具有对l-薄荷醇的酯化活性和/或对l-薄荷醇酯的水解活性的多肽
技术领域
1.本发明涉及具有对l-薄荷醇的酯化活性和/或对l-薄荷醇酯的水解活性的多肽。更具体而言，本发明涉及具有对l-薄荷醇的酯化活性和/或对l-薄荷醇酯的水解活性、对l-薄荷醇和/或l-薄荷醇酯的底物特异性提高的多肽、编码该多肽的dna、重组载体、转化体、酶组合物、酶制剂、该多肽的制造方法、以及使用该多肽的l-薄荷醇酯的制造方法及l-薄荷醇的制造方法。
背景技术：2.l-薄荷醇由于具有清凉的风味及爽快的皮肤感觉等特性，所以为香料领域、食品领域、医药领域等中通用的重要物质。另外，薄荷醇的酯除了成为l-薄荷醇的原料以外，l-薄荷醇的酯本身也用于香料领域、食品领域、医药领域等。
3.这些成分工业上通过人工合成来制造。另一方面，合成而得到的l-薄荷醇及其酯中混杂有作为其光学异构体的d型。l-薄荷醇及其酯的品质均会由于d型的混入而受到大幅影响。因此，需要以高光学纯度得到l-薄荷醇及其酯。
4.作为光学选择性地得到l-薄荷醇及其酯的方法，可列举化学方法及酶学方法。作为化学方法，可列举使光学活性的酸或碱与dl-薄荷醇反应而使l型选择性地结晶的方法等。另外，作为酶学方法，可列举使脂肪酶在水性溶剂中作用于dl-薄荷醇酯而特异性地水解l型的方法、使脂肪酶在有机溶剂中作用于dl-薄荷醇而特异性地将l型酯化的方法等。
5.其中，对于酶学方法，正在从酶所具有的特异性高的角度进行各种研究。例如，在非专利文献1中记载了：利用来自皱褶假丝酵母的脂肪酶在水性介质中水解外消旋型月桂酸薄荷酯，优先得到l-薄荷醇(ee：70％)。这样的对映体选择性在用月桂酸将外消旋型薄荷醇酯化时也可被观察到。例如，利用来自皱褶假丝酵母的脂肪酶在非水性介质中利用月桂酸对外消旋型薄荷醇进行对映体选择性酯化，优先生成l-月桂酸薄荷酯(ee：95％)。
6.另外，在非专利文献2中记载了：利用来自皱褶假丝酵母的脂肪酶，通过特定对映体选择性地利用乙酸酐、丙酸酐及丁酸酐将外消旋型薄荷醇酯化、特别是在正己烷中利用丁酸酐来酯化而优先生成l-丁酸薄荷酯(ee：86％)。
7.进一步地，在非专利文献3中记载了：利用来自皱褶假丝酵母的脂肪酶，通过利用丙酸酐将外消旋型薄荷醇酯化，生成光学纯度非常高(ee：95％)的l-丙酸薄荷酯。现有技术文献非专利文献
8.非专利文献1:tetrahedron letters,vo1.27,no-l,pp 29-32,1986非专利文献2:enzyme and microbial technology volume 18,issue 7,1996,pp536-539非专利文献3:applied microbiology and biotechnology.1995,volume 43,issue 4,pp 639-643
技术实现要素：发明所要解决的技术问题
9.但是，l-薄荷醇和/或其酯的制造中得到的对映体选择性仍有改善的余地。
10.因此，本发明的目的在于，提供在l-薄荷醇和/或其酯的制造中能够进一步提高对l型的底物特异性的技术。用于解决技术问题的技术方案
11.本发明人进行了深入研究的结果是，着眼于来自洋葱伯克霍尔德菌(burkholderia cepacia)的脂肪酶的对映体选择性高，并且进一步对向该脂肪酶的各部位导入突变而得的840种以上脂肪酶突变体总括性地检验在l-薄荷醇和/或其酯的制造中对l型的底物特异性，结果发现由该脂肪酶的第120位的氨基酸残基被置换为甘氨酸残基的氨基酸序列构成的多肽和由第88位的氨基酸残基被置换为丙氨酸残基、甘氨酸残基、天冬氨酸残基、甲硫氨酸残基或亮氨酸残基的氨基酸序列构成的多肽能够提高对l型的底物特异性。本发明是基于该见解完成的。即，本发明提供下述所揭示的方式的发明。
12.项1.以下的(1)至(3)中任一项所示的多肽：(1)由在序列号1所示的氨基酸序列中第120位的氨基酸残基被置换为甘氨酸残基的氨基酸序列构成的多肽、(2)在序列号1所示的氨基酸序列中的第120位的氨基酸残基被置换为甘氨酸残基的氨基酸序列中，除了被导入了前述置换的氨基酸残基以外的1个或数个氨基酸残基发生了置换、添加、插入或缺失，具有对l-薄荷醇的酯化活性和/或对l-薄荷醇酯的水解活性，并且与由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽相比对l-薄荷醇和/或l-薄荷醇酯的底物特异性提高的多肽、(3)在序列号1所示的氨基酸序列中的第120位的氨基酸残基被置换为甘氨酸残基的氨基酸序列中，相对于序列号1所示的氨基酸序列的、除了被导入了前述置换的氨基酸残基以外的序列一致性为80％以上，具有对l-薄荷醇的酯化活性和/或对l-薄荷醇酯的水解活性，并且与由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽相比对l-薄荷醇和/或l-薄荷醇酯的底物特异性提高的多肽。项2.以下的(4)至(6)中任一项所示的多肽：(4)由在序列号1所示的氨基酸序列中第88位的氨基酸残基被置换为丙氨酸残基、甘氨酸残基、天冬氨酸残基、甲硫氨酸残基或亮氨酸残基的氨基酸序列构成的多肽、(5)在序列号1所示的氨基酸序列中的第88位的氨基酸残基被置换为丙氨酸残基、甘氨酸残基、天冬氨酸残基、甲硫氨酸残基或亮氨酸残基的氨基酸序列中，除了被导入了前述置换的氨基酸残基以外的1个或数个氨基酸残基发生了置换、添加、插入或缺失，具有对l-薄荷醇的酯化活性和/或对l-薄荷醇酯的水解活性，并且与由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽相比对l-薄荷醇和/或l-薄荷醇酯的底物特异性提高的多肽、(6)在序列号1所示的氨基酸序列中的第88位的氨基酸残基被置换为丙氨酸残基、甘氨酸残基、天冬氨酸残基、甲硫氨酸残基或亮氨酸残基的氨基酸序列中，相对于序列号1所示的氨基酸序列的、除了被导入了前述置换的氨基酸残基以外的序列一致性为80％以上，具有对l-薄荷醇的酯化活性和/或对l-薄荷醇酯的水解活性，并且与由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽相比对l-薄荷醇和/或l-薄荷醇酯的底物特异性提高的多肽。
项3.一种dna，其编码项1或2所述的多肽。项4.一种重组载体，其包含项3所述的dna。项5.一种转化体，其通过利用项4所述的重组载体转化宿主而得到。项6.一种权利要求1或2所述的多肽的制造方法，其包括培养项5所述的转化体的工序。项7.一种酶组合物，其包含项1或2所述的多肽。项8.一种酶制剂，其包含项1或2所述的多肽或项7所述的酶组合物。项9.一种l-薄荷醇酯的制造方法，其包括使项1或2所述的多肽、项7所述的酶组合物或项8所述的酶制剂作用于包含l-薄荷醇及d-薄荷醇的混合物而将l-薄荷醇酯化的工序。项10.一种l-薄荷醇的制造方法，其包括使项1或2所述的多肽、项7所述的酶组合物或项8所述的酶制剂作用于包含l-薄荷醇酯及d-薄荷醇酯的混合物而水解l-薄荷醇酯的工序。发明的效果
13.根据本发明，可提供在l-薄荷醇和/或其酯的制造中能够进一步提高对l型的底物特异性的技术。
具体实施方式
