p.877-885或海藻孔石莼(production of bioflavor by regeneration from protoplasts of ulvapertusa(ulvales，chlorophyta)hydrobiologia，1990，vol.204，pp 143-149)。据文献记载，醛类8z-十七碳烯醛、8z，11z-十七碳二烯醛、8z，11z，14z-十七碳三烯醛的含量为2％、19.9％和26.1％。
7.8z，11z-十七碳二烯醛的气味被描述为藻类的典型气味(production of bioflavor by regeneration from protoplasts of ulva pertusa(ulvales，chlorophyta)，hydrobiologia，1990，vol.204，pp 143-149)。
8.与此相对，还未有关于4z，7z，10z，13z-十九四烯，4z，7z，10z，13z，16z-十九碳十五烯醛，或3，6，9，12，15，18-二十碳六烯酸的味道的相关记载。
9.已知8z-十五碳烯醛是黄瓜的天然成分(kemp，a c15 aldehyde from cucumis sativus，phytochemistry，volume 16，issue 11，1977，pages 1831-1832)。8z-十五碳烯醛的风味主要被描述为油味，并且还被描述为具有可以增强鸡肉和烤牛肉风味的特性。此外，现已有使用1-壬烯和6-溴-1-己醇为原料的生产方法，但是根据ec 1334/2008(jp 2014043409)，这类方法不属于天然生产方法。
10.还未知4z，7z，10z，13z-十九四烯的味道，直到现在也没有相关生产方法。
11.如wo2012025629 a1中所述，能以脂肪酸为原料通过植物酶辅助的α-氧化过程生产不同种类的醛。在现有方法中，还使用藻类生物量生产不饱和醛。
12.现有技术中，还有其他通过酶促裂解使用相应的油或脂肪生产脂肪酸的其它方法。细菌脂肪酶，诸如来自黑曲霉、米根霉、卡门柏青霉、爪哇毛霉、娄地青霉、猪胰、皱褶假丝酵母、米黑根毛霉、南极假丝酵母或戴尔根霉的酶主要用于该目的(industrial applications of microbial lipases，enzyme and microbial technology volume 39，issue 2，26 june 2006，pages 235-251)。
13.因此，本发明的目的是提供一种生产醛或醛混合物的方法，根据ec 1334/2008，该方法可归类为天然生产方法。此外，本发明的一个目的是通过选择性调谐酶促代谢步骤提供一种整合的生物技术方法，该方法可以在没有中间体化学步骤的情况下以高产率和高纯度提供目标产物。
技术实现要素：14.为此，根据主要方面，本发明涉及提供一种使用至少一种α-双加氧酶和至少一种醛脱氢酶生产饱和和不饱和醛的方法。
15.此外，根据一个实施例，本发明涉及一种生产饱和和不饱和醛及其混合物的发酵方法。在根据本发明的方法的另一个实施例中，提供了一种酶催化方法。
16.在另一个实施例中，根据本发明的方法涉及生物技术、天然或化学来源的反应物(离析物)的使用。
17.在又一个实施例中，根据本发明的方法涉及选自由羧酸和用醇酯化的羧酸组成的组的优选反应物。
18.此外，根据本发明的方法涉及优选的产物混合物、该方法中使用的微生物以及优选使用的酶的氨基酸序列和编码待使用的酶的核苷酸序列或核酸片段。
19.本发明的另一方面涉及提供一种编码根据本发明使用的酶的载体系统。
20.本发明的另一方面涉及一种通过根据本发明的方法获得的组合物。
附图说明
21.图1：具有编码α-双加氧酶的基因的质粒pet28a_osadox。
22.图2：具有编码醛脱氢酶的基因的质粒pet-duet_vhfaldh。
23.图3：具有编码醛脱氢酶和nadh氧化酶的基因的质粒pet-duet_lsnox_vhfaldh。
24.图4：将油酸和亚油酸的混合物生物催化转化为包含8，11-十七碳二烯醛和7，10-十六碳二烯醛的醛混合物。
25.图5：在1小时内通过α-双加氧酶、醛脱氢酶和nadh氧化酶将油酸和亚油酸的混合物生物催化转化为相应的醛混合物的时间过程。
26.图6：在24小时内通过α-双加氧酶和醛脱氢酶，不含nadh氧化酶，将油酸和亚油酸的混合物生物催化转化为相应的醛混合物的时间过程。
27.图7：在24小时内通过α-双加氧酶和醛脱氢酶，含nadh氧化酶，将油酸和亚油酸的混合物生物催化转化为相应的醛混合物的延长的时间过程。
28.序列的简要描述
29.seq id no 1：编码水稻的os-α-dox酶的核酸序列。
30.seq id no 2：编码哈维氏弧菌的vhfaldh酶的核酸序列。
31.seq id no 3：编码哈维氏弧菌的vhfaldh酶的175q突变体的核酸序列。
32.seq id no 4：编码三叉乳酸杆菌的酶lsnox的核酸序列。
33.seq id no 5：编码红串红球菌upv-1的realdh酶的核酸序列。
34.seq id no 6：编码嗜热脱氮地芽孢杆菌的gtaldh酶的核酸序列。
35.seq id no 7：编码水油海杆菌属vt8的一种醛脱氢酶maqu3410酶的核酸序列。
36.seq id no 8：编码水稻的os-α-dox酶的氨基酸序列。
37.seq id no 9：编码哈维氏弧菌的vhfaldh酶的氨基酸序列。
38.seq id no 10：编码哈维氏弧菌的vhfaldh酶的175q突变体的氨基酸序列。
39.seq id no 11：编码三叉乳酸杆菌的lsnox酶的氨基酸序列。
40.seq id no 12：编码红串红球菌upv-1的realdh酶的氨基酸序列。
41.seq id no 13：编码嗜热脱氮地芽孢杆菌的gtaldh酶的氨基酸序列。
42.seq id no 14：编码水油海杆菌属vt8的一种醛脱氢酶maqu3410酶的氨基酸序列。
43.seq id no 15：编码正向引物的核酸序列。
