1.本发明属于食用天然色素生物制造领域，特别涉及一种提高紫红曲霉中红曲色素合成的发酵方法。
背景技术：2.红曲色素是由我国重要的传统药食两用微生物红曲霉菌(monascusspp.)产生的天然色素，其使用具有悠久的历史。作为食品添加剂，红曲色素广泛应用于食品加工和化妆品制造等领域；因其还具有广泛的生物活性例如抗氧化、抗突变、抑菌以及降低胆固醇改善血脂等，它在益生保健产品开发和医疗领域的应用也愈加受到重视。
3.红曲色素是一种混合色素，主要由红色素、黄色素和橙色素组成。关于红曲色素的生物合成，一般认为可能的过程是：聚酮合成酶首先催化乙酰coa和丙二酰coa生成己酮生色团，己酮生色团再与脂肪酸合成途径产生的中链脂肪酸通过转酯化反应生成橙色素，橙色素再分别通过加氨反应和还原作用形成红色素和黄色素。
4.研究表明，发酵培养基的成分对红曲色素的合成具有重要影响因素。优化培养基组分，筛选出能够显著促进红曲色素合成的功能因子，从而提高红曲色素的产量具有重要的应用价值。
技术实现要素：5.本发明的目的在于通过优化发酵培养基的组分，筛选出能够同时显著改变红曲色素中红色素、黄色素和橙色素合成代谢曲线并提高其合成量的添加剂，提供了一种提高紫红曲霉中红曲色素合成的发酵方法。
6.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
7.3-氨基-1,2,4-三唑(amitrole,3-amino-1,2,4-triazole，氨基三唑)作为发酵培养基红曲色素合成促进剂的用途，其能够改变紫红曲霉中红曲色素的合成代谢趋势，且红曲色素中红色素、黄色素和橙色素的合成同时提高。
8.本发明提供一种提高紫红曲霉中红曲色素合成量的发酵方法，在无氨基氮源发酵培养基中3-氨基-1,2,4-三唑。优选的，3-氨基-1,2,4-三唑的添加初始浓度为(0.1-7)g/l。更优选的，3-氨基-1,2,4-三唑的添加初始浓度为(1-7)g/l、(2-6)g/l、(3-7)g/l、(5-7)g/l。
9.优选的，发酵培养基中还添加组氨酸。组氨酸与3-氨基-1,2,4-三唑的添加总量为0.1-7g/l，其中3-氨基-1,2,4-三唑不低于2g/l。组氨酸添加量为1-6、2-5、3-4g/l。
10.另一方面，本发明提供一种提高紫红曲霉中红曲色素合成量的培养基，所述培养基为无氨基氮源发酵培养基，且在培养基中添加3-氨基-1,2,4-三唑。
11.发酵培养基包含以下成分：
12.3-氨基-1,2,4-三唑0.1-7g/l
13.组氨酸0～7g/l；且组氨酸与3-氨基-1,2,4-三唑的总量不超过7g/l。
14.优选的，发酵培养基包括以下成分
15.3-氨基-1,2,4-三唑(1-7)g/l
16.组氨酸(0-6)g/l；且组氨酸与3-氨基-1,2,4-三唑的总量不超过7g/l。
17.另一方面，本发明一种提高紫红曲霉中红曲色素合成的发酵方法，其特征在于，所述发酵方法包括以下步骤：
18.1)将紫红曲霉从斜面培养基接种到平板培养基上，30℃培养4～5天；
19.2)用接种环刮取适量新鲜菌丝体接种到液体种子培养基中，33℃、200rpm培养1～3天；
20.3)以体积百分比5％～15％的接种量将新鲜制备的种子液接种到上述的发酵方法或上述的发酵培养基中，33℃、200rpm培养6～14天。
21.斜面培养基的原料包括葡萄糖、麦芽浸粉、琼脂、酵母浸粉、蛋白胨、kh2po4、nano3和mgso4·
7h2o；所述平板培养基的原料包括麦芽浸粉、琼脂、葡萄糖和蛋白胨。
22.液体种子培养基的原料包括大米粉、蛋白胨、豆粕粉、kh2po4、nano3和mgso4·
7h2o。
23.进一步的，所述发酵培养基的原料及各原料的重量份数为：
[0024][0025]
本发明的发酵菌株为紫红曲霉rp2。
[0026]
本发明相比现有技术的有益效果为：
[0027]
相比现有技术中，通过添加不同氨基酸，调节不同色素合成量的发酵方式，本发明所述的提高紫红曲霉中红曲色素合成的发酵方法，仅需添加3-氨基-1,2,4-三唑(amitrole,3-amino-1,2,4-triazole)就能够显著改变红曲色素的合成代谢趋势，且显著提高红曲红色素、红曲黄色素和红曲橙色素的产量，操作简单方便，为红曲色素及其相关产品的制备提供了技术指导。
附图说明
[0028]
图1为添加和未添加组氨酸发酵过程中紫红曲霉中红色素、黄色素、橙色素合成曲
线图；
[0029]
图2为添加和未添加组氨酸及3-氨基-1,2,4-三唑(amitrole, 3-amino-1,2,4-triazole)的混合物发酵过程中紫红曲霉中红色素、黄色素、橙色素合成曲线图。