14.以下对本发明进行详细说明。需要说明的是，在序列表之外，氨基酸序列中的20种氨基酸残基有时以单字母符号来表示。即，甘氨酸(gly)为g、丙氨酸(ala)为a、缬氨酸(val)为v、亮氨酸(leu)为l、异亮氨酸(ile)为i、苯丙氨酸(phe)为f、酪氨酸(tyr)为y、色氨酸(trp)为w、丝氨酸(ser)为s、苏氨酸(thr)为t、半胱氨酸(cys)为c、甲硫氨酸(met)为m、天冬氨酸(asp)为d、谷氨酸(glu)为e、天冬酰胺(asn)为n、谷氨酰胺(gln)为q、赖氨酸(lys)为k、精氨酸(arg)为r、组氨酸(his)为h、脯氨酸(pro)为p。
15.本说明书中，所示的氨基酸序列中左端的n末端、右端的c末端。
16.本说明书中的“a120g”等表述为氨基酸置换的表示方法。例如，“a120g”表示特定的氨基酸序列中的n末端侧起第120位的氨基酸a被置换为了氨基酸g。
17.本说明书中，“非极性氨基酸”包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、及色氨酸。“非带电氨基酸”包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、及谷氨酰胺。“酸性氨基酸”包括天冬氨酸及谷氨酸。“碱性氨基酸”包括赖氨酸、精氨酸、及组氨酸。
18.本说明书中，“置换”不仅包括人为地导入氨基酸残基置换的情况，还包括通过自然方式而导入了氨基酸残基置换的情况，即原本氨基酸残基就不同的情况。本说明书中，氨基酸残基的置换可以为人为的置换，也可以为自然方式的置换，优选人为的置换。
19.1.多肽本发明的多肽为下述(1)至(3)中任一项所示的多肽、或下述(4)至(6)中任一项所示的多肽。
20.(1)由在序列号1所示的氨基酸序列中第120位的氨基酸残基(丙氨酸残基)被置换为甘氨酸残基的氨基酸序列构成的多肽、
(2)在序列号1所示的氨基酸序列中的第120位的氨基酸残基被置换为甘氨酸残基的氨基酸序列中，被导入了前述置换的氨基酸残基以外的1个或数个氨基酸残基发生了置换、添加、插入或缺失，具有对l-薄荷醇的酯化活性和/或对l-薄荷醇酯的水解活性，并且与由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽相比对l-薄荷醇和/或l-薄荷醇酯的底物特异性提高的多肽、(3)在序列号1所示的氨基酸序列中的第120位的氨基酸残基被置换为甘氨酸残基的氨基酸序列中，相对于序列号1所示的氨基酸序列的、除了被导入了前述置换的氨基酸残基以外的序列一致性为80％以上，具有对l-薄荷醇的酯化活性和/或对l-薄荷醇酯的水解活性，并且与由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽相比对l-薄荷醇和/或l-薄荷醇酯的底物特异性提高的多肽。
21.(4)由序列号1所示的氨基酸序列中第88位的氨基酸残基(谷氨酰胺残基)被置换为丙氨酸残基、甘氨酸残基、天冬氨酸残基、甲硫氨酸残基或亮氨酸残基的氨基酸序列构成的多肽、(5)在序列号1所示的氨基酸序列中的第88位的氨基酸残基被置换为丙氨酸残基、甘氨酸残基、天冬氨酸残基、甲硫氨酸残基或亮氨酸残基的氨基酸序列中，被导入了前述置换的氨基酸残基以外的1个或数个氨基酸残基发生了置换、添加、插入或缺失，具有对l-薄荷醇的酯化活性和/或对l-薄荷醇酯的水解活性，并且与由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽相比对l-薄荷醇和/或l-薄荷醇酯的底物特异性提高的多肽、(6)在序列号1所示的氨基酸序列中的第88位的氨基酸残基被置换为丙氨酸残基、甘氨酸残基、天冬氨酸残基、甲硫氨酸残基或亮氨酸残基的氨基酸序列中，相对于序列号1所示的氨基酸序列的、除了被导入了前述置换的氨基酸残基以外的序列一致性为80％以上，具有对l-薄荷醇的酯化活性和/或对l-薄荷醇酯的水解活性，并且与由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽相比对l-薄荷醇和/或l-薄荷醇酯的底物特异性提高的多肽。
22.前述(1)～(6)所示的多肽具有对l-薄荷醇的酯化活性和/或对l-薄荷醇酯的水解活性，并且具有针对l-薄荷醇和/或对l-薄荷醇酯的得到提高的底物特异性。优选前述(1)～(6)所示的多肽具有针对l-薄荷醇及l-薄荷醇酯的得到提高的底物特异性。
23.序列号1的多肽为来自洋葱伯克霍尔德菌(burkholderia cepacia)的野生型脂肪酶(成熟体)。
24.前述(1)～(6)的多肽不仅包括人为地进行置换而得到的多肽，还包括原本就具有这样的氨基酸序列的多肽。
25.在前述(1)的多肽及前述(4)的多肽中，还包括包含第120位的置换和第88位的置换这两者的多肽。
26.以下，有时也将前述(2)及(3)的多肽以及前述(5)及(6)中序列号1的第120位的氨基酸残基或第88位的氨基酸残基以外记载为“任意差异部位”。本说明书中，术语“任意差异部位”为只要对多肽的特性没有明显影响则允许不同的部位。另外，本说明书中，将与前述(1)或(4)的多肽相比在任意差异部位处氨基酸序列可观察到差异，但是具有与前述(1)或(4)的多肽同等程度或更高的对l-薄荷醇和/或l-薄荷醇酯的底物特异性的物质称为前述(1)或(4)的多肽的差异体。另外，前述多肽的差异体优选与前述(1)或(4)的多肽相比在任意差异部位处氨基酸序列可观察到差异，但是该多肽的特性实质上相同。需要说明的是，“实质上相同”是指具有对l-薄荷醇和/或l-薄荷醇酯的底物特异性。前述(2)及(3)的多肽为前述(1)的多肽的差异体，前述(5)及(6)的多肽为前述(4)的多肽的差异体。
27.前述(2)及(5)的多肽中的氨基酸的差异可以仅包括置换、添加、插入及缺失中的1种差异(例如置换)，也可以包含2种以上差异(例如置换和插入)。前述(2)及(5)的多肽中，任意差异部位处的氨基酸的差异的数量可以为1个或数个，可列举例如1～50个，优选列举1～20个、1～10个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、或1～4个，进一步优选列举1～3个，特别优选列举1或2个或者1个。
28.另外，前述(2)及(5)的多肽中，相对于序列号1所示的各氨基酸序列的、除前述氨基酸被置换的部位以外的序列一致性为80％以上即可，优选列举85％以上或90％以上，进一步优选列举95％以上、96％以上、97％以上、或98％以上，特别优选列举99％以上。
29.在此，前述(3)及(6)的多肽中，相对于序列号1所示的各氨基酸序列的、除前述氨基酸被置换的部位以外的序列一致性为：从序列号1所示的各氨基酸序列中仅抽取前述任意差异部位并且仅对该任意差异部位进行比较而计算出的序列一致性。另外，“序列一致性”表示利用blastpackage[sgi32 bit edition，version 2.0.12；available from national center for biotechnology information(ncbi)]的bl2seq program(tatiana a.tatsusova，thomas l.madden，fems microbiol.lett.，vol.174，p247-250，1999)得到的氨基酸序列的一致性的值。参数可以设为gap insertion cost value：11、gap extension cost value：1。