44.seq id no 16：编码反向引物的核酸序列。
45.seq id no 17：编码拟南芥的at-α-dox2酶的核酸序列。
46.seq id no 18：编码拟南芥的at-α-dox酶的核酸序列。
47.seq id no 19：编码辣椒的caadox酶的核酸序列。
48.seq id no 20：编码甜菜生尾孢菌的cbadox酶的核酸序列。
49.seq id no 21：编码黄瓜的csadox2酶的核酸序列。
50.seq id no 22：编码黄瓜的csadox酶的核酸序列。
51.seq id no 23：编码黄瓜的csadoxlike1酶的核酸序列。
52.seq id no 24：编码番茄的le-α-dox1酶的核酸序列。
53.seq id no 25：编码番茄的le-α-dox2酶的核酸序列。
54.seq id no 26：编码烟草的naadox2酶的核酸序列。
55.seq id no 27：编码烟草的na-α-dox酶的核酸序列。
56.seq id no 28：编码烟草的nt-α-dox酶的核酸序列。
57.seq id no 29：编码小立碗藓的ppadox酶的核酸序列。
58.seq id no 30：编码豌豆ps-α-dox酶的核酸序列。
59.seq id no 31：编码番茄的sladox2酶的核酸序列。
60.seq id no 32：编码番茄的stadox1.1酶的核酸序列。
61.seq id no 33：编码番茄的stadox1.2酶的核酸序列。
62.seq id no 34：编码番茄的stadox1.3酶的核酸序列。
63.seq id no 35：编码马铃薯的stadox1酶的核酸序列。
64.seq id no 36：编码马铃薯的stadox2酶的核酸序列。
65.seq id no 37：编码拟南芥的at-α-dox2酶的氨基酸序列。
66.seq id no 38：编码拟南芥的at-α-dox酶的氨基酸序列。
67.seq id no 39：编码辣椒的caadox酶的氨基酸序列。
68.seq id no 40：编码甜菜生尾孢菌的cbadox酶的氨基酸序列。
69.seq id no 41：编码黄瓜的csadox2酶的氨基酸序列。
70.seq id no 42：编码黄瓜的csadox酶的氨基酸序列。
71.seq id no 43：编码黄瓜的csadoxlike1酶的氨基酸序列。
72.seq id no 44：编码番茄的le-α-dox1酶的氨基酸序列。
73.seq id no 45：编码番茄的le-α-dox2酶的氨基酸序列。
74.seq id no 46：编码烟草的naadox2酶的氨基酸序列。
75.seq id no 47：编码烟草的na-α-dox酶的氨基酸序列。
76.seq id no 48：编码烟草的nt-α-dox酶的氨基酸序列。
77.seq id no 49：编码小立碗藓的ppadox酶的氨基酸序列。
78.seq id no 50：编码豌豆ps-α-dox酶的氨基酸序列。
79.seq id no 51：编码番茄的sladox2酶的氨基酸序列。
80.seq id no 52：编码番茄的stadox1.1酶的氨基酸序列。
81.seq id no 53：编码番茄的stadox1.2酶的氨基酸序列。
82.seq id no 54：编码番茄的stadox1.3酶的氨基酸序列。
83.seq id no 55：编码马铃薯的stadox1酶的氨基酸序列。
84.seq id no 56：编码马铃薯的stadox2酶的氨基酸序列。
85.seq id no 57：编码不动杆菌属的菌株m1的ald1酶的核酸序列。
86.seq id no 58：编码解脂耶氏酵母的一种醛脱氢酶的hfd4酶的核酸序列。
87.seq id no 59：编码不动杆菌属的菌株m1的ald1酶的氨基酸序列。
88.seq id no 60：编码解脂耶氏酵母的一种醛脱氢酶的hfd4酶的氨基酸序列。
89.seq id no 61：编码三叉乳酸杆菌的nad(p)h氧化酶的核酸序列。
90.seq id no 62：编码三叉乳酸杆菌的nad(p)h氧化酶的氨基酸序列。
91.seq id no 63：编码短乳杆菌的nadh氧化酶的核酸序列。
92.seq id no 64：编码短乳杆菌的nadh氧化酶的氨基酸序列。
93.定义
94.本文使用的术语载体系统是指由至少一个或多个载体或质粒载体组成或含有至少一个或多个载体或质粒载体的系统。因此，载体系统可以包含编码多个不同靶基因的(质粒)载体。载体系统可以进一步包含多个(质粒)载体，其继而包含至少一个根据本发明的靶基因。因此，载体系统可以只包含一个(质粒)载体构建体或多个(质粒)载体构建体，多个(质粒)载体构建体可以同时或依次稳定或瞬时转化到相应的重组宿主生物中，使得由单个构建体编码的靶基因可以被宿主生物转录和转译。
95.术语氨基酸、蛋白质和多肽在本文中可互换使用。本文公开的氨基酸或其功能部分在正确折叠后具有酶功能。因此，术语酶在本文中也可与术语氨基酸互换使用。
96.每当本公开参考百分比形式的核酸或蛋白质序列的序列同源性或序列同一性时，该参考是指可以分别使用核酸序列的emboss water双序列比对(核苷酸)(http：//www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_water/nucleotide.html)和氨基酸序列的emboss water双序列比对(蛋白质)(http：//www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_water/)计算的值。由欧洲分子生物学实验室(embl)欧洲生物信息学研究所(ebi)提供的局部序列比对工具使用了改进的史密斯-沃特曼算法(参见http：//www.ebi.ac.uk/tools/psa/和smith，t.f.&waterman，m.s.
