一种精子形态学diff-quik染色液及其应用染色的方法
技术领域
1.本发明涉及一种精子形态学diff-quik染色液及其应用染色的方法，属于精子检测技术领域。
背景技术：2.世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册(第5版)推荐使用的精子形态学染色方法有巴氏染色法、shorr染色法或diff-quik染色法。用上述三种染色方法，在光学显微镜亮视野下观察，精子头部的顶体区染成淡蓝色，顶体后区染成深蓝色，中段可能染成略呈红色，尾部染成蓝色或淡红色。通常位于头部下部或围绕中段的过量残留胞浆染成粉红色、红色(巴氏染色)或者橘红色(shorr染色)。
3.巴氏染色法、shorr染色法用于精子染色耗时较长(固定4小时，染色约1小时)，操作复杂，而diff-quik染色法，操作步骤简便而且快速，耗时约1分钟。diff-quik染色法对于需要当天提供分析结果的临床实验室尤为适用。为此，需要开发一种精子形态学diff-quik染色液及其应用染色的方法。
技术实现要素：4.本发明的目的在于针对目前巴氏染色法、shorr染色法用于精子染色耗时较长，操作复杂，时间和人力成本较高的的问题，提供一种临床实验室操作简便、染色质量良好、成本低的精子形态学diff-quik染色液及其应用染色的方法。
5.为了实现上述目的，本发明提供了一种精子形态学diff-quik染色液，包括固定液、染色液a和染色液b；
6.所述固定液是含有结晶紫的组织固定液，用于固定精子形态学涂片以及染色精子头部；
7.所述染色液a是含曙红y的磷酸盐缓冲液，用于染色精子顶体区、颈部和中段以及尾部；
8.所述染色液b是含有天青a和亚甲基蓝的磷酸盐缓冲液，用于染色精子顶体后区。
9.优选地，所述固定液中结晶紫的含量为0.0001～0.001wt％，所述组织固定液选用甲醇、乙醇和醋酸中的至少一种；所述磷酸盐缓冲液中曙红y的含量为0.1～1wt％；所述磷酸盐缓冲液中天青a的含量为0.05～0.5wt％，亚甲基蓝的含量为0.05～0.5wt％。
10.优选地，所述磷酸盐缓冲液的ph为7.0～8.0，其中磷酸盐的含量0.02～0.2mol/l。
11.优选地，所述磷酸盐缓冲液中还包括防腐剂proclin 300，所述防腐剂proclin300的含量为0.02～0.1wt％。
12.本发明还提供了上述的精子形态学diff-quik染色液在制备检测精子形态的试剂盒中的应用。
13.本发明还提供了上述的精子形态学diff-quik染色液在非诊断目的的检测精子形态中的应用。
14.本发明还提供了一种非诊断目的的精子形态学diff-quik染色方法，采用上述的精子形态学diff-quik染色液进行染色，包括如下步骤：
15.步骤1：将新鲜精液标本完全液化，若标本液化迟缓或粘度过高，可用吸管慢速吹打精液标本促进其完全液化，吹打时避免挤入气体；
16.步骤2：在一张洁净的载玻片上，加入5～10μl液化后的精液涂制玻片(若精子浓度≥30
×
106/ml，取5μl精液；若精子浓度＜30
×
106/ml，应取10μl精液)；
17.步骤3：将步骤2制备好的精液玻片水平放置，空气中自然干燥；
18.步骤4：将步骤3所得的精液玻片依次在固定液中固定15秒、染色液a、染色液b中各染色15秒，然后流水冲洗10～15次以去除多余染色液；
19.步骤5：将步骤4所得的染色涂片自然干燥后直接或封片后在光学显微镜下观察染色结果。
20.优选地，当精子浓度＜2
×
106/ml、精子粘稠或含有杂质、或者需要做计算机辅助精子形态分析时，需要对精子进行洗涤后制片，具体方法包括：在室温下，取0.2～0.5ml精液加入10ml生理盐水，800g离心10分钟，去掉大部分的上清液，混匀剩下的部分(约50μl)，以生理盐水调整浓度不超过50
×
106/ml。
21.优选地，所述步骤2中，当精液粘稠度正常时(拉丝长度≤2cm)，用第二张载玻片的边缘在清洁载玻片表面向前推拉一滴精液；当精液粘稠度较高时(拉丝长度＞2cm)，滴一滴精液于一张载玻片的中央，然后将第二张载玻片表面朝下盖在其上，以使精液在两片之间扩散，轻拉使两片分开即可同时制得两张片子。