[0030]
认为前述(2)及(3)以及前述(5)及(6)的多肽中序列号1所示的氨基酸序列中的第87位(丝氨酸)、第264位(天冬氨酸)、第286位(组氨酸)的氨基酸有助于对l-薄荷醇的酯化活性和/或对l-薄荷醇酯的水解活性，因此希望不在这些部位导入置换或缺失。
[0031]
在对前述(2)及(3)以及前述(5)及(6)的多肽导入氨基酸置换的情况下，作为氨基酸置换的方式，可列举保守性置换。即，作为在(2)及(3)以及前述(5)及(6)的多肽相对于序列号1所示的氨基酸序列所导入的氨基酸置换，可列举例如：置换前的氨基酸的非极性氨基酸时置换为其它非极性氨基酸、置换前的氨基酸的非带电性氨基酸时置换为其它非带电性氨基酸、置换前的氨基酸的酸性氨基酸时置换为其它酸性氨基酸、及置换前的氨基酸的碱性氨基酸时置换为其它碱性氨基酸。
[0032]
前述(2)及(3)以及前述(5)及(6)的多肽中，“具有对l-薄荷醇的酯化活性和/或对l-薄荷醇酯的水解活性，与由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽相比对l-薄荷醇和/或l-薄荷醇酯的底物特异性提高的多肽”是指(i)具有对l-薄荷醇的酯化活性和/或对l-薄荷醇酯的水解活性，并且是指(ii-a)关于对l-薄荷醇的底物特异性，在下述试验例2的条件下测得的l-薄荷醇乙酸酯的光学纯度为由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽的光学纯度的1.007倍以上、优选为1.009倍以上、更优选为1.010倍以上、进一步优选为1.012倍以上(其中，将本发明的多肽和由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽的l-薄荷醇酯转化率统一到同等、具体为99～101％时)；(ii-b)关于对l-薄荷醇酯的底物特异性，在下述试验例1的条件下测得的向l-薄荷醇的转化率相对于向d-薄荷醇的转化率的比率(l/d转化率)为由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽的l/d转化率的1.05倍以上、优选为1.12倍以上、更优选为1.19倍以上、进一步优选为1.26倍以上、更进一层优选为1.32倍以上。
[0033]
2.dna
编码本发明的多肽的dna(以下，有时也记作“本发明的dna”)例如可通过向编码野生型脂肪酶的氨基酸序列(序列号1)的dna中导入前述氨基酸突变而得到。另外，本发明的dna也可以通过基因的全合成法而进行人工合成。
[0034]
编码由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽的dna已知例如序列号2所示的碱基序列，可以从洋葱伯克霍尔德菌(burkholderia cepacia)的m-12-33株的基因组dna中通过使用pcr的常规方法分离。
[0035]
向碱基序列的特定部位导入特定突变的方法是公知的，例如，可以利用dna的部位特异性突变导入法等。作为对dna中的碱基进行变换的方法，可列举例如使用市售的试剂盒(quickchange lightning site-directed mutagenesis kit：stratagene制造、kod-plus-mutagenesis kit：东洋纺制造等)等。
[0036]
向碱基序列中导入突变后的dna可以使用dna测序仪来确认碱基序列。一旦碱基序列确定，此后可通过化学合成、以克隆而得的探针为模板的pcr、或以具有该碱基序列的dna片段为探针的杂交来得到编码前述多肽的dna。
[0037]
另外，也可以通过定点诱变法等合成作为编码前述肽的dna的突变型的、与突变前具有同等功能的dna。需要说明的是，在向编码前述肽的dna导入突变时，可以通过kunkel法、gapped duplex法、大引物pcr法等公知方法来进行。
[0038]
本发明的dna优选优化了密码子利用频度以适合于宿主，更优选将密码子利用频度优化为适合于大肠杆菌的dna。
[0039]
作为表示密码子利用频度的指标，可以选择各密码子的宿主最适密码子利用频度的总计。最适密码子可定义为对应于同一氨基酸的密码子中利用频度最高的密码子。密码子利用频度只要优化为适合宿主则没有特别限定，例如，作为大肠杆菌的最适密码子的一例，可列举以下例子。f：苯丙氨酸(ttt)、l：亮氨酸(ctg)、i：异亮氨酸(att)、m：甲硫氨酸(atg)、v：缬氨酸(gtg)、y：酪氨酸(tat)、终止密码子(taa)、h：组氨酸(cat)、q：谷氨酰胺(cag)、n：天冬酰胺(aat)、k：赖氨酸(aaa)、d：天冬氨酸(gat)、e：谷氨酸(gaa)、s：丝氨酸(agc)、p：脯氨酸(ccg)、t：苏氨酸(acc)、a：丙氨酸(gcg)、c：半胱氨酸(tgc)、w：色氨酸(tgg)、r：精氨酸(cgc)、g：甘氨酸(ggc)。
[0040]
作为本发明的dna的例子，可列举包含序列号3、13～17所示的碱基序列的dna。由序列号3所示的碱基序列构成的dna编码前述(1)所述的、序列号1所示的多肽的氨基酸序列的第120位被置换为甘氨酸残基的多肽。由序列号13、14、15、16、及17所示的碱基序列构成的dna分别编码前述(4)所述的、序列号1所示的多肽的氨基酸序列的第88位的氨基酸残基被置换为丙氨酸残基、甘氨酸残基、天冬氨酸残基、甲硫氨酸残基、及亮氨酸残基的多肽。
[0041]
作为本发明的dna的其它例子，可列举：编码与由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽相比对l-薄荷醇和/或l-薄荷醇酯的底物特异性提高的多肽，与包含由序列号3、13～17分别示出的碱基序列构成的dna的互补碱基序列的dna在严谨的条件下杂交的dna。
[0042]
在此，“严谨的条件下”是指：在包含0.5％sds、5
×
denhartz’s〔denhartz’s、0.1％牛血清白蛋白(bsa)、0.1％聚乙烯基吡咯烷酮、0.1％ficoll400〕及100μg/ml鱼精dna的6
×
ssc(1
×
ssc为0.15m nacl、0.015m柠檬酸钠、ph7.0)中，在50℃～65℃下保温4小时～一晚的条件。
[0043]
严谨的条件下的杂交具体通过以下方法进行。即，制作固定有dna文库或cdna文库
的尼龙膜，在包含6
×
ssc、0.5％sds、5
×
denhartz’s、100μg/ml鱼精dna的预杂交溶液中在65℃下对尼龙膜进行封闭。然后加入用
32
p标记的各探针，在65℃下保温一晚。将该尼龙膜在6
×
ssc中在室温下洗涤10分钟、在包含0.1％sds的2
×
ssc中在室温下洗涤10分钟、在包含0.1％sds的0.2
×
ssc中在45℃下洗涤30分钟后，对放射自显影进行拍摄，由此能够检测与探针特异性地进行了杂交的dna。
[0044]