″
identification of common molecular subsequences
″
journal of molecular biology，1981 147(1)：195-197)。此外，在本文中，当使用改进的史密斯-沃特曼算法分别进行两个序列的成对比对时，参考目前由embl-ebi给出的默认参数。其中，(i)对于氨基酸序列：矩阵＝blosum62，空位开放罚分＝10，空位扩展罚分＝0.5，和(ii)对于核酸序列：矩阵＝dnafull，空位开放罚分＝10，空位扩展罚分＝0.5。
97.对本领域技术人员而言，众所周知的是根据本发明公开内容的由核酸编码的重组微生物或真菌或蛋白质或酶的生长和培养、分离和纯化。
98.因为本文公开的基因产物的酶功能不变，术语蛋白质、多肽和酶可互换使用。同样，出于本发明的目的，术语基因和核酸(片段)可互换使用。
99.根据本发明用于表达所需靶蛋白的核酸、核苷酸序列或核酸片段(这些术语可互换地用于编码功能酶或其功能区的dna序列)可以选择地进行密码子优化，即基因的密码子使用适于选为表达菌株的重组微生物或真菌的密码子使用。对本领域技术人员而言，众所周知的是，可以修饰编码目标蛋白质的所需靶基因，而不改变转译的蛋白质序列，以适应特定的基于物种的密码子使用。因此，待转化的本发明的核酸可以具体适应大肠杆菌或另一种细菌以及酵母属或者另一种酵母的密码子使用。
100.所公开的羧酸可以以其游离形式或酯化成醇的形式存在，例如作为脂质的组分存在。
101.当在本文中针对命名的化合物没有具体指出(z)/(e)异构体的构型时，表示包括相应化合物的所有可能的构型异构体或其混合物。应该注意的是，本文提到的某些酶能够识别并转化目标化合物的两种异构体。
具体实施方式
102.本发明的问题主要通过提供一种用于生产至少一种不饱和醛及其相应的羧酸和/
或至少一种饱和醛及其相应的羧酸的生物技术方法解决。该方法包括：提供至少一种α-双加氧酶和至少一种醛脱氢酶。
103.与所用的反应物相比，得到的醛总是被缩短一个碳原子。在本发明的上下文中，饱和醛是指没有双键的醛，而不饱和醛是指存在双键的醛。在这种情况下，相应的羧酸是与所获得的醛具有相同链长和相同饱和度的化合物，但是带有至少一个羧基。根据本发明使用的至少一种α-双加氧酶催化链长为c6-c22的羧酸在α碳原子上的氧化，从而形成对应于羧酸并缩短了一个碳原子的醛。
104.由于其底物特异性，所用的至少一种醛脱氢酶催化醛的氧化成相应的羧酸，该羧酸继而可以用α-双加氧酶进一步转化成缩短了一个碳原子的醛。因此，本发明的方法可用于选择性生产具有不同链长醛的醛混合物。
105.在根据本发明的方法的一个实施例中，α-氧化和醛氧化可以同时进行，而在另一个实施例中，α-氧化可以首先进行，然后进行醛氧化，由此反应循环可以在两个实施例中持续进行，直到获得所需的产物。
106.在根据本发明的方法的一个优选实施例中，所述生物技术生产方法可以是发酵方法，包括以下步骤：
107.i.提供至少一种含有核酸片段的重组微生物或真菌，所述核酸片段包含至少一种编码α-双加氧酶的基因和/或至少一种编码醛脱氢酶的基因；
108.ii.在允许相应表达产物表达的条件下培养所述至少一种重组微生物；
109.iii.向所述至少一种培养的重组微生物中加入至少一种羧酸或至少一种用醇酯化的羧酸；
110.iv.通过使所述至少一种α-双加氧酶和所述至少一种醛脱氢酶与步骤iii的所述至少一种羧酸或所述酯化成醇的羧酸反应，获得至少一种不饱和醛及其相应的羧酸和/或至少一种饱和醛及其相应的羧酸。
111.在本发明的上下文中，发酵方法是指在至少一个步骤中培养重组微生物的方法，该重组微生物表达生产本发明产物所需的至少一种α-双加氧酶和至少一种醛脱氢酶。本文中的表达产物是至少一种α-双加氧酶和/或至少一种醛脱氢酶。因此，根据一个实施例，所述反应物的反应可以通过将酶分泌到所述反应物存在的反应混合物中进行，而根据另一个实施例，该反应可以在至少一种微生物的胞质溶胶中进行，并且可以随后分泌产物。
112.在本发明的上下文中，“提供”意为涉及使反应物、酶等可用的主动步骤。根据一个实施例，提供可以始终是一个技术步骤，诸如克隆一种反应生物或产生一种反应物。
113.在根据本发明的方法的另一个优选实施例中，所述生物技术生产方法可以是包括以下步骤的酶催化方法：
114.i.提供至少一种α-双加氧酶和至少一种醛脱氢酶，其中，所述至少一种α-双加氧酶和/或所述至少一种醛脱氢酶可以通过天然、化学或生物技术生产；
115.ii.向步骤i中所提供的酶中加入至少一种羧酸或至少一种用醇酯化的羧酸；
116.iii.通过使所述至少一种α-双加氧酶和所述至少一种醛脱氢酶与步骤ii的所述至少一种羧酸或所述酯化成醇的羧酸反应，获得至少一种不饱和醛及其相应的羧酸和/或至少一种饱和醛及其相应的羧酸。
117.在本发明的上下文中，酶催化方法表示其中至少一种α-双加氧酶和至少一种醛脱
氢酶可以在微生物外纯化或部分纯化的方法。在一个实施例中，这两种酶可以作为细胞裂解物存在，即表示不能再培养并且已经被物理、化学或酶催化方法消化的微生物的状态。在另一个实施例中，所述酶可以以＞80％的纯度存在，并已经通过本领域技术人员熟悉的纯化方法纯化。在又一实施例中，所述酶可以以＜80％的纯度存在，已经通过本领域技术人员已知的纯化方法部分纯化。在又一个实施例中，所述酶可以通过蛋白质合成获得且可选地被纯化。
118.生物技术来源的反应物(原料)是通过微生物发酵产生的反应物，其中天然来源的反应物可以从天然来源获得，例如植物、真菌、动物、微生物或土壤。化学来源的反应物可以由该反应物的前体通过化学合成产生。
119.在另一个优选实施例中，根据本发明的方法的至少一种反应物可以是生物技术、天然或化学来源的反应物。以上内容适用于生物技术、天然或化学来源的反应物。