22.优选地，所述步骤4中固定、染色以及冲洗后均需将玻片垂直放在吸水纸上沥干多余的液体。
23.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
24.本发明的精子形态学染色液diff-quik染色液配方简单，原料成本低且易得，操作快捷，其应用于染色时整个染色过程1-2分钟即可完成，适于实验室样本的快速检测；形态学染色鲜艳，精子头部顶体区为淡紫红色，顶体后区为紫蓝色，中段和尾部为淡紫红色或淡蓝色，精子各部分染色区分效果良好，易于临床的广泛应用；采用防腐剂，试剂稳定性更好，贮存期长，有效期长达二年。
附图说明
25.图1为本发明的精子形态学diff-quik染色效果图。
具体实施方式
26.为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
27.实施例
28.一种精子形态学diff-quik染色液，包括固定液、染色液a和染色液b。
29.所述固定液是含有结晶紫的组织固定液，用于固定精子形态学涂片以及染色精子头部。优选的，所述固定液中结晶紫的含量为0.0002％。所述固定液中组织固定液选用甲醇。
30.所述染色液a是含曙红y的磷酸盐缓冲液，用于染色精子顶体区、颈部和中段以及
尾部。优选的，所述磷酸盐缓冲液中曙红y含量为0.15％。
31.所述染色液b是含有天青a、亚甲基蓝的磷酸盐缓冲液，用于染色精子顶体后区。优选的，所述磷酸盐缓冲液中天青a的含量为0.06％，亚甲基蓝的含量为0.07％。
32.优选的，所述磷酸盐缓冲液的ph为7.2-7.6，其中磷酸盐的含量为0.02mol/l。所述磷酸盐缓冲液中还包括防腐剂proclin 300，所述防腐剂proclin 300的含量为0.03％。
33.一种精子形态学快速染色的方法，包括如下步骤：
34.1.新鲜精液标本完全液化后立即制片。若标本液化迟缓或粘度过高，可用吸管慢速吹打(避免挤入气体)精液标本促进其完全液化。
35.2.当精子浓度低(＜2
×
106/ml)、粘稠或杂质很多、或者需要做计算机辅助精子形态分析时，需要对精子进行洗涤后制片，方法如下：
36.①
在室温下，将部分精液(0.2～0.5ml，取决于精子的浓度)加入10ml生理盐水。
37.②
800g离心10分钟，去掉大部分的上清液。
38.③
轻轻混匀剩下的部分(约50μl)，以生理盐水调整浓度不超过50
×
106/ml。
39.3.在一张洁净的载玻片上，加入5～10μl精液。若精子浓度≥30
×
106/ml，取5μl精液；若精子浓度＜30
×
106/ml，应取10μl精液。精液粘稠度正常时(拉丝长度≤2cm)，可以“拉薄”技术推片，用第二张载玻片的边缘在清洁载玻片表面向前推拉一滴精液。当精液粘稠度较高时(拉丝长度＞2cm)，滴一滴精液于一张载玻片的中央，然后将第二张载玻片表面朝下盖在其上，以使精液在两片之间扩散，轻拉使两片分开即可同时制得两张片子。
40.4.涂制好的玻片水平放置，空气中自然干燥。
41.5.在固定液中固定玻片15秒。将玻片垂直放在吸水纸上沥干。将固定后的精液涂片染色按照以下顺序将玻片浸入染缸进行染色。
42.1)玻片在染色液a中染色15秒
43.2)玻片在染色液b中染色15秒
44.3)流水冲洗10～15次以去除多余染色液
45.每一步都需将玻片垂直放在吸水纸上沥干多余的液体。
46.注：如果背景色很深，影响形态分析，需要洗涤精液(按步骤2操作)并重新制备涂片并染色。
47.6.染色后的涂片自然干燥后可以封片，也可以不封片。
48.7.普通光学显微镜100
×
物镜下观察精子的染色效果，如图1所示。
49.上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