作为本发明的dna的另一例，可列举：编码与由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽相比对l-薄荷醇和/或l-薄荷醇酯的底物特异性提高的多肽、且与由序列号3、13～17分别示出的碱基序列构成的dna具有80％以上的同源性的dna。作为该同源性，优选列举85％以上或90％以上，进一步优选列举95％以上、96％以上、或97％以上，特别优选列举98％以上或99％以上。
[0045]
在此，dna的“同源性”可以使用具有将基准序列与查询序列进行比较的算法的、公开或市售的软件来计算。具体而言，可以使用blast、fasta、或genetyx(软件(
ソフトウエア
)开发株式会社制造)等，这些可以以默认参数的设定来使用。
[0046]
3.重组载体包含编码本发明的肽的dna的重组载体(以下，有时也记作“本发明的重组载体”)可通过向表达载体中插入本发明的dna来得到。
[0047]
本发明的重组载体中，包含与本发明的dna以可操作方式连结的启动子等控制因子。作为控制因子，代表例子可列举启动子，进而可根据需要包含增强子、ccaat框、tata框、spi位点等转录要素。另外，以可操作方式连结是指调节本发明的dna的启动子、框等各种控制因子与本发明的dna在宿主细胞中以可操作的状态连结。
[0048]
作为表达载体，优选由能够在宿主内自主增殖的噬菌体、质粒、或病毒以基因重组用途构建出的表达载体。这样的表达载体是公知的，例如，作为可商购获得的表达载体，可列举pqe系载体(株式会社qiagen)、pdr540、prit2t(ge healthcare bioscience株式会社)、pet系载体(默克株式会社)等。选择并使用表达载体与宿主细胞的合适组合即可，例如，以大肠杆菌为宿主细胞时，可优选列举pet系载体与dh5α大肠杆菌株的组合、pet系载体与bl21(de3)大肠杆菌株的组合、或pdr540载体与jm109大肠杆菌株的组合等。
[0049]
4.转化体通过使用本发明的重组载体转化宿主，从而可得到转化体(以下，有时也记作“本发明的转化体”)。
[0050]
作为制造转化体时使用的宿主，只要重组载体稳定且能够自主增殖且能够表达外源性基因的性状就没有特别限制，可列举例如大肠杆菌(escherichia coli)等属于埃希氏菌属的细菌、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)等属于芽孢杆菌属的细菌、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)等属于假单胞菌属等的细菌；酵母等作为优选例，此外可以为动物细胞、昆虫细胞、植物等。这些中，特别优选大肠杆菌。
[0051]
本发明的转化体可通过向宿主导入本发明的重组载体而得到，向宿主导入重组载体的条件可根据宿主的种类等适宜设定。宿主的细菌时，可列举例如使用利用钙离子处理而得的感受态细胞的方法及电穿孔法等。宿主的酵母时，可列举例如电穿孔法(electroporation method)、原生质体法及乙酸锂法等。宿主的动物细胞时，可列举例如电穿孔法、磷酸钙法及脂质体法等。宿主的昆虫细胞时，可列举例如磷酸钙法、脂质体法及电
穿孔法等。宿主的植物胞时，可列举例如电穿孔法、农杆菌法、基因枪法、及peg法等。
[0052]
本发明的重组载体是否整合于宿主的确认可通过pcr法、dan印迹杂交法、及rna印迹杂交法等来进行。
[0053]
在通过pcr法确认本发明的重组载体是否整合于宿主时，例如，可以从转化体中分离/纯化重组载体。
[0054]
关于重组载体的分离/纯化，例如在宿主的细菌时，可以基于裂解细菌而得到的溶菌物来进行。作为裂解方法，例如可利用溶菌酶等溶菌酶类来实施处理，可根据需要组合使用蛋白酶及其它酶、以及十二烷基硫酸钠(sds)等表面活性剂。
[0055]
进而还可以组合冻融及弗氏压碎处理之类的物理破碎方法。从溶菌物中分离、纯化dna例如可以通过将利用苯酚处理及蛋白酶处理等的除蛋白处理、核酸酶处理、醇沉淀处理以及市售的试剂盒适宜组合来进行。
[0056]
dna的切割可以按照常规方法、例如使用限制酶处理来进行。作为限制酶，例如使用作用于特定的核酸序列的ii型限制酶。dna与表达载体的连接例如使用dna连接酶进行。
[0057]
然后，将分离/纯化而得的dna作为模板，设计本发明dna特异性的引物并进行pcr。对于通过pcr得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳等，利用溴乙啶及sybr green液等染色，然后以条带来检测扩增产物，由此能够确认进行了转化。
[0058]
另外，也可以使用预先用荧光色素等标记的引物进行pcr来检测扩增产物。进而，也可以采用使扩增产物结合于微孔板等固相并通过荧光及酶反应等确认扩增产物的方法。
[0059]
5.多肽的制造方法本发明的多肽可以通过包括培养本发明的转化体的工序的制造方法得到。
[0060]
转化体的培养条件考虑宿主的营养生理性质适宜设定即可，优选列举液体培养。另外，在进行工业化制造时，优选通气搅拌培养。
[0061]
作为培养基的营养源，可使用转化体的生育所必需的营养源。作为碳源，只要为可同化的碳化合物即可，可列举例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜、丙酮酸等。
[0062]
作为氮源，只要为可同化的氮化合物即可，可列举例如蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、大豆粕碱提取物。
[0063]
除了碳源及氮源以外，可根据需要使用例如磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁、钙、钾、铁、锰及锌等盐类、特定的氨基酸以及特定的维生素等。
[0064]
培养温度可在本发明的转化体能够生育且本发明的转化体能够产生本发明的多肽的范围内适宜设定，优选为15～37℃左右。预测本发明的多肽达到最高收量的时期并在合适时期完成培养即可，通常培养时间的12～48小时左右。
[0065]
培养本发明的转化体，利用对培养液进行离心分离等方法回收培养上清或菌体，对菌体利用超声波及弗氏压碎之类机械方法或利用溶菌酶等溶菌酶类实施处理，根据需要使用蛋白酶等酶、十二烷基硫酸钠(sds)等表面活性剂进行增溶，可得到包含本发明的多肽的水溶性级分。
[0066]
另外，还可通过选择适当的表达载体和宿主使表达的本发明的多肽分泌到培养液中。
[0067]
如上得到的包含本发明的多肽的水溶性级分可以直接供于纯化处理，也可以将该
水溶性级分中的本发明的多肽浓缩后供于纯化处理。
[0068]
浓缩例如可以通过减压浓缩、膜浓缩、盐析处理、利用亲水性有机溶剂(例如甲醇、乙醇及丙酮)的分级沉淀法等进行。
[0069]
本发明的多肽的纯化处理例如可以通过将凝胶过滤、吸附色谱、离子交换色谱、亲和色谱等方法适宜组合来进行。
[0070]
前述纯化处理已经是公知的，可以参照适当的文献、杂志及教科书等来进行。这样纯化而得的本发明的多肽可以根据需要通过冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥等粉末化后在市场中流通。
[0071]