具体实施方式
[0030]
下面结合具体实施例对本发明的构思及产生的技术效果作进一步阐述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。
[0031]
实施例1培养基
[0032]
本实施例中分别制备以下各培养基，灭菌备用。
[0033]
(1)斜面培养基(1l)：葡萄糖20g，麦芽浸粉20g，琼脂20g，酵母浸粉4g，蛋白胨3g，kh2po
4 2g，nano
3 2g，mgso4·
7h2o 1g。
[0034]
(2)平板培养基(1l)：麦芽浸粉20g，琼脂20g，葡萄糖5g，蛋白胨1g。
[0035]
(3)液体种子培养基(1l)：大米粉40g，蛋白胨8g，豆粕粉5g，kh2po
4 2g， nano
3 2g，mgso4·
7h2o 1g。
[0036]
(4)无氨基氮源发酵培养基(1l)：葡萄糖20g，酵母无氨基氮源5g，mgso4·
7h2o 0.5g，k2hpo4·
3h2o 5g，kh2po
4 5g，cacl
2 0.1g，mnso4·
h2o 0.03g，feso4·
7h2o 0.01g，znso4·
7h2o 0.01g。
[0037]
实施例2色价评定方法
[0038]
色价是表示色素合成量的指标，色价越高表明色素合成越多。本发明中色价的测定采用国标法(gb-t 5009.150-2003)：取发酵液5ml，加入70％乙醇定容至50ml，于 60℃水浴萃取1h后，4000rpm离心15min，取上清液，用70％乙醇进行适当稀释，分别在505nm、470nm和410nm下测定od值。
[0039]
红色素色价(u/ml)＝od 505nm
×
稀释倍数；
[0040]
橙色素色价(u/ml)＝od 470nm
×
稀释倍数；
[0041]
黄色素色价(u/ml)＝od 410nm
×
稀释倍数。
[0042]
实施例3紫红曲霉rp2的培养和色素合成测定
[0043]
紫红曲霉rp2为高色素产量菌株，参见cn107190026a。选用该菌株检测不同氨基酸组合对于色素产量的影响。
[0044]
培养方法包括以下步骤：
[0045]
1)将紫红曲霉rp2从斜面培养基接种到平板培养基上，30℃培养4～5天；
[0046]
2)用接种环刮取适量新鲜菌丝体接种到液体种子培养基中，33℃、200rpm培养2 天；
[0047]
3)以体积百分比10％的接种量将新鲜制备的种子液接种到无氨基氮源发酵培养基中，33℃、200rpm培养14天，从第4天开始每隔2天取样测定色素合成量。
[0048]
依据不同发酵时间，取发酵液，按照实施例2中的色价评价方法进行评价。
[0049]
实施例4培养基中组氨酸的添加对色素合成的影响
[0050]
如实施例3中的紫红曲霉rp2培养方法，在无氨基氮源发酵培养基中添加0g/l、 1g/l、3g/l、5g/l、7g/l、9g/l组氨酸，并依据实施例3的方法发酵培养、取样检测。
[0051]
结果参见表1-3，图1，如下：
[0052]
表1添加组氨酸对紫红曲霉红色素合成的影响
[0053][0054]
表2添加组氨酸对紫红曲霉黄色素合成的影响
[0055][0056]
表3添加组氨酸对紫红曲霉橙色素合成的影响
[0057][0058]
如图1及表1-3所示，组氨酸添加量为7g/l发酵至第6天，色素合成达到峰值，红色素的产量达到109.7u/ml，黄色素的产量达到73.7u/ml，橙色素的产量达到67.2 u/ml。
[0059]
实施例5培养基中amitrole的添加对色素合成的影响
[0060]
如实施例3中的紫红曲霉rp2培养方法，在无氨基氮源发酵培养基中添加不同浓度的amitrole，以及不同浓度的amitrole与组氨酸添加混合，并依据实施例3的方法发酵培养、取样检测，观察其对色素合成的影响。结果参见表4-6，图2，如下：
[0061]
本实施例中氨基酸组合的添加分别为组氨酸7g/l、ami 7g/l、组氨酸5g/l+ami2g/l、组氨酸2g/l+ami5g/l；其中ami为amitrole(3-氨基-1,2,4-三唑、3-amino-1,2,4-triazole、氨基三唑)
[0062]
表4添加组氨酸+ami组合对紫红曲霉红色素合成的影响
[0063]
[0064]
表5添加组氨酸+ami组合对紫红曲霉黄色素合成的影响
[0065][0066]
表6添加组氨酸+ami组合对紫红曲霉橙色素合成的影响
[0067][0068]
如图2及表4-6所示，组氨酸能够极大的提升紫红曲霉中红色素、黄色素和橙色素的合成，而ami可能不能被微生物作为营养物质利用，因而在添加培养的初期，不利于紫红曲霉rp2的生长，从而影响红曲色素的生成。