技术特征：1.一种精子形态学diff-quik染色液，其特征在于，包括固定液、染色液a和染色液b；所述固定液是含有结晶紫的组织固定液，用于固定精子形态学涂片以及染色精子头部；所述染色液a是含曙红y的磷酸盐缓冲液，用于染色精子顶体区、颈部和中段以及尾部；所述染色液b是含有天青a和亚甲基蓝的磷酸盐缓冲液，用于染色精子顶体后区。2.如权利要求1所述的精子形态学diff-quik染色液，其特征在于，所述固定液中结晶紫的含量为0.0001～0.001wt％，所述组织固定液选用甲醇、乙醇和醋酸中的至少一种；所述磷酸盐缓冲液中曙红y的含量为0.1～1wt％；所述磷酸盐缓冲液中天青a的含量为0.05～0.5wt％，亚甲基蓝的含量为0.05～0.5wt％。3.如权利要求1所述的精子形态学diff-quik染色液，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的ph为7.0～8.0，其中磷酸盐的含量0.02～0.2mol/l。4.如权利要求3所述的精子形态学diff-quik染色液，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液中还包括防腐剂proclin 300，所述防腐剂proclin 300的含量为0.02～0.1wt％。5.权利要求1～4中任意一项所述的精子形态学diff-quik染色液在制备检测精子形态的试剂盒中的应用。6.权利要求1～4中任意一项所述的精子形态学diff-quik染色液在非诊断目的的检测精子形态中的应用。7.一种非诊断目的的精子形态学diff-quik染色方法，其特征在于，采用权利要求1～4中任意一项所述的精子形态学diff-quik染色液进行染色，包括如下步骤：步骤1：将新鲜精液标本完全液化，若标本液化迟缓或粘度过高，可用吸管慢速吹打精液标本促进其完全液化，吹打时避免挤入气体；步骤2：在一张洁净的载玻片上，加入5～10μl精液涂制玻片；步骤3：将步骤2制备好的精液玻片水平放置，空气中自然干燥；步骤4：将步骤3所得的精液玻片依次在固定液中固定15秒、染色液a、染色液b中各染色15秒，然后流水冲洗10～15次以去除多余染色液；步骤5：将步骤4所得的染色涂片自然干燥后直接或封片后在光学显微镜下观察染色结果。8.如权利要求7所述的非诊断目的的精子形态学diff-quik染色方法，其特征在于，当精子浓度＜2
×
106/ml、精子粘稠或含有杂质、或者需要做计算机辅助精子形态分析时，需要对精子进行洗涤后制片，具体方法包括：在室温下，取0.2～0.5ml精液加入10ml生理盐水，800g离心10分钟，去掉大部分的上清液，混匀剩下的部分，以生理盐水调整浓度不超过50
×
106/ml。9.如权利要求7所述的非诊断目的的精子形态学diff-quik染色方法，其特征在于，所述步骤2中，当精液拉丝长度≤2cm，用第二张载玻片的边缘在清洁载玻片表面向前推拉一滴精液；当精液拉丝长度＞2cm，滴一滴精液于一张载玻片的中央，然后将第二张载玻片表面朝下盖在其上，以使精液在两片之间扩散，轻拉使两片分开即可同时制得两张片子。10.如权利要求7所述的非诊断目的的精子形态学diff-quik染色方法，其特征在于，所述步骤4中固定、染色以及冲洗后均需将玻片垂直放在吸水纸上沥干多余的液体。
技术总结本发明公开了一种精子形态学Diff-Quik染色液及其应用染色的方法。本发明的染色液包括固定液、染色液A和染色液B；所述固定液是含有结晶紫的组织固定液，用于固定精子形态学涂片以及染色精子头部；所述染色液A是含曙红Y的磷酸盐缓冲液，用于染色精子顶体区、颈部和中段以及尾部；所述染色液B是含有天青A和亚甲基蓝的磷酸盐缓冲液，用于染色精子顶体后区。染色液配方简单，原料成本低且易得，操作快捷，其应用于染色时整个染色过程1-2分钟即可完成，适于实验室样本的快速检测；形态学染色鲜艳，精子各部分染色区分效果良好，易于临床的广泛应用。用。用。
技术研发人员：胡斌
受保护的技术使用者：上海北昂医药科技股份有限公司
技术研发日：2022.07.19
技术公布日：2022/11/1
