a和b是对α多样性的影响，反应对物种丰富度的影响；c是对β多样性的影响，反应对菌群结构的影响。
【具体实施方式】
31.实施例一、制备基于肠益生调控血糖稳态的桑叶益生元：
32.一种基于肠益生调控血糖稳态的桑叶益生元的制备方法，包括如下步骤：
33.a)制粒：
34.a1)桑叶粉的准备：于每年5至10月采摘新鲜桑叶并切碎，室温静置1～4h以使桑叶的乳汁充分溢出，再自然晒干或利用烘箱于60℃下烘干，利用粉碎机再次粉碎并于30～80目下过筛，得到桑叶粉；
35.a2)桑叶生物碱粉的准备：将桑叶粉以1：30～50的质量体积比投至50～70％的乙醇内，在40～60℃且超声功率为1000～1300w下提取4～6h，待浸提完成后，过滤去除滤渣并
收集滤液，将滤液进行8000～10000rpm的离心并收集上清液，旋蒸上清液以去除酒精，利用酸型阳离子交换树脂吸附12～24h，先通过自来水对用酸型阳离子交换树脂进行冲洗去杂，再采用0.25～0.5mol/l的氨水洗脱酸型阳离子交换树脂并收集洗脱液，旋蒸洗脱液以去除氨水，浓缩至小体积后离心得上清液，再次对上清液进行如上吸附、洗脱和浓缩，然后冷冻或喷雾干燥，得到桑叶生物碱粉；
36.a3)桑叶多糖粉的准备：在步骤a1)中所制备的桑叶粉或提取完生物碱的桑叶粉残渣(按照原桑叶粉的重量)中加入料液比为1：30～50的水，煮沸提取4～6h，待水提完成后，过滤去除滤渣并收集滤液，将滤液进行8000～10000rpm的离心并收集上清液，将上清液浓缩至原有体积的1/5～1/10，缓慢加入浓缩液的3倍体积的乙醇，沉淀过夜后8000～1000r/min离心并倾出上清液，利用热水充分溶解沉淀，得到粗多糖溶液，利用10kda和100kda透析膜分离出粗多糖溶液内分子量介于10～100kda的桑叶多糖，经旋转挥发浓缩至较小体积后，再冷冻干燥或喷雾干燥，得到桑叶多糖粉；
37.a4)桑叶生物碱和多糖混合微粒的准备：将步骤a2)中所制备的桑叶生物碱粉和步骤a3)中所制备的桑叶多糖粉以1：0.5～4的重量比例均匀混合，加入浓度为20～50％乙醇溶液并搅拌成团状或糊状，在60℃以下烘干后，利用研磨仪研磨，再过40目筛，得到桑叶生物碱和多糖混合微粒；
38.b)制液：
39.b1)丝胶蛋白粉的准备：在蚕茧壳(柞蚕茧壳或家蚕茧壳)中加入料液比为1：40～100的质量分数为1～5％的碳酸钠溶液并加热煮沸2h，期间不断搅拌，过滤去除滤渣并收集滤液，将滤液浓缩至原有体积的1/5～1/10，利用10kda透析膜对分离出浓缩液内分子量大于10kda的丝胶蛋白，再冷冻干燥或喷雾干燥，得到丝胶蛋白粉；
40.b2)：丝胶蛋白浓缩液的准备：将步骤b1)中所制备的丝胶蛋白粉溶于热水中，制备出浓度为50～100g/l的丝胶蛋白浓缩液；
41.b3)羟丙甲纤维素e50溶液的准备：将羟丙甲纤维素e50溶于热水中，制备出质量分数为2～5％的羟丙甲纤维素e50溶液；
42.b4)缓释凝胶包被液的准备：将步骤b2)中所述制备的50～100g/l的丝胶蛋白浓缩液和步骤b3)中所制备的质量分数为2～5％为羟丙甲纤维素e50溶液以1：0.1～1的体积比例均匀混合，搅拌器内以1000r/min的速度快速搅拌，得到缓释凝胶包被液；
43.c)包被：将步骤a4)中所制备的桑叶生物碱和多糖混合微粒以1：10～20的重量体积比投至步骤b4)中所制备的冷却至50～65℃的缓释凝胶包被液内，800～1200r/min搅拌成悬浊液并喷干，得到成品。
44.实施例二、基于肠益生调控血糖稳态的桑叶益生元的体内评价试验：
45.实验动物及饲养条件：30只体重18～20g的清洁级雌性icr小鼠(杭州子源实验动物科技有限公司[生产许可证：scxk(浙)2019-0004])。屏障系统实验饲养室，温度：25
±
1℃；湿度：50～70％；光照：150～200lx，12h明暗交替；噪音《50db。饮水：自来水。饲养方式：自由饮食，小鼠饲养笼中给予充足的饲料和水，每笼饲养10只小鼠。
[0046]
试验设计及测定指标：小鼠随机分为3组，每组10只，对照组给予普通饲料，糖尿病模型组和益生元干预组给予高脂高糖饲料8周并最后1周以40mg/kg体重的剂量腹腔注射链脲佐菌素(stz)连续注射5天。益生元干预组每日灌胃200mg/kg体重的本工艺制备的桑叶益
生元，对照组和模型组灌胃等体积超纯水。8周后小鼠禁食不禁水12h后尾静脉取血，用onetouchr ultra血糖仪测定小鼠的空腹血糖值。不同组别灌胃给予超纯水或者本工艺制备的桑叶益生元30min过后各组即时口服给予0.3g/ml的蔗糖溶液(用生理盐水配制)0.1ml/10g，测定给糖后30min、60min和120min的血糖。取小鼠盲肠内容物对微生物进行16srrna基因测序分析。