6.酶组合物本发明的多肽例如可以以共存有其它成分的组合物的形态提供。作为酶组合物的形态，可列举：本发明的多肽的制造过程中得到的、包含该多肽的培养液、从该培养液获得的包含该多肽的水溶性级分、或由该水溶性级分使该多肽的纯化度提高到任意水平的组合物；后述的“7.酶制剂”所示的酶制剂；将本发明的多肽用于l-薄荷醇和/或其酯的制造而得到的、包含未反应的该多肽的反应混合物等。
[0072]
作为酶组合物中所含的其它成分，可列举在酶组合物的制备过程中添加、产生或混入的任意的成分，例如，可列举：来自本发明的多肽的制造中使用的培养基的杂蛋白成分和/或蛋白质以外的成分；后述的“7.酶制剂”中所示的添加剂或基剂；l-薄荷醇和/或其酯的制造中得到的反应混合物中所含的未反应原料及生成物等。
[0073]
前述酶组合物另外还可以包含其它酶。作为其它酶，可列举例如淀粉酶(α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶)、葡糖苷酶(α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶)、半乳糖苷酶(α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶)、蛋白酶(酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶)、肽酶(亮氨酸肽酶、氨肽酶)、脂肪酶、酯酶、纤维素酶、磷酸酶(酸性磷酸酶、碱性磷酸酶)、核酸酶、脱氨酶、氧化酶、脱氢酶、谷氨酰胺酶、果胶酶、过氧化氢酶、葡聚糖酶、转谷氨酰胺酶、蛋白质脱酰胺酶、普鲁兰酶等。
[0074]
作为前述酶组合物中的本发明的多肽的含量，没有特别限定，可优选列举在前述酶组合物的总蛋白质中为10质量％以上，更优选列举在前述酶组合物的总蛋白质中为30质量％以上。前述酶组合物的形态没有特别限定，可列举例如液体、粉末、颗粒等。前述酶组合物可以通过通常公知的方法或后述的“8-3.l-薄荷醇酯的制造方法”中所示的方法来制备。
[0075]
7.酶制剂本发明的多肽、或包含本发明的多肽的酶组合物例如可以以酶制剂的形态提供。酶制剂是为了将本发明的多肽用于后述的“8.用途”而制备的酶组合物，包含本发明的多肽作为有效成分。酶制剂中，除了本发明的多肽以外还可以含有赋形剂、缓冲剂、悬浮剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水、溶剂等添加剂或基剂。作为赋形剂，可使用淀粉、糊精、麦芽糖、海藻糖、乳糖、d-葡萄糖、山梨醇、d-甘露醇、白糖、甘油等。作为缓冲剂，可使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为稳定剂，可使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可使用苯酚、苯扎氯铵、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可使用乙醇、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。进而，酶制剂中，可以在不影响本发明的效果的程度内包含其它成分(例如在作为有效成分的多肽的产生过程中添加、产生或混入的任意成分等)。作为前述酶制剂中的前述多肽的含量，可在前述多肽可发挥效果的范围内适宜设定。
[0076]
8.用途本发明的多肽可用于需要对l-薄荷醇的酯化处理、及对l-薄荷醇酯的水解处理的用途。作为需要对l-薄荷醇的酯化处理的用途，可列举l-薄荷醇酯的制造，作为需要对l-薄荷醇酯的水解处理的用途，可列举l-薄荷醇的制造。作为这些用途的更具体的例子，可列举：香料化合物的制造；饮食品、化妆品、医药品、或准药品的添加剂的制造；化妆品、医药品、或准药品的有效成分的制造；化妆品、医药品、或准药品的有效成分的中间体的制造等。
[0077]
8-1.底物成为本发明的多肽的底物的l-薄荷醇和/或l-薄荷醇酯作为香料化合物；饮食品、化妆品、医药品、或准药品的添加剂；化妆品、医药品、或准药品的有效成分；化妆品、医药品、或准药品的有效成分的中间体等是公知的。
[0078]
l-薄荷醇为(1r,2s,5r)-5-甲基-2-(1-乙基乙基)环己醇。l-薄荷醇酯只要为l-薄荷醇与羧酸的酯就没有特别限定，具体可列举下式(1)所示的化合物。
[0079]
[化学式1]
[0080]
式(1)中，r1表示直链状或支链状的碳数1～20、优选碳数1～6的烷基、碳数3～8的环烷基、碳数6～14的芳基、碳数7～15的芳烷基、碳数1～20的烷氧基、或碳数1～20的烷基氨基。上述烷基、上述环烷基、上述芳基、上述芳烷基、上述烷氧基的烷基、上述烷基氨基的烷基可以未取代也可以发生了取代，作为发生了取代时的取代基，可列举羟基、甲酰基、碳数1～6的烷氧基、羧基、巯基、磺基、氨基、碳数1～6的烷基氨基、硝基、卤素基。
[0081]
作为l-薄荷醇酯的优选例，可列举乙酸-l-薄荷酯、苯甲酸-l-薄荷酯、异戊酸-l-薄荷酯、乳酸-l-薄荷酯、琥珀酸-l-薄荷酯、丙酸-l-薄荷酯、丁酸-l-薄荷酯等，优选列举乙酸-l-薄荷酯。
[0082]
8-2.多肽的使用方式作为本发明的多肽的使用方式，没有特别限定，可列举游离多肽的方式、及固定化多肽的方式。固定化多肽为将本发明的多肽按照常规方法固定于载体(例如离子交换树脂、多孔性树脂、陶瓷、碳酸钙等)而成的使用方式。
[0083]
另外，作为本发明的多肽，可以单独使用1种，也可以将多种组合使用。
[0084]
8-3.l-薄荷醇酯的制造方法本发明的l-薄荷醇酯的制造方法包括使上述本发明的多肽、上述本发明的酶组合物、或上述本发明的酶制剂(以下，记作“本发明的多肽等”。)作用于包含l-薄荷醇及d-薄荷醇的混合物而将l-薄荷醇酯化的工序。
[0085]
本发明的l-薄荷醇酯的制造方法中，本发明的多肽等优选以多肽被固定于载体的固定化多肽的方式使用。
[0086]
需要说明的是，本发明的多肽等不仅提高对l-薄荷醇的底物特异性，而且相较于
其酯交换活性值，可实现优异的l-薄荷醇的酯转化率。因此，用于l-薄荷醇酯的制造方法的本发明的多肽等即使其酯交换活性值低于序列号1的野生型脂肪酶的酯交换活值，也发挥高效的l-薄荷醇的酯转化率。从这样的观点出发，本发明的多肽等的酯交换活性值以相对于等质量的序列号1的野生型脂肪酶的酯交换活值的比率(酯交换活性值的比率)计可以为例如0.3～0.8倍、优选为0.45～0.7倍、更优选为0.55～0.6倍。(酯交换活性值的比率的导出方法)以苯乙醇(20重量份)和乙酸乙烯酯(80重量份)为底物，使序列号1的野生型脂肪酶或本发明的改良型脂肪酶在30℃下作用20分钟，由此进行酯交换反应。通过hplc分析来定量所得到的乙酸苯乙醇酯。将把由野生型脂肪酶得到的乙酸苯乙醇酯的量(野生型脂肪酶的酯交换活性值)设为1时的、由本发明的改良型脂肪酶得到的乙酸苯乙醇酯的量(本发明的改良型脂肪酶的酯活性值)作为酯交换活性值的比率。
[0087]
本发明的多肽等相对于l-薄荷醇1g可以使用例如0.01～200mg、优选0.03～20mg、更优选0.05～1mg。
[0088]
