1.本发明属于生物医药领域，涉及一种改善肠道炎症的藜麦膳食纤维制备方法及应用。
背景技术：2.包括溃疡性结肠炎和克罗恩病在内的炎症性肠病，是肠道的一种慢性复发性疾病，到目前为止仍没有有效的治疗方法。近年来，全球范围内的溃疡性结肠炎患病率均在增加，在许多曾经被认为是低发病率的发展中国家，其发病率也急剧上升。炎症性肠病的常见病因包括遗传学，免疫反应失调，慢性炎症，肠道菌群失衡(营养不良)和粘膜屏障功能缺陷等。在病理学上，溃疡性结肠炎临床表现为腹痛，腹胀和粘液血便，伴有体重减轻和发热，上腹部充盈不适，疝气，厌食，恶心，呕吐等，且其特征是中性粒细胞明显浸润到结肠中使其发生病变，上皮细胞坏死，粘膜和粘膜下层溃疡，浸润的中性粒细胞会释放活性氧引起局部炎症，并损害屏障功能。正常的肠上皮屏障功能依赖于黏液层的完整性，以及紧密连接蛋白的表达，如果受到破坏，会加重结肠炎。
3.肠道微生物是人体最庞大、最复杂的微生态系统，它与溃疡性结肠炎的发生密切相关。肠道微生物与宿主形成共生关系，本身及其代谢产物不仅能调节人体健康，更在膳食和宿主之间起到了重要的桥梁作用，通过促进肠道上皮生长和调节宿主免疫防御来维持宿主的生理健康。当肠道菌群功能失调时，会刺激人体的免疫损伤过程并启动炎症信号通路。饮食干预被证实能够通过调节对粘膜免疫系统的影响和增强肠道菌群多样性来治疗或预防炎症性肠病。现代营养学研究表明，高分子膳食纤维不能被胃和肠道所消化，大部分进入肠道，调控肠道菌群。肠道菌群作为一种新的功能靶点，在调节宿主肠道健康方面发挥了重要作用。
4.藜麦作为一种“类全谷物”，不仅具有丰富的蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素、矿物质及膳食纤维，而且还富含多种生物活性物质，如皂苷、黄酮、多酚、花青素等，对预防肥胖、心血管疾病、糖尿病和癌症等有很好的预防和辅助治疗作用，而且还具有增强机体免疫力、抗炎、抗氧化等方面的功效。除了具有高营养品质外，藜麦还以无麸质为特征，该特性可以为乳糜泻患者提供更多合适的食品，并提供更多种类的营养品。藜麦种子膳食纤维含量约为13％，其中可溶性纤维可高达总膳食纤维的30％，含量约为4％，高于小麦和玉米等粮食作物，与传统谷物相比具有诸多优势。此外，藜麦膳食纤维具有较高的持水能力、葡萄糖吸收能力和鹅去氧胆酸能力。而藜麦麸皮膳食纤维提取工艺简单，成本低廉，能充分利用谷物加工副产物并提高其附加值；因此有必要探索一种可明显改善肠道炎症导致的肠道菌群失衡等问题的藜麦膳食纤维的应用。
技术实现要素：5.本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种改善肠道炎症的藜麦膳食纤维制备方法及应用。本发明通过在藜麦麸皮中提取藜麦膳食纤维，研究了藜麦膳食纤维对肠道炎
症、肠道屏障功能障碍、肠道菌群失衡等的调节作用，进一步阐明了藜麦膳食纤维用于改善结肠炎的机制，从而进一步预防炎症性肠病、结肠癌等疾病，具有重要的临床应用意义。
6.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
7.首先，提供了一种藜麦膳食纤维在制备用于改善肠道炎症产品中的应用，所述藜麦膳食纤维的提取方法包括以下步骤：
8.(1)将藜麦麸皮与mes-tris缓冲液混合均匀后，加入α-淀粉酶在58-62℃下反应，然后加入蛋白酶在38-42℃下反应，再加入淀粉葡萄糖苷酶在58-62℃下反应；
9.(2)步骤(1)中的反应完成后，加入三氯乙酸并离心取上清液，将上清液离心、醇沉、透析、干燥后得到藜麦膳食纤维。
10.进一步地，步骤(1)中所述藜麦麸皮、α-淀粉酶、蛋白酶、淀粉葡萄糖苷酶的重量比为16-18：2.5-3.5：0.09-0.12：0.35-0.45。
11.在一些具体的实施方式中，所述藜麦膳食纤维的提取方法包括以下步骤：