120.根据本发明方法的另一个优选实施例，所述反应物可以选自由羧酸和用醇酯化的羧酸组成的组。优选的反应物选自由棕榈油酸、花生四烯酸、α-亚麻酸、亚油酸、γ-亚麻酸、油酸、石榴酸、α-桐酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、岩芹酸、大风子油酸、α-甘草酸、橄榄油、菜籽油、澳洲坚果油、沙棘果油、桐油、鱼油、琉璃苣油、大风子油、欧芹油、奥气油、石榴籽油、椰子油、向日葵油、散石籽油和葡萄籽油组成的组，以及从独立选自由耳霉属、小火菇属、层孔菌属、灵芝属、被孢霉属、扇菇属、侧耳属、小脆柄菇属、韧革菌属和伞状霉属的属中获得的微生物油。
121.在另一个优选实施例中，根据本发明的方法的产物可以是至少一种饱和醛及其相应的羧酸和/或至少一种不饱和醛及其相应的羧酸。在该实施例中，根据本发明的方法的产物可以优选地选自由7z，10z-十六碳二烯醛、8z，11z-十七碳二烯醛、6e，9e-十五碳二烯醛、7z-十六碳烯醛、8z-十五碳烯醛、7z-十四碳烯醛、8z，11z，14z-十七碳三烯醛、7z，10z，13z-十六碳三烯醛、4z，7z，10z，13z-十九四烯、8z，10e，12e-十七碳三烯醛、8z，10e，12z-十七碳三烯醛、7z，9e，11z-十六碳三烯醛、7z，9e，11e-十六碳三烯醛、9-癸烯醛、10-十一烯醛、3z-癸烯醛、4z-十一烯醛、7z-十二烯醛、8z-十三烯醛、7z-十四碳烯醛、8z-十五碳烯醛、9z-十四碳烯醛、10z-十五碳烯醛、7z-十五碳烯醛、8z-十六碳烯醛、9z-十六碳烯醛、10z-十七碳烯醛、5z，8z-十四碳二烯醛、6z，9z-十五碳二烯醛、7z，10z-十四碳二烯醛、8z，11z-十五碳二烯醛、7z，9e-十六碳二烯醛、8z，10e-十七碳二烯醛、8e，10z-十六碳二烯醛、9e，11z-十七碳二烯醛、9-甲基十一醛、10-甲基十一醛、10-甲基十二醛、11-甲基十二醛、11-甲基十三醛、12-甲基十三醛，12-甲基十四醛、13-甲基十四醛和13-甲基十五烷醛组成的组。
122.在本发明的上下文中，相对于(z)/(e)构型，没有具体指出双键位置的所有化合物包括所有可能位置的双键和相关化合物的混合物。
123.根据本发明的方法的另一个实施例，所述至少一种重组微生物可以选自由优选为大肠杆菌bl21、大肠杆菌mg1655、大肠杆菌w3110及其衍生物的大肠杆菌、优选为衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌及其衍生物的芽孢杆菌属、优选为酿酒酵母及其衍生物的酵母属、优选为法夫驹形氏酵母和多形汉逊酵母及其衍生物的汉逊酵母属或毕赤酵母属、以及优选为乳酸克鲁维酵母的克鲁维酵母属组成的组。
124.根据一个优选实施例，可以另外提供至少一种nadh氧化酶和/或至少一种脂肪酶。
125.nadh氧化酶由于其底物特异性和区域选择性能够催化醛的氧化。在根据本发明的
方法的一个优选实施例中，这些酶可用作额外的酶，通过再循环相应的辅因子使紧密协同的方法更加有效。
126.在本发明的方法的另一个优选实施例中，所述至少一种nadh氧化酶可以包含一个氨基酸序列，其中，所述氨基酸序列独立选自由seq id no：62和64组成的组，或为与seq id no：62和64具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一个实施例中，编码所述nadh氧化酶的氨基酸序列由选自由seq id no：61和62组成的组的核酸序列，或与seq id no：61和62具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列编码。
127.此外，根据本发明的不同方面和实施例，催化根据本发明的反应的酶可以是其衍生的特定酶的催化活性结构域或片段。
128.在另一个优选实施例中，所述至少一种脂肪酶可以是选自由南极假丝酵母、黑曲霉、米根霉、卡门柏青霉、爪哇毛霉、娄地青霉、猪胰、皱褶假丝酵母、米黑根毛霉或戴尔根霉组成的组的商业脂肪酶。
129.在本发明的方法的又一个优选实施例中，所述α-双加氧酶可以包含一个氨基酸序列，该氨基酸序列选自由seq id no：8、11、37、38、39、40、41、43、44、45、46、47、48、50、51、52、53、54、55或56组成的组，或为与seq id no：8、11、37、38、39、40、41、43、44、45、46、47、48、50、51、52、53、54、55或56具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
130.在另一个优选实施例中，所述醛脱氢酶可以包含或由一个氨基酸序列构成，其中，所述氨基酸序列选自由seq id no：9、10、12、13、14、59或60组成的组，或为与seq id no：9、10、12、13、14、59或60具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
131.本发明的另一个实施例可以涉及编码多肽的核酸序列或其片段，所述多肽具有用于纯化、分泌、检测或定位至少一种α-双加氧酶和/或至少一种醛脱氢酶和/或至少一种脂肪酶和/或至少一种nadh氧化酶的酶功能。这些核酸片段也被称为标签序列，并且可以在编码至少一种α-双加氧酶和/或至少一种醛脱氢酶的核酸片段之前(n端)和/或之后(c端)。优选的标签序列选自以下所列：组氨酸(his)标签、谷胱甘肽s-转移酶(gst)标签、硫氧还蛋白标签、flag标签、绿色荧光蛋白(gfp)标签、链霉亲和素标签、麦芽糖结合蛋白(mbp)标签、叶绿体转运肽、线粒体转运肽和/或分泌标签。此外，技术人员知道作为生产菌株的目标微生物或真菌的许多其他合适的标签序列，其中这些标签序列允许目标多肽直接分泌到培养上清液中，这有利于在一些实施例中促进获得和可选地纯化目标多肽。
