一种gh-1噬菌体病毒样颗粒、制备方法及应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学基因工程领域，公开了一种gh-1噬菌体病毒样颗粒的制备方法及应用。
背景技术：2.gh-1噬菌体是恶臭假单胞菌的一种特异性噬菌体，其染色体全长37359bp，末端重复216bp，由线性双链dna组成。透射电镜(tem)观察结果显示，gh-1噬菌体核衣壳呈正六边形，直径约50nm，附着一条具有纤维的短楔形尾巴，综合形态与大肠杆菌t3和t7噬菌体极为相似，为t7样噬菌体短尾家族成员。jolly和irina v等研究团队的结果证实，gh-1噬菌体的蛋白合成时间与t7噬菌体相差无几，其衣壳蛋白(p28)、支架蛋白(p27)和连接蛋白(p26)与t7噬菌体相应蛋白的同源性分别为72％、43％和68％。
3.病毒样颗粒(virus-like particles，vlps)是一种由一个或多个病毒蛋白组装形成的、具有类似病毒形态的蛋白颗粒物质，其内部缺乏遗传物质，不能复制，因此不具有感染性，可作为理想的疫苗或药物载体。目前文献已报道的vlps，直径多介于25～100nm之间，作为一种生物纳米颗粒，病毒样颗粒具有以下特点：
4.(1)组成成分确定；
5.(2)直径较小，可被淋巴结中的抗原递呈细胞有效摄取，激活免疫应答；
6.(3)内部中空，可装载抗原或药物，实现靶向递送。
7.目前，已有关于t7噬菌体病毒样颗粒制备的相关研究报道，但尚无gh-1噬菌体病毒样颗粒制备相关专利及研究报道。
技术实现要素：8.基于以上问题，本发明公开了一种gh-1噬菌体病毒样颗粒的制备方法及应用，本发明利用petduet-1质粒在大肠杆菌bl21(de3)内共表达gh-1噬菌体p28和p27蛋白，经自主装、纯化获得了gh-1噬菌体病毒样颗粒。
9.为解决以上技术问题，本发明提供了一种gh-1噬菌体病毒样颗粒的制备方法，方法如下：将gh-1噬菌体p28基因克隆至petduet-1质粒mcs 1的bamh i/sal i双酶切位点中，获得含gh-1噬菌体p28基因的petduet-1-p28表达质粒，p28基因的核苷酸序列见seq id no：1；之后再将gh-1噬菌体p27基因克隆至petduet-1-p28表达质粒mcs 2的nde i/xho i双酶切位点中，获得gh-1噬菌体病毒样颗粒表达质粒petduet-1-p28-p27，p27基因的核苷酸序列见seq id no：2，将petduet-1-p28-p27质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)，经氨苄抗性筛选获得gh-1噬菌体病毒样颗粒表达菌株tt-110，经诱导、表达、体内自组装和纯化后得到gh-1噬菌体病毒样颗粒。
10.为解决以上技术问题，本发明还提供了gh-1噬菌体病毒样颗粒。
11.为解决以上技术问题，本发明还提供了gh-1噬菌体病毒样颗粒在制备嵌合病毒样颗粒疫苗及靶向药物的载体中的应用。
12.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明构建的质粒petduet-1-p28-p27在大肠杆菌bl21(de3)中成功共表达出gh-1噬菌体衣壳蛋白p28和支架蛋白p27，并自组装出形状完整、大小均一的gh-1噬菌体病毒样颗粒，组装成功的gh-1噬菌体病毒样颗粒可用以构建疫苗或作为药物的靶向生物包衣材料。
附图说明
13.图1为本发明的实施例提供的sds-page电泳示意图；
14.图2是本发明的实施例提供的gh-1噬菌体病毒样颗粒的电镜观察结果示意图。
15.图3是gh-1噬菌体病毒样颗粒的动态光散射图谱。
具体实施方式
16.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
17.实施例：
18.本实施例将合成的gh-1噬菌体衣壳蛋白编码基因p28克隆至petduet-1质粒mcs 1的bamh i/sal i双酶切位点中，获得含gh-1噬菌体p28基因的表达质粒，命名为petduet-1-p28；之后将合成的gh-1噬菌体支架蛋白编码基因p27克隆至petduet-1-p28质粒mcs 2的nde i/xho i双酶切位点中，获得gh-1噬菌体病毒样颗粒表达质粒，命名为petduet-1-p28-p27，将petduet-1-p28-p27质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)，经氨苄抗性筛选，获得gh-1噬菌体病毒样颗粒表达菌株，命名为tt-110。
19.p28基因的核苷酸序列如下：