12.(1)将17.0g藜麦麸皮粉末与mes-tris缓冲液(0.05m，25℃，ph值6.9)按1g：30ml的比例混合后，在50℃条件下搅拌处理40min；然后，在60℃的水浴条件下加入3gα-淀粉酶(3700u/g)，温育30min，以除去淀粉；在40℃水浴条件下加入0.09g中性蛋白酶(6
×
104u/g)温育30min，以除去蛋白质；最后，在60℃的水浴条件下加入0.4g淀粉葡萄糖苷酶(1
×
105u/g)，温育30min，除去残留淀粉。
13.(2)酶反应结束后，加入10％三氯乙酸室温下过夜，沉降残余蛋白质，然后以3600r/min的速度离心20min除去残留物；上清液用4倍体积的95％乙醇沉淀2h后，以3600r/min的速度离心15min，得到粗藜麦膳食纤维；用丙酮、乙醚和80％乙醇洗涤粗藜麦膳食纤维，除去残留油脂，并使用200da透析袋透析36h，除去其它杂质；最后在65℃真空干燥箱干燥，得到纯化的藜麦膳食纤维。
14.进一步地，所述纯化的藜麦膳食纤维的单糖的组成为：甘露糖(0.44wt％)、核糖(0.45wt％)、葡萄糖(78.16wt％)、半乳糖(2.40wt％)、木糖(0.13wt％)、阿拉伯糖(1.52wt％)、岩藻糖(0.51wt％)、葡萄糖醛酸(1.49wt％)、半乳糖醛酸(14.90wt％)；分子量为5.57
×
104da。
15.进一步地，所述产品为药物、食品、保健品中的任意一种。
16.进一步地，所述产品为药物，所述药物包括药学上可接受的载体或辅料，所述载体或辅料均包括稀释剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂中的一种或几种。
17.进一步地，所述稀释剂包括淀粉、微晶纤维素、蔗糖、糊精、乳糖、糖粉、葡萄糖。
18.进一步地，所述粘合剂包括乙醇、淀粉浆、糖浆、羟丙基甲基纤维素、羟甲基纤维素钠、海藻酸钠。
19.进一步地，所述崩解剂包括酒石酸、低取代羟丙基纤维素。
20.进一步地，所述润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、氯化钠、油酸钠、泊洛沙母、月桂醇硫酸钠。
21.进一步地，所述产品为药物时，可以通过口服、注射、喷射、渗透等方法导入机体(如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织)。
22.进一步地，所述产品为用于改善结肠炎导致的体重下降、疾病活动指数增加、结肠缩短的产品。
23.进一步地，所述产品为用于改善结肠结构完整性、抑制结肠细胞凋亡的产品。
24.进一步地，所述产品为用于抗粘膜屏障功能缺陷的产品。
25.进一步地，所述产品为用于调节肠道菌群失衡的产品。
26.进一步地，所述产品为用于预防和/或治疗肠道炎症等相关疾病的产品。
27.进一步地，所述的疾病包括溃疡性结肠炎、克罗恩病、免疫反应失调、肠道菌群失衡、腹胀和粘液血便、体重减轻和发热、上腹部充盈不适、疝气、厌食、恶心、呕吐、肠上皮细胞坏死，粘膜和粘膜下层溃疡、慢性炎症。
28.进一步地，所述产品的剂型为口服液、片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂的任意一种。
29.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
30.(1)本技术制备的藜麦膳食纤维作为一种活性成分，首次被应用于制备调节炎症反应、抑制细胞凋亡、改善肠道屏障功能障碍的产品中，为预防和/或治疗肠道炎症等相关疾病提供了一种新的策略；
31.(2)本技术制备的藜麦膳食纤维可明显改善肠道炎症导致的肠道菌群失衡等问题，可提高短链脂肪酸的含量，增加肠道菌群的多样性和丰度。
附图说明
32.图1：藜麦膳食纤维透射电镜图像；