132.在本发明的另一方面，本发明涉及一种载体系统，优选地为质粒载体系统，包括至少一种载体或质粒载体，所述载体或质粒载体包含含有编码α-双加氧酶的至少一个基因的核酸片段(a)，和含有编码醛脱氢酶的至少一个基因的核酸片段(b)；并且，可选地包含含有编码nadh氧化酶的至少一个基因的所述核酸片段(a)和/或所述核酸片段(b)的部分和/或包含编码脂肪酶的至少一个基因的核酸片段，其中，所述核酸片段(a)和/或所述核酸片段(b)在同一载体上或者在两个或多个独立的载体上提供。
133.根据一个优选实施例，所述载体系统可以编码至少一种多肽的表达，其中，所述多肽选自由seq id no：8、9、10、11、12、13、14、37、38、39、40、41、43、44、45、46、47、48、50、51、
52、53、54、55、56、59或60组成的组，或为与seq id no：8、9、10、11、12、13、14、37、38、39、40、41、43、44、45、46、47、48、50、51、52、53、54、55、56、59或60具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
134.在另一方面，本发明涉及一种包含通过根据本发明的方法获得的醛混合物的组合物，其特征在于，所述组合物包含至少一种、或优选至少两种或三种选自由7z-十四碳烯醛、8z-十五碳烯醛、十五烷醛、7z-十六碳烯醛和8z-十七碳烯醛组成的组的醛，其中，所述一种或多种醛分别占所述总组合物的比例约为0.0001wt.％-20wt.％，优选0.001wt.％-10wt.％，更优选0.01wt.％-5wt.％，并且其中，所述组合物可选地包含通过根据权利要求1-12中任一项所述的方法获得的另外的醛，或者其中，所述组合物包含比例约为0.0001wt.％-20wt.％的7z-十四碳烯醛，或者其中，所述组合物包含占所述总组合物的比例约为0.0001wt.％-20wt.％的8z-十五碳烯醛，或者其中，所述组合物包含占所述总组合物的比例约为0.0001wt.％-20wt.％的十五烷醛，或者其中，所述组合物包含占所述总组合物的比例约为0.0001wt.％-20wt.％的7z-十六碳烯醛，或者其中，所述组合物包含占所述总组合物的比例约为0.0001wt.％-20wt.％的8z-十七碳烯醛，或者其中，所述组合物包含至少8z-十五碳烯醛和十五烷醛，其中，8z-十五碳烯醛和十五烷醛占所述总组合物中的比例约为0.0001wt.％-20wt.％，或者其中，所述组合物包含至少8z-十五碳烯醛和8z-十七碳烯醛，其中，8z-十五碳烯醛和8z-十七碳烯醛占所述总组合物中的比例约为0.0001wt.％-20wt.％。
135.在本发明的上下文中，组合物是半成品或成品组合物，并且优选地选自由提供营养或愉悦的制剂或美容或清洁制剂组成的组。
136.本发明中的提供营养或愉悦的制剂例如为烘焙产品(例如，面包、干饼干、蛋糕和其它糕点)、糖果(例如，巧克力、巧克力棒产品、其它棒形产品、果味橡皮糖、硬焦糖和软焦糖和口香糖)、酒精或非酒精饮料(例如，咖啡、茶、葡萄酒、基于葡萄酒的饮料、啤酒、基于啤酒的饮料、白酒、烈酒、白兰地、基于水果的苏打水、等渗饮料、软饮料、蜜汁、水果和蔬菜汁、果汁或蔬菜汁制剂)、速溶饮料(例如，速溶可可饮料、速溶茶饮料、速溶咖啡饮料和速溶水果饮料)、肉制品(例如火腿、新鲜或生香肠制品、调味或腌制的新鲜或腌制肉制品)、鸡蛋或蛋制品(蛋粉、蛋清、蛋黄)、谷类制品(例如早餐谷类食品、谷物棒、预煮的即食米制品)、乳制品(例如乳饮料、酪乳饮料、乳类冰淇淋、酸奶、酸乳酒、奶油干酪、软干酪、硬干酪、奶粉、乳清、黄油、酪乳、部分或全部水解的含乳蛋白的产品)、由大豆蛋白或其他大豆组分制成的产品(例如豆奶和由其制成的产品、含有大豆蛋白的水果饮料、含有大豆卵磷脂的制剂、发酵产品如豆腐或豆豉或由其制成的产品)、水果制品(例如果酱、鲜果冰淇淋、水果沙司和水果馅)、蔬菜制品(例如番茄酱、沙司、干蔬菜、冷冻蔬菜、预煮蔬菜、熟蔬菜)、零食(例如烘焙或油炸马铃薯片或马铃薯团产品、基于玉米或花生的挤出物)、基于脂肪和油的产品或其乳液(例如蛋黄酱、调味蛋黄酱、调味汁)、其他即食餐和汤(例如干粉汤、速溶汤、预煮汤)、香料和调味混合物，尤其是例如用于小吃行业的调味料。本发明中的制剂也可以作为半成品，用于生产提供营养或愉悦的其他制剂。本发明中的制剂还可以胶囊、片剂(无包衣以及有包衣的片剂，例如肠溶衣)、锭剂、颗粒剂、丸剂、固体混合物、液相分散体、作为乳剂、粉剂、溶液、糊剂或者其他可吞咽或咀嚼的作为食品补充剂的其他制剂。
137.本发明中的化妆品或清洁制剂是可用于身体清洁、护理或加香或用于清洁的制
剂。优选的化妆品制剂选自由地板清洁剂、窗玻璃清洁剂、餐具洗涤剂、浴室和卫生清洁剂、擦洗乳、固体和液体厕所清洁剂、粉末和泡沫地毯清洁剂、纺织品清新剂、熨烫助剂、液体洗涤剂、粉末洗涤剂、洗衣预处理剂例如漂白剂、软化剂、浸泡剂和去污剂、洗衣软化剂、洗涤皂、洗涤片、消毒剂、表面消毒剂和液体、凝胶或固体形式的空气清新剂、气溶胶喷雾剂、蜡和抛光剂例如家具抛光剂、地板蜡、鞋油和个人护理产品例如固体和液体肥皂、沐浴露、洗发露、剃须皂、剃须泡沫、沐浴油、水包油型、油包水型和水包油包水型化妆品乳液例如护肤霜和乳液、面霜和乳液、防晒霜和乳液、晒后霜和乳液、护手霜和乳液、护足霜和乳液、脱毛霜和乳液、须后水霜和乳液、晒黑霜和乳液、护发产品例如喷发胶、发胶、定发啫喱、护发素、永久和半永久染发剂、头发定型产品例如冷烫和直发产品、生发油、发乳和洗发剂、除臭剂和止汗剂例如腋下喷雾剂、滚抹剂、除臭棒、除臭霜、装饰性化妆品例如眼影、指甲油、化妆品、唇膏、睫毛膏，以及蜡烛、灯油、熏香棒、杀虫剂、驱虫剂和推进剂组成的组。