[0047]
数据分析：用spss16软件进行统计分析，所有数据以均数
±
标准差标准差表示，应用t检验评价试验结果。
[0048]
结果显示本工艺制备的桑叶益生元显著改善了糖尿病小鼠的糖耐量(图1)，控制了餐后的血糖稳态，提高了糖尿病小鼠肠道微生物的多样性(图2)，促进糖尿病小鼠菌群结构趋于正常(图2)。以上结果表明本工艺生产的桑叶益生元能够调节糖尿病小鼠肠道菌群，控制血糖稳态。
[0049]
上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。
技术特征：1.一种基于肠益生调控血糖稳态的桑叶益生元的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：a)制粒：将桑叶生物碱粉和桑叶多糖粉以1：0.5～4的重量比例均匀混合，加入溶剂并搅拌成团状或糊状，再在先后经过烘干、研磨和过筛后，得到桑叶生物碱和多糖混合微粒；b)制液：将浓度为50～100g/l的丝胶蛋白浓缩液和质量分数为2～5％为羟丙甲纤维素e50溶液以1：0.1～1的体积比例均匀混合，得到缓释凝胶包被液；c)包被：将步骤a)中所制备的桑叶生物碱和多糖混合微粒以1：10～20的重量体积比投至步骤b)中所制备的缓释凝胶包被液内，搅拌成悬浊液并喷干，得到成品。2.如权利要求1所述的一种基于肠益生调控血糖稳态的桑叶益生元的制备方法，其特征在于：在所述步骤a)中，桑叶生物碱粉的制备方式为先利用有机溶剂浸提桑叶粉，挥发除去浸提上清液内的有机溶剂，利用阳离子交换树脂进行吸附和洗脱，再干燥即得。3.如权利要求2所述的一种基于肠益生调控血糖稳态的桑叶益生元的制备方法，其特征在于：在所述步骤a)中，利用有机溶剂浸提桑叶粉具体为将桑叶粉以1：30～50的质量体积比投至50～70％的乙醇内，在40～60℃且超声功率为1000～1300w下提取4～6h。4.如权利要求1所述的一种基于肠益生调控血糖稳态的桑叶益生元的制备方法，其特征在于：在所述步骤a)中，桑叶多糖粉的制备方式为先水提桑叶粉，过滤并浓缩提取液，醇沉浓缩液并利用透析膜进行分离，再干燥即得。5.如权利要求4所述的一种基于肠益生调控血糖稳态的桑叶益生元的制备方法，其特征在于：在所述步骤a)中，水提桑叶粉具体为在桑叶粉或提取完生物碱的桑叶粉残渣中加入料液比为1：30～50的水，煮沸提取4～6h。6.如权利要求1所述的一种基于肠益生调控血糖稳态的桑叶益生元的制备方法，其特征在于：在所述步骤a)中，所述桑叶多糖粉内的桑叶多糖的分子量介于10～100kda。7.如权利要求1所述的一种基于肠益生调控血糖稳态的桑叶益生元的制备方法，其特征在于：在所述步骤b)中，丝胶蛋白浓缩液由丝胶蛋白粉溶于水中得到，所述丝胶蛋白粉的制备方式为先利用碱液溶解蚕茧壳，过滤并浓缩溶解液，利用透析膜进行分离，再干燥即可。8.如权利要求7所述的一种基于肠益生调控血糖稳态的桑叶益生元的制备方法，其特征在于：在所述步骤b)中，利用碱液溶解蚕茧壳具体为在蚕茧壳中加入料液比为1：40～100的质量分数为1～5％的碳酸钠溶液并加热煮沸1～3h，期间不断搅拌。9.如权利要求1所述的一种基于肠益生调控血糖稳态的桑叶益生元的制备方法，其特征在于：在所述步骤b)中，所述丝胶蛋白浓缩液内的丝胶蛋白的分子量大于10kda。10.一种基于肠益生调控血糖稳态的桑叶益生元，由权利要求1至9中任一项所述的制备方法制得。
技术总结本发明公开了一种基于肠益生调控血糖稳态的桑叶益生元及其制备方法，包括a)制粒：将桑叶生物碱粉和桑叶多糖粉以1：0.5～4的重量比例均匀混合，加入溶剂并搅拌成团状或糊状，再在先后经过烘干、研磨和过筛后，得到桑叶生物碱和多糖混合微粒、b)制液：将浓度为50～100g/L的丝胶蛋白浓缩液和质量分数为2～5％为羟丙甲纤维素E50溶液以1：0.1～1的体积比例均匀混合，得到缓释凝胶包被液和c)包被：将步骤a)中所制备的桑叶生物碱和多糖混合微粒以1：10～20的重量体积比投至步骤b)中所制备的缓释凝胶包被液内，搅拌成悬浊液并喷干，得到成品。本申请可实现对血糖的持续控制效果，调控肠道菌群，维护糖尿病患者血糖稳态。维护糖尿病患者血糖稳态。维护糖尿病患者血糖稳态。
技术研发人员：孙雨晴 潘美良 钟石 霍进喜 李有贵 马焕艳 柳秦桥 费舒堂
受保护的技术使用者：浙江省农业技术推广中心（浙江省蚕种质量检验站） 湖州柳荫生物科技有限公司
技术研发日：2022.05.18
技术公布日：2022/11/1