33.图2：(a)体重变化图(初始体重的百分比)，*表示差异显著：p《0.05；(b)疾病活动指数(dai)，分数越高表明症状越严重，*表示差异显著：p《0.05；(c)左图为结肠图像，(c)右图为结肠长度定量柱形图；
34.图3：(a)组织病理学定量评分；(b)tunel阳性细胞/视野细胞数量的量化柱形图；
35.图4：(a)结肠组织中tnf-α的相对蛋白表达；(b)结肠组织中il-1β的相对蛋白表达；(c)结肠组织中pro-caspase-1的相对蛋白表达；
36.图5：(a)结肠组织中tnf-α的相对mrna表达；(b)结肠组织中mcp-1的相对mrna表达；(c)结肠组织中il-10的相对mrna表达；
37.图6：(a)血清中tnf-α的相对蛋白表达；(b)血清中il-1β的相对蛋白表达；
38.图7：(a)结肠组织中muc2的相对蛋白表达；(b)结肠组织中zo-1的相对蛋白表达；
39.图8：结肠组织中muc2(a)，zo-1(b)，claudin-1(c)，claudin-3(d)和occludin(e)的相对mrna表达；
40.图9：小鼠粪便样本肠道微生物群落的α多样性比较；(a)chao 1物种丰富度指数；(b)ace物种丰富度指数；(c)simpson多样性指数；(d)shannon多样性指数；
41.图10：维恩图，重叠部分表明不同处理组小鼠肠道菌群中otu是相同的；
42.图11：(a)不同处理组之间门水平的肠道菌群结构比较柱形图；(b)不同处理组之间门水平的丰度比较柱状图；
43.图12：不同处理组粪便样品中的短链脂肪酸水平；(a)乙酸；(b)丙酸；(c)异丁酸；(d)丁酸；(e)异戊酸；(f)戊酸；
44.图2-9、11-12中误差棒上方的字母表示：若包括相同字母，表示差异不显著，p≥0.05；若不包括相同字母，表示差异显著，p《0.05；如a与a之间差异不显著，a与ab之间差异不显著，a与b之间差异显著。
具体实施方式
45.值得说明的是，本发明中使用的原料均为普通市售产品，对其来源不做具体限定。
46.以下试剂及仪器来源，为示例性说明：藜麦麸皮粉末(青白藜1号，购自青海高远锦禾生态农牧科技有限公司)，粪便隐血检测试剂盒(购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司)，tunel细胞凋亡检测试剂盒(购自上海碧云天生物技术有限公司)。
47.实施例1
48.建立小鼠模型
49.1.材料
50.动物：体重为15-20g的7周龄balb/c小鼠40只，购自北京大学动物医学部，所有小鼠均为雄性；饲料(ain-93g rodent diet)，藜麦膳食纤维1(qbsdf)，藜麦膳食纤维2(qbsdf(l))，自来水(动物房专用水)，含2.5％(w/v)葡聚糖硫酸钠(dss)的自来水；
51.藜麦膳食纤维1(qbsdf)的提取步骤如下：
52.(1)将17.0g藜麦麸皮粉末与mes-tris缓冲液(0.05m，25℃，ph值6.9)按1g：30ml的比例混合后，在50℃条件下搅拌处理40min。然后，在60℃的水浴条件下加入3gα-淀粉酶(3700u/g)，温育30min，以除去淀粉；在40℃水浴条件下加入0.09g中性蛋白酶(6
×
104u/g)温育30min，以除去蛋白质；最后，在60℃的水浴条件下加入0.4g淀粉葡萄糖苷酶(1
×
105u/g)，温育30min，除去残留淀粉。
53.(2)酶反应结束后，加入10％三氯乙酸室温下过夜，沉降残余蛋白质，然后以3600r/min的速度离心20min除去残留物。上清液用4倍体积的95％乙醇沉淀2h后，以3600r/min的速度离心15min，得到粗藜麦膳食纤维。用丙酮、乙醚和80％乙醇洗涤粗藜麦膳食纤维，除去残留油脂，并使用200da透析袋透析36h，除去其它杂质。最后在65℃真空干燥箱干燥，得到纯化的藜麦膳食纤维1(qbsdf)，对上述得到的qbsdf进行透射电镜实验，实验结果见图1。