20.atggcaaacgcaactggcggtcaacaaatcggtgccaaccaaggcaagggccaatcggctgctgacaaactggctctgttcctgaaagtcttcggtggcgaagttctgaccgcattcgtgcgtcgttccgtcactatggacaaacacatggtccgtaccatccagaatggtaagtcggccagcttcccggtcatgggccgcaccaagggctactacctcgctccgggtgagaacctcgacgacaaacgtaaggacatcaagcattccgagaaggtcatccagatcgacggcctgctgacttccgacgttctgatctacgacatcgaagatgccatgaaccactacgacgttcgtgccgagtacagcgcccaactgggtgaagctctggccatcgccgctgacggtgctgttctggctgaaatggccaagctgtgcaacctgcctgctgcgtcgaacgaaaacattgccggtctgggccaagccgttgttctgaacatcggtgccgctgctgatctggtcgatgtcgaagctcgtggtaaagcgatcctgaagggcctgactctggctcgtgctcgcctgaccaagaactacgtccctgctggtgatcgtcgcttctactgcgccccagaagactacagcgcgatcctgtccgctctgatgccgaacgctgcgaactacgctgcgctgatcgacccagaaaccggcaacatccgcaacgtcatgggcttcgaggttatcgaagttcctcacctgaccgtgggtggcgctggcgacaacaacccagccgatggcgtggctccgaccaaccagaagcacatcttcccggctaccgctactggcgatgaccgtgttgctcagaacaacgtggtcggcctgttcaaccaccgttcggctgtcggcaccgtcaagctgaaagacatggctctggagcgcgctcgtcgccctgagttccaagctgaccagatcatcggcaagtacgcgatgggtcacggcggtctgcgtcctgaagctgctggtgcgctggtcttcaccccagccgcctaagtcgac；
21.p27基因的核苷酸序列如下：
22.atgtccgacatttatgccgagttcggcgtcaacggggcagtcatgtccagcaacaacatcaccgagcacgagcagaacatgctggctctgccgacctctgtccgtgatggcgatgagtccatcgagaccatcgacccagagact
gaagtcgagctgggcaccgagcaggatcaggagaccgatgtcgaggtcactgacaacgaagctggtgatggtgagaacgatgctgctgaagaaggcagcgaaaccgagttcaccccactgggcgagcctgatgctgagctggtcgaatccagccgtcagatcgacgagtacgccgaaggcttcagccagatgcgcgagcaagccatcaaggctggtctcagtgccgaagtggcggaccagatcgaagcagaatacgagcgtgacaaccagctctccgaggcgtccctgaaggcgctcgaagcggtgggctacagtcgcggtttcgttcgctccttcatcaacggtcaggaagctctggcgaacacctacgtggcccagattcaggcttacgctggtggccctgagaagttccaagcgatcctgtcgcacctcaatgcgacctctaaggacgccgtggcttctctcgaaaaggccatcgagtcgcaagacctgcacgccatcaagaccatcatcaacttgggcatggcgagccacaccaagaagttcggtaagacccctcaacgttcggtcaccaagcgtgccccagcatccccagcggctgcccgtaagagcaccgtcgagggcttcgcttcgcaacgcgagatgatcgctgcgatgtccgataagcgttaccaagatgacgcttcctaccgcgctcaagtcgaggcccgagtgggcgcttcgagctggtaa。
23.gh-1噬菌体病毒样颗粒自组装蛋白p28及p27的诱导表达方法如下：
24.(1)挑取tt-110单菌落，接种于10ml含氨苄(终浓度为0.1mg/ml)的lb液体培养液，于37℃、180rpm/min下过夜培养；
25.(2)按1:100的比例将过夜培养的菌液加入到500ml含氨苄(终浓度为0.1mg/ml)的lb液体培养液中，37℃、180rpm/min振荡培养；待菌液od
600nm
约0.6时加入终浓度为0.5mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，20℃、100rpm/min下诱导4h；
26.(3)诱导结束后，于4℃、18000g/min下离心20min，收集菌体，用等体积的磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤2次后，将菌体重悬于60ml含1mm pmsf蛋白酶抑制剂的pbs中；