作为酰化剂，可列举例如通式r2cooh所示的羧酸及其酯，作为该酯，可列举通式r2coor3所示的羧酸烷基酯、通式r2cooch＝ch2所示的羧酸乙烯酯等。
[0089]
上述通式中，r2表示直链状或支链状的碳数1～20、优选碳数1～6的烷基、碳数3～8的环烷基、碳数6～14的芳基、碳数7～15的芳烷基、碳数1～20的烷氧基、或碳数1～20的烷基氨基，r3表示直链状或支链状的碳数1～20、优选碳数1～6的烷基。上述烷基、上述环烷基、上述芳基、上述芳烷基、上述烷氧基的烷基、上述烷基氨基的烷基可以未取代也可以发生了取代，作为发生了取代时的取代基，可列举羟基、甲酰基、碳数1～6的烷氧基、羧基、巯基、磺基、氨基、碳数1～6的烷基氨基、硝基、卤素基。这些酰化剂可以单独使用1种，也可以将多种组合使用。
[0090]
本发明的l-薄荷醇酯的制造方法中。可以使本发明的多肽等与酰化剂一起作用于包含l-薄荷醇及d-薄荷醇的混合物。作为酰化剂的优选例，可列举羧酸的酯，更优选列举羧酸乙烯酯，进一步优选列举乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、己酸乙烯酯、正辛酸乙烯酯、癸酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、肉豆蔻酸乙烯酯、棕榈酸乙烯酯、硬脂酸乙烯酯、新戊酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯、异戊酸乙烯酯、乙酸酐、丁酸乙烯酯、氯代乙酸乙烯酯、丙酸酐等，更加优选列举乙酸乙烯酯。
[0091]
酰化剂相对于l-薄荷醇1摩尔可以使用例如0.5～3摩尔、优选0.8～2摩尔、更优选1～1.5摩尔、进一步优选1.1～1.3摩尔。
[0092]
本发明的l-薄荷醇酯的制造方法中，包含l-薄荷醇及d-薄荷醇的混合物中使用的溶剂为非水溶剂。非水溶剂是实质上不含水的有机溶剂，作为这样的有机溶剂，可列举：戊烷、己烷、庚烷、辛烷等烃系溶剂；乙醚、甲基叔丁基醚、丁醚、四氢呋喃等醚系溶剂；甲苯、二甲苯、苯等芳香族系溶剂；二氯甲烷、氯仿等卤素系溶剂。这些有机溶剂中，优选列举烃系溶剂，更优选列举庚烷。这些有机溶剂可以单独使用1种，也可以将多种组合使用。需要说明的是，实质上不含水是指：除了完全不含水的情况以外，也允许包含不影响酯化反应的程度的微量水的情况，作为微量水的具体的量，可列举例如：由于溶剂保存环境等中的湿气混入而得到的程度的微量的水分量，作为具体例，可列举1000ppm以下、优选500ppm以下。
[0093]
作为这些溶剂的使用量，只要为能够完全溶解包含l-薄荷醇及d-薄荷醇的混合物
的量即可，例如，相对于l-薄荷醇及d-薄荷醇的总重量1g，可列举例如0.3～3ml、优选0.5～2ml、更优选0.8～1.5ml。
[0094]
作为本发明的l-薄荷醇酯的制造方法中的具体操作，只要能够构建使包含l-薄荷醇及d-薄荷醇的混合物、酰化剂和本发明的多肽等共存的酯交换体系就没有特别限定，例如，可以在上述溶剂中溶解l-薄荷醇及d-薄荷醇(dl-薄荷醇(外消旋体))，向其中加入酰化剂并混合，再混合本发明的多肽等。酯交换体系可对l-薄荷醇及d-薄荷醇中的l-薄荷醇进行特异性地酯交换。
[0095]
本发明的多肽对l-薄荷醇的底物特异性优异，因此本发明的l-薄荷醇酯的制造方法即使l-薄荷醇的酯化交换率较高(即，酯交换体系中存在大量d-薄荷醇)也能够得到光学纯度高的l-薄荷醇酯。从该观点出发，本发明的l-薄荷醇酯的制造方法中，使上述酯交换体系中的反应结束的时机可以设为l-薄荷醇的酯化交换率达到80％以上、85％以上、90％以上、93％以上、或95％以上的时机。另外，作为l-薄荷醇的酯化交换率的范围的上限，没有特别限定，从得到高光学纯度的观点出发，可以设为例如达到99％以下、优选97％以下、更优选或96％以下的时机。
[0096]
得到的l-薄荷醇酯可以通过分级提取、分级蒸馏、柱色谱等来纯化。
[0097]
如此得到的l-薄荷醇酯可以制成l-薄荷醇酯而用作香料化合物；饮食品、化妆品、医药品、或准药品的添加剂；化妆品、医药品、或准药品的有效成分；化妆品、医药品、或准药品的有效成分的中间体等，进而可以用作l-薄荷醇的原料。在将用本发明的l-薄荷醇酯得到的l-薄荷醇酯作为l-薄荷醇的原料使用时，l-薄荷醇可通过利用酸或碱进行化学水解来制造。
[0098]
8-4.l-薄荷醇的制造方法本发明的l-薄荷醇的制造方法包括使上述本发明的多肽、上述本发明的酶组合物、或上述本发明的酶制剂(本发明的多肽等)作用于包含l-薄荷醇酯及d-薄荷醇酯的混合物而水解l-薄荷醇酯的工序。
[0099]
本发明的l-薄荷醇的制造方法中，本发明的多肽等优选以游离多肽的方式使用。
[0100]
需要说明的是，本发明的多肽等不仅提高对l-薄荷醇酯的底物特异性，而且相较于其脂肪酶活性值，可实现优异的l-薄荷醇转化率。因此，l-薄荷醇的制造方法使用的本发明的多肽等即使其脂肪酶活性值低于序列号1的野生型脂肪酶的脂肪酶活性值，也发挥高效的l-薄荷醇转化率。从这样的观点出发，本发明的多肽等的脂肪酶活性值以相对于等质量的序列号1的野生型脂肪酶的脂肪酶活性值的比率(脂肪酶活性值的比率)计可以为例如0.1～0.95倍、优选0.2～0.9倍、更优选0.3～0.8倍、进一步优选0.4～0.7倍、更加优选0.5～0.6倍。(脂肪酶活性值的比率的导出方法)脂肪酶活性值可使用脂肪酶试剂盒s(ds pharmabiomedical株式会社通过以下的步骤来测定。将试剂盒附带的显色液1ml、试剂盒附带的酯酶抑制液20μl、试剂盒附带的缓冲液1ml、试剂盒附带的底物液100μl及水8ml混和，由此制备活性测定溶液。在活性测定溶液100μl中，加入将序列号1的野生型脂肪酶或本发明的多肽用20mm磷酸钾缓冲液(ph7.0)稀释为适当的浓度的酶溶液10μl，测定在37℃下反应15分钟后的吸光度412nm。空白(对照组)中，使用20mm磷酸钾缓冲液(ph7.0)代替酶溶液。计算出将野生型脂肪酶或本发明的多
肽与空白的吸光度差乘以系数1.3和稀释倍数而得的值来作为脂肪酶活性值(u/ml)，计算将由野生型脂肪酶得到的值设为1时的、由本发明的改良型脂肪酶得到的值的比率。
[0101]
本发明的多肽等相对于l-薄荷醇酯1g可以使用例如0.1～1000mg、优选1～100mg。另外，相对于l-薄荷醇酯1g，可以以脂肪酶活性计以达到例如500～50000u、优选1000～30000u的方式使用本发明的多肽。
[0102]
本发明的l-薄荷醇的制造方法中，包含l-薄荷醇酯及d-薄荷醇酯的混合物中使用的溶剂至少包含水。进而，该溶剂中除了水以外还可以混合有有机溶剂，作为这样的有机溶剂，可列举：戊烷、己烷、庚烷、辛烷等烃系溶剂；乙醚、甲基叔丁基醚、丁醚、四氢呋喃等醚系溶剂；甲苯、二甲苯、苯等芳香族系溶剂；二氯甲烷、氯仿等卤素系溶剂；甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇等醇系溶剂；丙酮、甲乙酮、甲基异丁基酮等酮系溶剂。这些有机溶剂可以单独使用1种，也可以将多种组合使用。
[0103]
另外，作为反应温度，可列举例如10～50℃、优选20～45℃、更优选30～40℃、进一步优选33～38℃。
[0104]