[0069]
但是预想不到的是，ami的添加与组氨酸不同。组氨酸可能作为色素的合成原料在培养中逐步被消耗，参见表4-6的his-7g/l组，以及表1-3的his-7g/l组，图1，组氨酸添加到培养基中，色素合成量形成先上升后下降的趋势。而ami虽然在平行实验中，培养4天的色素合成量不如对照组及组氨酸添加组，但随着培养时间的延长，色素产量不断升高，在培养10天后最终的色素产量反而能够超过组氨酸组的最大值。我们认为 ami是以类似催化剂或非消耗方式参与了色素合成的生物学途径，但具体的合成机理尚不清楚。但可以肯定的是，由于ami的添加，改变了培养中紫红曲霉体内的色素合成方式，使得色素产量的合成曲线由通常的钟型线转变为不断增长的类似斜线。
[0070]
在添加量为ami7g/l时，随着发酵时间延长，红色素、黄色素及橙色素的合成呈现直线上升趋势，产量进一步持续增加。至第10天，红色素的产量达到124.6u/ml、黄色素的产量达到77.9u/ml，橙色素的产量达到83.6u/ml。
[0071]
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但是本发明不限于上述实施例，在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
技术特征：1.一种提高紫红曲霉中红曲色素合成量的发酵方法，其特征在于，在无氨基氮源发酵培养基中3-氨基-1,2,4-三唑。2.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，3-氨基-1,2,4-三唑的添加初始浓度为0.1-7g/l。3.如权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，发酵培养基中还添加组氨酸。4.如权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，组氨酸与3-氨基-1,2,4-三唑的添加总量为0.1-7g/l，其中3-氨基-1,2,4-三唑不低于2g/l。5.一种提高紫红曲霉中红曲色素合成量的培养基，其特征在于，所述培养基为无氨基氮源发酵培养基，且在培养基中添加3-氨基-1,2,4-三唑。6.根据权利要求5所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基包含以下成分：3-氨基-1,2,4-三唑0.1-7g/l组氨酸0～7g/l；且组氨酸与3-氨基-1,2,4-三唑的总量不超过7g/l。7.根据权利要求6所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基包括以下成分3-氨基-1,2,4-三唑(1-7)g/l组氨酸(0-6)g/l；且组氨酸与3-氨基-1,2,4-三唑的总量不超过7g/l。8.一种提高紫红曲霉中红曲色素合成的发酵方法，其特征在于，所述发酵方法包括以下步骤：1)将紫红曲霉从斜面培养基接种到平板培养基上，30℃培养4～5天；2)用接种环刮取适量新鲜菌丝体接种到液体种子培养基中，33℃、200rpm培养1～3天；3)以体积百分比5％～15％的接种量将新鲜制备的种子液接种到如权利要求1-4任一所述的发酵方法或权利要求5-7的发酵培养基中，33℃、200rpm培养6～14天。9.根据权利要求8所述的发酵方法，其特征在于，步骤1)中所述斜面培养基的原料包括葡萄糖、麦芽浸粉、琼脂、酵母浸粉、蛋白胨、kh2po4、nano3和mgso4·
7h2o；所述平板培养基的原料包括麦芽浸粉、琼脂、葡萄糖和蛋白胨。10.根据权利要求8所述的发酵方法，其特征在于，步骤2)中所述液体种子培养基的原料包括大米粉、蛋白胨、豆粕粉、kh2po4、nano3和mgso4·
7h2o。
技术总结本发明提供了一种改变紫红曲霉中红曲色素合成代谢模式并提高合成量的发酵方法，通过向无氨基氮源发酵培养基中添加适量的3-氨基-1,2,4-三唑(Amitrole,3-amino-1,2,4-triazole，氨基三唑)，接种紫红曲霉进行发酵，能够促进紫红曲霉中红曲色素的合成，并且，所述红曲色素中的红色素、黄色素和橙色素的合成曲线发生明显变化，呈现直线上升趋势，三种色素的合成量同时显著提高。素的合成量同时显著提高。素的合成量同时显著提高。
技术研发人员：尹胜 李钰婕 徐绎涵 朱绎赢 王琦
受保护的技术使用者：北京工商大学
技术研发日：2022.07.12
技术公布日：2022/11/1