54.藜麦膳食纤维2(qbsdf(l))的提取步骤如下：
55.(1)将15.0g藜麦麸皮粉末与mes-tris缓冲液(0.05m，25℃，ph值6.9)按1g：30ml的比例混合后，在50℃条件下搅拌处理40min。然后，在60℃的水浴条件下加入2gα-淀粉酶(3700u/g)，温育30min，以除去淀粉；在40℃水浴条件下加入0.15g中性蛋白酶(6
×
104u/g)温育30min，以除去蛋白质；最后，在60℃的水浴条件下加入0.3g淀粉葡萄糖苷酶(1
×
105u/g)，温育30min，除去残留淀粉。
56.(2)酶反应结束后，加入10％三氯乙酸室温下过夜，沉降残余蛋白质，然后以3600r/min的速度离心20min除去残留物。上清液用4倍体积的95％乙醇沉淀2h后，以3600r/min的速度离心15min，得到粗藜麦膳食纤维。用丙酮、乙醚和80％乙醇洗涤粗藜麦膳食纤维，除去残留油脂，并使用200da透析袋透析36h，除去其它杂质。最后在65℃真空干燥箱干燥，得到纯化的藜麦膳食纤维2(qbsdf(l))。
57.饲养条件：标准spf级环境，温度20-25℃，湿度55％，12h明暗循环，可自由获取食物和水。
58.2.方法
59.balb/c小鼠分为5组，每组8只：
60.对照组(con)：摄入普通饲料；
61.藜麦膳食纤维组(qbsdf)：摄入普通饲料同时摄入藜麦膳食纤维1；
62.dss组(dss)：摄入普通饲料同时摄入2.5％(w/v)dss的自来水；
63.qbsdf和dss组(dss+qbsdf)：摄入普通饲料同时摄入qbsdf、2.5％(w/v)dss的自来水；
64.qbsdf(l)和dss组(dss+qbsdf(l))：摄入普通饲料同时摄入qbsdf(l)、2.5％(w/v)dss的自来水；
65.小鼠适应一周后分为三组，一组(n＝16)接受灌胃qbsdf处理，二组(n＝8)接受灌胃qbsdf(l)处理，三组(n＝16)接受灌胃自来水(动物房专用水)处理。灌胃小鼠qbsdf或qbsdf(l)的量为1.5g/kg/d。两周后，一组、三组小鼠再随机分为两个亚组，分别让其饮用普通自来水和含有2.5％(w/v)dss的自来水，二组让其饮用含有2.5％(w/v)dss的自来水。这五组可分为：空白组(con，n＝8)、只饮用2.5％(w/v)dss的dss组(dss，n＝8)、dss+qbsdf组(dss+qbsdf，n＝8)、只灌胃qbsdf的qbsdf组(qbsdf，n＝8)、dss+qbsdf(l)组(dss+qbsdf(l)，n＝8)。con组和qbsdf组饮用正常自来水，dss组、dss+qbsdf组、dss+qbsdf(l)组饮用含2.5％(w/v)dss的自来水，7天后所有组小鼠饮用正常自来水，在饮用正常自来水第7天实施安乐死，且小鼠安乐死前禁食12小时。
66.实施例2
67.结肠炎小鼠的失重率、疾病活动指数(dai)值和结肠长度检测实验：
68.dai值是通过小鼠的失重率(0-4分)，粪便稠稀情况(0-4分)和血便情况(0-4分)三个方面进行评估分析的。dai分数是在dss诱导和恢复期间被记录评分的。小鼠粪便的血便情况由粪便隐血检测试剂盒检测。如图2所示，藜麦膳食纤维1(qbsdf)摄入显著改善了小鼠体重减轻，dai评分增加和结肠缩短情况，而藜麦膳食纤维2(qbsdf(l))对以上三种情况的改善效果相对较差，表明制备得到的qbsdf对balb/c小鼠的结肠炎症状具有显著的改善作用。因此，实施例3-7的检测实验不再研究dss+qbsdf(l)。
69.实验例3
70.结肠损伤和结肠细胞凋亡情况检测实验：
71.采用组织病理学评分分析结肠损伤和tunel细胞凋亡检测试剂盒分析结肠细胞凋亡情况。