作为本发明的l-薄荷醇的制造方法中的具体操作，只要能够构建使包含l-薄荷醇酯及d-薄荷醇酯且包含水的混合物与本发明的多肽等共存的水解体系就没有特别限定，例如，可以在上述溶剂中混合l-薄荷醇酯及d-薄荷醇酯(dl-薄荷醇酯(外消旋体))，再混合本发明的多肽等。水解体系可特异性地水解l-薄荷醇酯及d-薄荷醇酯中的l-薄荷醇酯。
[0105]
本发明的多肽对l-薄荷醇酯的底物特异性优异，因此本发明的l-薄荷醇的制造方法即使对l-薄荷醇的交换率较高，也能够得到光学纯度高的l-薄荷醇。
[0106]
得到的l-薄荷醇可通过利用分级提取、分级蒸馏、柱色谱等除去未反应物来纯化。实施例
[0107]
以下列举实施例具体说明本发明，但是本发明不限于以下实施例来解释。
[0108]
[试验例1：水解中的、对l-薄荷醇酯的底物特异性-1][分别使用1-1.乙酸-d-薄荷酯及乙酸-l-薄荷酯作为底物的情况]本试验例中，使来自洋葱伯克霍尔德菌的脂肪酶(ps脂肪酶)或其各种突变体(游离酶)分别与作为底物的乙酸-d-薄荷酯(纯度98％以上、东京化成工业株式会社制、油状、d＝0.9250～0.9280)和乙酸l-薄荷酯(纯度98％以上、东京化成工业株式会社制造、油状、d＝0.9250～0.9280)反应，用气相色谱分析所得到的各反应生成物，从而调查水解中的、对l-薄荷醇酯的底物特异性。
[0109]
作为来自洋葱伯克霍尔德菌的脂肪酶的突变体，制备了表1记载的突变体。具体而言，通过下述方法制备了包含各突变体的酶提取液。
[0110]
(大肠杆菌表达用质粒的构建)构建大肠杆菌表达系统时，全合成了将洋葱伯克霍尔德菌m12-33的各基因(lipa；脂肪酶lipa基因(大肠杆菌密码子优化)：序列号4、lipx；伴侣基因(lipx)野生型：序列号5)以适合于大肠杆菌表达用方式进行了密码子优化的基因。
[0111]
以全合成的结构基因(lipa；序列号4)为模板进行pcr扩增(primestar gxl dna聚合酶(takara))，利用引物(正向引物：5'-ttttccatggctcgttctatgcgttctcg-3'：序列号6、反向引物：5'-aaaaaagcttaaacacccgccagtttcagacgg-3'：序列号7))添加接头序列(nco i，hind iii)后进行纯化(nucleospin gel and pcr clean-up(macherey-nagel))，获得基因
片段(bcl-lipa)。
[0112]
将基因片段(bcl-lipa)及petduet-1(novagen)用限制酶(nco i(takara)，hind iii(takara))处理后进行连接(dna ligation kit＜mighty mix＞(takara))，转化于大肠杆菌dh5α(takara)，获得大肠杆菌bcl-lipa。从大肠杆菌bcl-lipa提取质粒时，接种于lb broth base(invitrogen)+amp：100μg/ml：5ml并进行振荡培养(37℃、16h、140rpm)，然后使用nucleospin plasmid easypure(macherey-nagel)进行，由此获得质粒(petbcl-lipa)。
[0113]
对于伴侣基因(lipx)也进行同样的操作。即，制成全合成的伴侣基因(以lipx；伴侣基因lipx(大肠杆菌密码子优化：序列号8)作为模板进行pcr扩增(利用引物(正向引物：5'-ttttcatatgaccgcacgtgaaggtcgcgc-3'：序列号9、反向引物：5'-aaaactcgagttactgtgcagaacccgcaccg-3'：序列号10)添加接头序列(nde i，xho i)后进行纯化(nucleospin gel and pcr clean-up(macherey-nagel))，获得基因片段(bcl-lipx)。
[0114]
将基因片段(bcl-lipx)及petbcl-lipa用限制酶(ndei(takara)，xho i(takara))处理后进行连接，转化于大肠杆菌dh5α，由此获得大肠杆菌bcl-lipax。从大肠杆菌bcl-lipax提取质粒时，接种于lb broth base+amp：100μg/ml：5ml并进行振荡培养(37℃、16h、140rpm)，然后用nucleospin plasmid easypure(macherey-nagel)进行，由此获得大肠杆菌表达质粒(petbcl-lipax)。
[0115]
(大肠杆菌表达系统的构建)将获得的大肠杆菌表达质粒(petbcl-lipax)转化于大肠杆菌bl21(de3)(nippongene)，获得大肠杆菌表达菌株：大肠杆菌bl21(bcl-lipax)。
[0116]
(随机突变株的制作)为了对突变导入点制作饱和突变文库而设计了引物。
[0117]
·
a120x引物：(正向引物：5'-nnkgatttcgttcagggcgttctggc-3'：序列号11、反向引物：5'-gaattcagaaccgcgatgcggagtg-3'：序列号12)
[0118]
向突变点导入突变时，以质粒(petbcl-lipax)为模板通过使用primer的pcr扩增(primestar gxl dna聚合酶(takara))进行。pcr扩增后，使用dpn i(takara)进行模板质粒的处理(37℃、16h)，并且使用t4聚合酶(toyobo)、ligation high(toyobo)进行连接反应(16℃、o/n)，然后转化于大肠杆菌bl21(de3)，获得在突变点导入了随机突变的随机突变株(大肠杆菌bl21(bcl-a120x))。
[0119]
(使用teriffic broth(amp：100μg/ml)制作突变文库)为了对于突变点制作突变株文库，将上述筛选出的突变株接种于teriffic broth(invitrogen)(amp：100μg/ml)：1ml后，用振荡培养机(taitec)进行振荡培养(33℃、48h)。酶表达的诱导通过在培养：24h小时时以终浓度0.1mm的方式向培养液中添加iptg来进行。培养后通过离心分离(3300g
×
15min、4℃)回收菌体，然后使用b-per(thermofisher)进行溶菌处理(25℃、1000rpm)后进行离心分离(3300g
×
15min、4℃)，回收上清，获得包含改良型脂肪酶的酶提取液。
[0120]
将得到的包含改良型脂肪酶的酶提取液200μl(以脂肪酶活性计以达到10～200u的范围来使用。溶剂为水。另外，蛋白质浓度为约20mg/ml。)和底物12μl加入到反应容器(96孔板)并混合，使用孔板振荡机在35℃、1000rpm、72小时的条件下进行水解。需要说明的是，
以蛋白质浓度为约20mg/ml将野生型的脂肪酶和底物12μl加入到反应容器(96孔板)中并混合，使用孔板振荡机在35℃、1，000rpm、72小时的条件下进行水解。
[0121]