27.(4)将步骤(3)制得的菌体悬液进行高压均质破碎，高压均质参数为：600bar，4℃，处理12min；高压均质后的菌悬液置于18000g、4℃离心40min，收集沉淀和上清液；
28.(5)利用sds-page测定高压均质沉淀和上清液中的目标蛋白。
29.见附图1，其中：m为blue plus protein maker，第1泳道为未诱导的菌液，第2泳道为未诱导的菌液，第3泳道为高压均质后的上清液，第4泳道为高压均质后的沉淀；其中p28基因表达的蛋白为36.8kda，p27基因表达的蛋白为31.5kda。
30.之后对gh-1噬菌体病毒样颗粒进行纯化，将高压均质后获得的离心上清液缓慢加入到35％蔗糖(w/v)垫层溶液中，随后100,000g、4℃超速离心1h；弃上清，沉淀用pbs重悬，得到gh-1噬菌体病毒样颗粒初提液；采用美国通用公司pure蛋白分离纯化系统对gh-1病毒样颗粒初提液进行纯化，具体步骤如下：
31.1)将gh-1病毒样颗粒初提液通过0.22μm微孔滤膜，收集滤液；
32.2)采用superdex
tm 200increase 10/300gl凝胶过滤层析柱对滤液进行纯化分离，流穿的液体即为gh-1噬菌体病毒样颗粒的纯化液。
33.收集蔗糖垫层超速离心后的上清液、gh-1噬菌体病毒样颗粒初提液及纯化液，通过sds-page凝胶电泳对gh-1噬菌体病毒样颗粒的纯化效果进行分析。见附图1，其中：第5泳道为蔗糖垫层超高速离心后的上清液，第6泳道为gh-1噬菌体病毒样颗粒初提液，第7泳道为gh-1噬菌体病毒样颗粒纯化液；可见本实施例成功共表达出了gh-1噬菌体衣壳蛋白p28和支架蛋白p27。
34.本实施例接下来对gh-1病毒样颗粒进行了形态鉴定及粒径分析，方法如下：取20μl gh-1病毒样颗粒纯化液，滴于铜网上，吸附3～5min后用滤纸吸去多余样品；使用磷钨酸
对铜网上的样本进行负染，室温晾干后采用透射电子显微镜对gh-1病毒样颗粒进行观察鉴定，见附图2所示，电镜图中的箭头部分即为gh-1噬菌体病毒样颗粒；应用动态光散射技术对gh-1病毒样颗粒进行粒径分析，结果表明其粒径在40nm-50nm之间，见附图3所示；可见本实施例成功共表达出的gh-1噬菌体衣壳蛋白p28和支架蛋白p27能成功组装出形状完整、大小均一的gh-1噬菌体病毒样颗粒。
35.在本实施例的制备方法的基础上可构建单独的gh-1噬菌体p28基因表达质粒和p27基因表达质粒，并在大肠杆菌内bl21(de3)体内诱导p28和p27蛋白表达，再置于合适的缓冲体系经体外自组装形成gh-1噬菌体病毒样颗粒。
36.如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。
技术特征：1.一种gh-1噬菌体病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，方法如下：将gh-1噬菌体p28基因克隆至petduet-1质粒mcs 1的bamh i/sal i双酶切位点中，获得含gh-1噬菌体p28基因的petduet-1-p28表达质粒，p28基因的核苷酸序列见seq id no：1；之后再将gh-1噬菌体p27基因克隆至petduet-1-p28表达质粒mcs 2的nde i/xho i双酶切位点中，获得gh-1噬菌体病毒样颗粒表达质粒petduet-1-p28-p27，p27基因的核苷酸序列见seq id no：2，将petduet-1-p28-p27质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)中，经氨苄抗性筛选获得gh-1噬菌体病毒样颗粒表达菌株tt-110，经诱导、表达、体内自组装和纯化后得到gh-1噬菌体病毒样颗粒。2.权利要求1所述的制备方法制备的gh-1噬菌体病毒样颗粒。3.权利要求2所述的gh-1噬菌体病毒样颗粒在制备嵌合病毒样颗粒疫苗及靶向药物的载体中的应用。
技术总结本发明涉及分子生物学基因工程领域，公开了一种GH-1噬菌体病毒样颗粒的制备方法及应用，将构建的GH-1噬菌体病毒样颗粒表达质粒pETDuet-1-p28-p27转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经氨苄抗性筛选获得GH-1噬菌体病毒样颗粒表达菌株TT-110，经诱导、表达、体内自组装和纯化后得到GH-1噬菌体病毒样颗粒；还公开了GH-1噬菌体病毒样颗粒的应用。本发明构建的质粒pETDuet-1-p28-p27在大肠杆菌BL21(DE3)中成功共表达出GH-1噬菌体衣壳蛋白P28和支架蛋白P27，并组装出形状完整、大小均一的GH-1噬菌体病毒样颗粒，组装成功的GH-1噬菌体病毒样颗粒可用以构建疫苗或作为药物的靶向生物包衣材料。料。料。
技术研发人员：唐田 杨加雪 汪川 朱娅岚 方楚斌
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：2022.05.20
技术公布日：2022/11/1