72.如图3所示，qbsdf摄入显著改善了dss诱导的小鼠结肠炎的组织病理学评分的升高，此外，qbsdf干预显著降低了结肠上皮tunel阳性细胞数量。这表明，藜麦膳食纤维能显著减少结肠上皮细胞凋亡，对结肠炎症有显著的改善作用。
73.实施例4
74.结肠炎症蛋白和基因表达的检测：
75.检测方法：采用western blotting检测结肠组织炎症相关(tnf-α、1l-1β、pro-caspase-1)蛋白的表达，采用qrt-pcr检测结肠炎相关基因(tnf-α、mcp-1、1l-10)，采用酶联免疫吸附测定法(elisa)测定血清中tnf-α和il-1β的表达。每组采用八个平行实验并取均值。
76.如图4、6所示，qbsdf摄入显著改善了结肠炎小鼠炎症蛋白il-1β、tnf-α、pro-caspase-1表达水平的提高，且降低了血清中il-1β、tnf-α的蛋白表达量；如图5所示，在dss组，tnf-α和mcp-1的基因表达量显著增加，在qbsdf干预下，tnf-α和mcp-1表达水平显著降
低。这表明，qbsdf可以直接抑制炎症因子的表达，并通过促进抑炎因子il-10的表达，来抑制il-1β、tnf-α等肠道炎症因子的分泌(如图6)来达到改善结肠炎的作用。
77.实施例5
78.结肠粘膜紧密连接蛋白和基因表达检测：
79.检测方法：采用western blotting检测结肠粘膜紧密连接蛋白的表达。将结肠组织进行裂解提取蛋白，对蛋白变性处理后进行sds-page电泳分离目标蛋白，使用抗体与目标蛋白结合，使用凝胶成像仪对目标蛋白进行显色并采用image lab定量。每组采用八个平行并取均值。采用qrt-pcr检测结肠紧密连接蛋白相关基因(claudin-1，claudin-3，muc2，zo-1，occludin)的表达。
80.如图7所示，qbsdf摄入显著改善了dss诱导结肠炎小鼠结肠组织muc2和zo-1蛋白表达的降低；如图8所示，dss组结肠粘膜紧密连接蛋白相关基因包括claudin-1，claudin-3，muc2，zo-1，occludin的表达显著降低。在qbsdf干预下，claudin-1，claudin-3，muc2，zo-1，occludin表达水平显著提高。这表明，qbsdf显著改善了dss处理后小鼠结肠的相关保护上皮组织的黏蛋白和基因表达降低，从而起到保护肠道的作用。
81.实施例6
82.肠道菌群结构组成检测：
83.检测方法：采用16s rrna基因测序分析小鼠肠道菌群，使用trimmomatic软件的原始测序序列进行质量控制，flash软件进行拼接。使用的uparse软件(version 7.1http://drive5.com/uparse/)，根据97％的相似度对序列进行otu聚类并剔除嵌合体。利用rdp classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)对每条序列进行物种分类注释，比对silva数据库(ssu128)，设置比对阈值为70％。
84.如图9所示，qbsdf显著改善了dss诱导的结肠炎小鼠肠道菌群多样性和丰度的降低。qbsdf干预组chao 1、ace和shannon指数较dss组显著增加，simpson指数显著减少。如图10所示，qbsdf组、dss组和dss+qbsdf组与对照组共有的otu数目分别为792、629、687，表明藜麦膳食纤维对结肠炎小鼠肠道菌群多样性减少有显著的改善作用。如图11所示，qbsdf显著增加了firmicutes和patescibacteria菌门的丰度，显著减少了bacteroidetes和epsilonbacteraeota菌门的丰度。藜麦膳食纤维可调节炎症小鼠关键菌群向正常比例变化，这表明藜麦膳食纤维能改善肠道菌群结构和肠道微环境，对肠道屏障有一定的保护作用。
85.实施例7
86.肠道短链脂肪酸含量分析检测：