138.在一个优选实施例中，所得组合物包含选自由十二烷醇、十三醛、十三醇、十四烷醛、8z-十四碳烯醛、十四醇、十五烷醛、十五烷醇、辛酸、癸酸、十三醛、十三烯醛、十五碳烯醛和8z-十四碳烯醛组成的组的其它醛、羧酸或醇，视根据本发明的方法的实施例而定。
139.在另一个实施例中，获得的混合物的单个组分可以通过技术人员已知的方法部分或完全纯化。因此，这些混合物的主要优点是它们在广泛的工业中的普遍适用性，因为它们既可以作为混合物使用，也可以作为单独的组分使用。
140.下面参考非限制性实施例并基于序列表和附图中提供的公开内容进一步解释本发明。
141.实施例
142.实施例1：单一构建体的创建
143.为了产生用于蛋白质表达的单一构建体，生成了具有编码序列的合适载体。为此，合成不同靶基因的各自编码序列，并在两个限制位点之间克隆到载体pet28a(merck chemicals gmbh，施瓦尔巴赫)或petduet-1(merck chemicals gmbh，施瓦尔巴赫)中。表1概述了克隆的基因以及用于克隆的各个限制位点。对于所有的seq id no，该基因的密码子使用适合作为预期表达宿主之一的大肠杆菌。此外，seq id no：3携带一个相对于从相应生物体获得的原始序列的点突变。
144.表1：基因、使用的载体和限制位点的概述
[0145][0146]
使用标准转化方法(maniatis等人，1983年)，将获得的质粒导入感受态大肠杆菌bl21(de3)细胞中，并将该细胞在选择性固体培养基(lb+氨苄青霉素(100mg/l+6g/l agar)上于37℃下生长18小时。
[0147]
实施例2：通过诱变产生不同的vhaldh变体
[0148]
从质粒pet-duet_lsnox_vhfaldh开始，使用quikchange ii定点诱变试剂盒(安捷伦，waldbronn，德国)生成不同的酶变体。在该过程中，根据制造商的说明，使用特异性引物在vhfaldh的编码序列中引入定向突变。对于vhfaldh的变体pet-duet_lsnox_vhfaldht175q，使用引物vhfaldh-t175q_fw(seq id no：15)和vhfaldh-t175q_rv(seq id no：16)。核酸或相应转译蛋白的序列分别显示在seq id no：3和10中。
[0149]
实施例3：蛋白质表达和纯化osa-dox
[0150]
为了制备50ml体积的蛋白质表达，首先用合适的抗生素制备5ml的lb培养基(carl roth gmbh，卡尔斯鲁厄，德国)的预培养物，并使用接种环，从琼脂平板上取出含有pet28a_osadox的大肠杆菌bl21(de3)细胞并转移到预培养物中。然后在37℃和150rpm下孵育16h。从预培养物开始，用50ml的lb培养基(carl roth gmbh，卡尔斯鲁厄，德国)和适当的抗生素接种主培养物，使得在600nm处的光密度为0.05。然后在37℃和200rpm下培养主培养物，直到在600nm处获得0.6-1.0的光密度。为了诱导蛋白质表达，在该时间点加入0.5mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，并将培养物在21℃下再孵育16h。最后，将主培养物以17，105xg离心10min，以获得细胞沉淀，随后进行蛋白质提取和纯化。为此，首先使用b-per蛋白提取试剂(赛默飞世尔科技公司，波恩，德国)根据制造商的说明进行细胞破碎。获得的细胞裂解物随后直接使用或使用1ml的hispur ni-nta层析柱(赛默飞世尔科技公司，波恩，德国)根据制造商的说明进行处理。
[0151]
实施例4：vhfaldh和lsnox的蛋白质表达
[0152]
为了制备50ml体积的蛋白质表达，首先用合适的抗生素制备5ml的lb培养基(carl roth gmbh，卡尔斯鲁，德国厄)的预培养物，并使用接种环，从琼脂平板上取出含有pet-duet_lsnox_vhfaldh的大肠杆菌bl21(de3)细胞并转移到预培养物中。然后在37℃和
150rpm下孵育16h。从预培养物开始，用50ml的lb培养基(carl roth gmbh，卡尔斯鲁厄，德国)和适当的抗生素接种主培养物，使得在600nm处的光密度为0.1。然后在37℃和200rpm下培养主培养物，直到在600nm处获得0.6-0.8的光密度。为了诱导蛋白质表达，在该时间点加入0.5mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，并将培养物在16℃下再孵育16h。最后，将主培养物以17,105x g离心10min，以获得细胞沉淀，随后进行蛋白质提取和纯化。为此，首先使用b-per蛋白提取试剂(赛默飞世尔科技公司，波恩，德国)根据制造商的说明进行细胞破碎。然后直接使用获得的未澄清的细胞裂解物。
[0153]
实施例5：脂肪酸甘油三酯的水解
[0154]
在1l圆底烧瓶中，加入5-10g的calb-imm(novozym 435；10,000u/g)在380ml叔丁醇(carl roth)中搅拌0.5-3h。然后加入50g甘油三酯和15ml的200mm tris-hcl ph 8缓冲液。所述反应在60℃下剧烈搅拌15-21h进行。随后，通过过滤除去酶，并使用旋转蒸发器将反应混合物浓缩至干燥状态。将产物在4℃下储存过夜，然后掺入200ml的200mm tris-hcl ph 2中。通过加入500ml叔丁基甲基醚(霍尼韦尔)并搅拌1h来提取脂肪酸。将混合物转移到分液漏斗中，直到发生相分离。随后将有机相转移到圆底烧瓶中，并使用旋转蒸发器浓缩至干燥状态。将产物储存在-20℃下，通过气相色谱-质谱联用仪(gc-ms)(20m zb-1，60-9-300，分流60∶1)分析该组合物。通过与标准品比较来确定产品的保留指数。