87.检测方法：采用气相色谱-质谱联用仪(gc-ms)测定粪便中短链脂肪酸(scfas)的水平。取小鼠粪便样本(0.1g)溶解在1毫升蒸馏水中，加入0.5ml硫酸(体积分数50％)处理10min。混合物与2ml乙醚混合，在冰上萃取30min，并离心收集上层清液用于gc-ms分析。
88.如图12所示，dss显著降低了结肠炎小鼠乙酸、丁酸、异戊酸和戊酸的含量，而qbsdf显著提高了乙酸和丁酸的含量，这表明藜麦膳食纤维可以通过增加短链脂肪酸的生成改善肠道炎症。
89.最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，
均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
技术特征：1.一种藜麦膳食纤维在制备用于改善肠道炎症产品中的应用，其特征在于，所述藜麦膳食纤维的提取方法包括以下步骤：(1)将藜麦麸皮与mes-tris缓冲液混合均匀后，加入α-淀粉酶在58-62℃下反应，然后加入蛋白酶在38-42℃下反应，再加入淀粉葡萄糖苷酶在58-62℃下反应；(2)步骤(1)中的反应完成后，加入三氯乙酸并离心取上清液，将上清液离心、醇沉、透析、干燥后得到藜麦膳食纤维。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)中所述藜麦麸皮、α-淀粉酶、蛋白酶、淀粉葡萄糖苷酶的重量比为16-18：2.5-3.5：0.09-0.12：0.35-0.45。3.根据权利要求1-2任一项所述的应用，其特征在于，所述产品为药物、食品、保健品中的任意一种。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品为药物，所述药物包括药学上可接受的载体或辅料，所述载体或辅料均包括稀释剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂中的一种或几种。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为用于改善结肠炎导致的体重下降、疾病活动指数增加、结肠缩短的产品。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为用于改善结肠结构完整性、抑制结肠细胞凋亡的产品。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为用于抗粘膜屏障功能缺陷的产品。8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为用于调节肠道菌群失衡的产品。9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为用于预防和/或治疗肠道炎症等相关疾病的产品。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的疾病包括溃疡性结肠炎、克罗恩病、免疫反应失调、肠道菌群失衡、腹胀和粘液血便、体重减轻和发热、上腹部充盈不适、疝气、厌食、恶心、呕吐、肠上皮细胞坏死，粘膜和粘膜下层溃疡、慢性炎症。
技术总结本发明提供了一种改善肠道炎症的藜麦膳食纤维制备方法及应用，属于生物医药领域。所述藜麦膳食纤维作为一种食源性生物活性成分，首次被应用于制备预防和改善溃疡性结肠炎的产品中，可明显改善肠道炎症导致的体重下降、疾病活动指数增加、结肠缩短等结肠炎症状，并可改善结肠结构完整性，抑制结肠细胞凋亡，调节结肠炎肠道菌群的多样性和丰度，为结肠炎的预防和治疗提供了一种新的策略。预防和治疗提供了一种新的策略。预防和治疗提供了一种新的策略。
技术研发人员：王子元 王静 刘洁 陈志宁 王宗伟
受保护的技术使用者：北京工商大学
技术研发日：2022.05.19
技术公布日：2022/11/1