[0155]
实施例6：使用os-α-dox和vhfaldh制备醛混合物
[0156]
对于根据实施例5的不同脂肪酸或水解产物的反应，使用根据实施例3的含有pet28a_osadox的大肠杆菌bl21(de3)细胞和根据实施例4的来自含有pet-duet_lsnox_vhfaldh的大肠杆菌bl21(de3)细胞的裂解物。为此，将25mm亚油酸(西格玛奥德里奇)、根据实施例3的40g/l大肠杆菌α-dox、来自10g/l大肠杆菌vhfaldh_nox的裂解物、3.25mm nad+(西格玛奥德里奇)、0.5％葡萄糖、0.1％(w/v)阿拉伯树胶和4.7ml ph 8的磷酸钾缓冲液悬浮在50ml反应管中。
[0157]
在此，缓冲液、亚油酸、nad+、葡萄糖和阿拉伯树胶在带有挡板的100ml摇瓶中混合，并在200rpm和37℃下混合5min。然后加入指定的细胞或裂解物，并将反应物在200rpm和37℃下孵育24h。
[0158]
随后，用盐酸将混合物调节至ph 2，并通过加入相同体积的乙酸乙酯(西格玛奥德里奇)在涡旋下萃取两次(1min)。通过在17.105x g下离心10min从水相中分离有机物。通过气相色谱(20m zb-1 df：0.18μm内径：0.18mm/60-12-300
°
kas)分析样品。通过与标准品和gc-ms数据进行比较，确定所选gc方法的保留指数。
[0159]
实施例7：根据本发明的醛混合物
[0160]
表2和表3显示了通过根据本发明的方法获得的示例性混合物。除了获得的混合物之外，单个组分可以在随后的步骤中纯化。
[0161]
表2：通过本发明的方法制备的醛混合物
[0162]
名称比例[％]十二烷醇0.847十三醛1.768十三醇1.6407z-十三醛3.067
十四烷醛8.7398z-十四碳烯醛2.278十四醇2.6498z-十五碳烯醛17.770十五烷醛20.946十五烷醇0.9307z十六碳烯醛1.8938z-十七碳烯醛8.543
[0163]
表3：通过本发明的方法制备的醛混合物
[0164][0165]
技术特征：1.一种用于生产至少一种不饱和醛及其相应的羧酸和/或至少一种饱和醛及其相应的羧酸的生物技术方法，所述方法包括提供至少一种α-双加氧酶和至少一种醛脱氢酶。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物技术方法是发酵方法，包括以下步骤：i.提供至少一种含有核酸片段的重组微生物或真菌，所述核酸片段包含至少一种编码α-双加氧酶的基因和/或至少一种编码醛脱氢酶的基因；ii.在允许相应表达产物表达的条件下培养所述至少一种重组微生物；iii.向所述至少一种培养的重组微生物中加入至少一种羧酸或至少一种用醇酯化的羧酸；以及iv.通过使所述至少一种α-双加氧酶和所述至少一种醛脱氢酶与步骤iii的所述至少一种羧酸或所述用醇酯化的羧酸反应，获得至少一种不饱和醛及其相应的羧酸和/或至少一种饱和醛及其相应的羧酸。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物技术生产方法是酶催化方法，包括以下步骤：i.提供至少一种α-双加氧酶和至少一种醛脱氢酶，其中，所述至少一种α-双加氧酶和/或所述至少一种醛脱氢酶可通过天然、化学或生物技术生产；ii.向步骤i中所提供的酶中加入至少一种羧酸或至少一种用醇酯化的羧酸；iii.通过使所述至少一种α-双加氧酶和所述至少一种醛脱氢酶与步骤ii的所述至少一种羧酸或所述用醇酯化的羧酸反应，获得至少一种不饱和醛及其相应的羧酸和/或至少一种饱和醛及其相应的羧酸。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，至少一种所述反应物来自生物技术、天然或化学或者其组合。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述反应物选自由羧酸和用醇酯化的羧酸组成的组，优选地，其中，所述反应物选自由棕榈油酸、花生四烯酸、α-亚麻酸、油酸、石榴酸、α-桐酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、岩芹酸、大风子油酸、α-甘草酸、橄榄油、菜籽油、澳洲坚果油、沙棘果油、桐油、鱼油、琉璃苣油、大风子油、欧芹油、奥气油、石榴籽油、椰子油、向日葵油、葡萄籽油和微生物油组成的组，所述微生物油从选自耳霉属、小火菇属、层孔菌属、灵芝属、被孢霉属、扇菇属、侧耳属、小脆柄菇属、韧革菌属、伞状霉属及其衍生物的任何属中获得。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法的产物是选自由7z，10z-十六碳二烯醛、8z，11z-十七碳二烯醛、6e，9e-十五碳二烯醛、7z-十六碳烯醛、8z-十五碳烯醛、8z，11z，14z-十七碳三烯醛、7z，10z，13z-十六碳三烯醛、4z，7z，10z，13z-十九四烯十九四烯、8z，10e，12e-十七碳三烯醛、8z，10e，12z-十七碳三烯醛、7z，9e，11z-十六碳三烯醛、7z，9e，11e-十六碳三烯醛、9-癸烯醛、10-十一烯醛、3z-癸烯醛、4z-十一烯醛、7z-十二烯醛、8z-十三烯醛、7z-十四碳烯醛、8z-十五碳烯醛、9z-十四碳烯醛、10z-十五碳烯醛、7z-十五碳烯醛、8z-十六碳烯醛、9z-十六碳烯醛、10z-十七碳烯醛、5z，8z-十四碳二烯醛、6z，9z-十五碳二烯醛、7z，10z-十四碳二烯醛、8z，11z-十五碳二烯醛、7z，9e-十六碳二烯醛、8z，10e-十七碳二烯醛、8e，10z-十六碳二烯醛、9e，11z-十七碳二烯醛、9-甲基十一醛、10-甲基十一醛、10-甲基十二醛、11-甲基十二醛、11-甲基十三醛、12-甲基十三醛、12-甲基十四醛、13-甲基十四醛和13-甲基十五烷醛组成的组的至少一种饱和醛及其相应的羧酸和/或至少
一种不饱和醛及其相应的羧酸。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述至少一种重组微生物选自由优选为大肠杆菌bl21、大肠杆菌mg1655、大肠杆菌w3110及其衍生物的大肠杆菌、优选为衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌及其衍生物的芽孢杆菌属、优选为酿酒酵母及其衍生物的酵母属、优选为法夫驹形氏酵母和多形汉逊酵母及其衍生物的汉逊酵母属或毕赤酵母属、以及优选为乳酸克鲁维酵母的克鲁维酵母属组成的组。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，另外提供至少一种nadh氧化酶和/或至少一种脂肪酶。9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述至少一种nadh氧化酶包含一个氨基酸序列，其中，所述氨基酸序列选自由seq id no：62和64组成的组，或为与seq id no：62和64具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述至少一种脂肪酶是选自由南极假丝酵母、黑曲霉、米根霉、卡门柏青霉、爪哇毛霉、娄地青霉、猪胰、皱褶假丝酵母、米黑根毛霉、南极假丝酵母或戴尔根霉组成的组的商业脂肪酶。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述至少一种α-双加氧酶包含一个氨基酸序列，其中，所述氨基酸序列选由自seq id no：8、11、37、38、39、40、41、43、44、45、46、47、48、50、51、52、53、54、55或56组成的组，或为与seq id no：8、11、37、38、39、40、41、43、44、45、46、47、48、50、51、52、53、54、55或56具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述至少一种醛脱氢酶包含一个氨基酸序列，其中，所述氨基酸序列选自由seq id no：9、10、12、13、14、59或60组成的组，或为与seq id no：9、10、12、13、14、59或60具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。13.一种载体系统，优选地为质粒载体系统，由至少一种载体或质粒载体组成，所述载体或质粒载体包含含有编码α-双加氧酶的至少一个基因的核酸片段(a)，和含有编码醛脱氢酶的至少一个基因的核酸片段(b)；并且，可选地包含含有编码nadh氧化酶的至少一个基因的所述核酸片段(a)和/或所述核酸片段(b)的部分和/或包含编码脂肪酶的至少一个基因的核酸片段，其中，所述核酸片段(a)和/或所述核酸片段(b)在同一载体上或者在两个或多个独立的载体上提供。14.根据权利要求13所述的载体系统，其编码至少一种多肽的表达，其中，所述多肽选自由seq id no：8、9、10、11、12、13、14、37、38、39、40、41、43、44、45、46、47、48、50、51、52、53、54、55、56、59或60组成的组，或为与seq id no：8、9、10、11、12、13、14、37、38、39、40、41、43、44、45、46、47、48、50、51、52、53、54、55、56、59或60具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。15.一种组合物，包含通过权利要求1-12中任一项所述的方法获得的醛混合物，其特征在于，所述组合物包含至少一种、或优选至少两种或三种选自由7z-十四碳烯醛、8z-十五碳烯醛、十五烷醛、7z-十六碳烯醛和8z-十七碳烯醛组成的组的醛，其中所述一种或多种醛分别占所述总组合物的比例约为0.0001wt.％-20wt.％，优选0.001wt.％-10wt.％，更优选0.01wt.％-5wt.％，并且其中，所述组合物可选地包含通过根据权利要求1-12中任一项所
述的方法获得的另外的醛，或者其中，所述组合物包含比例约为0.0001wt.％-20wt.％的7z-十四碳烯醛，或者其中，所述组合物包含占所述总组合物的比例约为0.0001wt.％-20wt.％的8z-十五碳烯醛，或者其中，所述组合物包含占所述总组合物的比例约为0.0001wt.％-20wt.％的十五烷醛，或者其中，所述组合物包含占所述总组合物的比例约为0.0001wt.％-20wt.％的7z-十六碳烯醛，或者其中，所述组合物包含占所述总组合物的比例约为0.0001wt.％-20wt.％的8z-十七碳烯醛，或者其中，所述组合物包含至少8z-十五碳烯醛和十五烷醛，其中，8z-十五碳烯醛和十五烷醛占所述总组合物中的比例约为0.0001wt.％-20wt.％，或者其中，所述组合物包含至少8z-十五碳烯醛和8z-十七碳烯醛，其中，8z-十五碳烯醛和8z-十七碳烯醛占所述总组合物中的比例约为0.0001wt.％-20wt.％。
技术总结本发明涉及一种使用至少一种α-双加氧酶和至少一种醛脱氢酶生产饱和和不饱和醛及其混合物的生物技术方法。该方法可以通过发酵或酶促进行。此外，本发明涉及一种载体系统，以及编码可用于生产根据本发明的醛和混合物的酶的序列和重组微生物。此外，本发明涉及通过根据本发明的方法获得的组合物。据本发明的方法获得的组合物。
技术研发人员：托尔斯滕
受保护的技术使用者：西姆莱斯有限公司
技术研发日：2020.03.12
技术公布日：2022/11/1