(脂肪酶活性值的比率的测定方法)脂肪酶活性值使用脂肪酶试剂盒s(dspharmabiomedical株式会社)按照以下的步骤来测定。将试剂盒附带的显色液1ml、试剂盒附带的酯酶抑制液20μl、试剂盒附带的缓冲液1ml、试剂盒附带的底物液100μl、及水8ml混和，由此制备活性测定溶液。向活性测定溶液100μl中加入将序列号1的野生型脂肪酶或本发明的多肽用20mm磷酸钾缓冲液(ph7.0)稀释成适当浓度的酶溶液10μl，在37℃下测定反应15分钟后的吸光度412nm。空白中，使用20mm磷酸钾缓冲液(ph7.0)代替酶溶液。计算将野生型脂肪酶或本发明的多肽与空白的吸光度差乘以系数1.3和稀释倍数而得的值，作为脂肪酶活性值(u/ml)，计算将由野生型脂肪酶得到的值设为1时的、由本发明的改良型脂肪酶得到的值的比率。
[0122]
将反应混合液转移到1.5mleppendorf管，添加6m的盐酸溶液12μl及庚烷200μl，通过涡旋混合器混和后进行离心分离(15000rpm、10min、25℃)，将庚烷层(上层)150μl回收到用于仪器分析的管型瓶，由此进行反应生成物的提取。向得到的庚烷层中再加入庚烷150μl而进行稀释，由此制备分析样品300μl。
[0123]
将分析样品300μl在以下条件下供于气相色谱，基于色谱峰面积分析残存原料及反应生成物的量。(气相色谱分析条件)色谱柱：cp-chiral-dex cb(0.25mmid
×
25m，j&w)注入量：1μl注入口温度：200℃注入法：分流1：100载气：he流速：1.3ml/分钟柱温箱：130℃，8分钟检测器：fid，300℃(h2：40ml/分钟，o2：400ml/分钟)
[0124]
基于下式计算使用乙酸-l-薄荷酯作为底物时的l-薄荷醇转化率。将结果示于表1。[数学式1]
[0125][0126]
对于使用乙酸-d-薄荷酯作为底物的情况，与上述式同样地计算d-薄荷醇转化率(％)，基于下式计算l/d转化率比率(对l型的底物特异性)。将结果示于表1。
[0127]
[数学式2]
[0128]
[表1]
[0129]
由表1可知，ps脂肪酶(野生型；比较例1)的第120位突变体中，仅a120g突变体(实施例1)可观察到明显高于野生型的对l型的底物特异性。另外可知，a120g突变体的l-薄荷醇的转化率也优异。
[0130]
[1-2.使用乙酸-dl-薄荷酯作为底物的情况]作为酶，使用野生型脂肪酶(比较例1)或本发明的改良型脂肪酶(实施例1)，将底物变更为乙酸-dl-薄荷酯(纯度98％以上、东京化成工业株式会社制、油状、d＝0.9250～0.9280)，除此以外与上述项目1-1同样地进行水解分解。
[0131]
另外，测定等质量的野生型脂肪酶(比较例1)及本发明的改良型脂肪酶(实施例1)的脂肪酶活性值，导出其比率。将结果示于表2所示。
[0132]
[表2] ps脂肪酶脂肪酶活性比率比较例1野生型1实施例1a120g0.54
[0133]
使用乙酸-dl-薄荷酯作为底物时的l-薄荷醇光学纯度基于下式来计算。将结果示于表3。
[0134]
[数学式3]
[0135]
[表3]
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ps脂肪酶l型转化率(％)光学纯度(％e.e.)比较例1野生型12.696.4实施例1a120g48.397.5
[0136]
由表3可知，本发明的改良型脂肪酶(实施例1)与野生型脂肪酶(比较例1)相比，虽然l型转化率高但是可观察到光学纯度的提高。另外，如表2所示，本发明的改良型脂肪酶(实施例1)与野生型脂肪酶(比较例1)相比，虽然脂肪酶活性本身大幅下降，但是观察到表3所示那样的l型转化率提高。
[0137]
[试验例2：酯交换反应中的、对l-薄荷醇的底物特异性]本试验例中，使将来自洋葱伯克霍尔德菌的脂肪酶(ps脂肪酶)的第120位的a变为g的突变体(固定型酶)与作为底物的dl-薄荷醇(纯度98％以上、东京化成工业株式会社制、外消旋体、固体状)反应，用气相色谱对得到的反应生成物进行分析，由此调查酯交换反应中的、对l-薄荷醇的底物特异性。
[0138]
将来自洋葱伯克霍尔德菌的脂肪酶(ps脂肪酶)的第120位的a变为g的改良型脂肪酶按照常规方法固定在载体(二氧化硅粒子)上而得到固定化酶(实施例2)。另外，对于野生型脂肪酶，也同样地进行了固定化，得到固定化酶(比较例20)。需要说明的是，得到的固定化酶中野生型脂肪酶或改良型脂肪酶占0.2～2重量％左右。
[0139]
通过以下方法测定等质量的野生型脂肪酶的固定化酶(比较例20)和改良型脂肪酶的固定化酶(实施例2)的酯交换活性值的比率。将结果示于表4。(酯交换活性值比率的测定方法)将苯乙醇(20重量份)和乙酸乙烯酯(80重量份)作为底物，使各固定化酶在30℃下作用20分钟而进行酯交换反应。通过hplc分析对得到的乙酸苯乙醇酯进行定量。将把由野生型脂肪酶得到的乙酸苯乙醇酯的量(野生型脂肪酶的酯交换活性值)设为1时的、由本发明的改良型脂肪酶得到的乙酸苯乙醇酯的量(本发明的改良型脂肪酶的酯活性值)作为酯交换活性值的比率。
[0140]
[表4] ps脂肪酶酯交换活性值比比较例20野生型(固定)1实施例2a120g(固定)0.58
[0141]
相对于庚烷52.5ml溶解dl-薄荷醇50g，进而添加作为酰化剂的15.4g的乙酸乙烯酯并混合(酶反应前)。添加2g的固定化酶，在25℃下搅拌而开始反应。在反应18小时后用滤纸进行过滤而除去固定化酶，得到反应滤液。相对于反应滤液100μl添加内标液20μl，将其中的25μl用庚烷1ml稀释而制备分析样品。
[0142]
将分析样品在以下条件下供于气相色谱，由此进行反应生成物的分析。(气相色谱分析条件)色谱柱：cp-chiral-dex cb(0.25mmid
×
25m，j&w)注入量：1μl注入口温度：25℃注入法：分流1：100载气：
流速：1.3ml/分钟柱温箱：110℃，25分钟检测器：fid，300℃
[0143]
基于下式计算反应生成物中的乙酸-l-薄荷酯转化率(l型转化率)。将结果示于表5。
[0144]
[数学式4]
[0145]
基于下式计算反应生成物的光学纯度。将结果示于表3。
[0146]
[数学式5]
[0147]
[表5] ps脂肪酶l型转化率(％)光学纯度ee(％)比较例20野生型(固定)95.698.3实施例2a120g(固定)9599.5
[0148]
由表5可知，本发明的改良型脂肪酶(实施例2)与野生型脂肪酶(比较例20)的l型转化率为同等，但是可观察到光学纯度的提高。另外，如表4所示，本发明的改良型脂肪酶(实施例2)与野生型脂肪酶(比较例20))相比酯活性值本身大幅下降，但是如表5所示，几乎未观察到l型转化率的下降。
[0149]
[试验例3：水解中的、对l-薄荷醇酯的底物特异性-2]作为来自洋葱伯克霍尔德菌的脂肪酶的突变体，使用适宜设计的引物制备表6记载的多肽，除此以外进行与试验例1同样的操作，调查该突变体在水解中对l-薄荷醇酯的底物特异性。将结果示于表6。
[0150]
[表6]
[0151]
由表6可知，ps脂肪酶(野生型；比较例21)的第88位突变体中，仅q88a突变体(实施例3)、q88g突变体(实施例4)、q88d突变体(实施例5)、q88m突变体(实施例6)、及q88l突变体(实施例7)可观察到高于野生型的对l型的底物特异性。另外可知，q88a突变体、q88g突变体、q88d突变体、q88m突变体、及q88l突变体的l-薄荷醇的转化率也极其优异。序列表自由文本
[0152]
序列号3为编码来自洋葱伯克霍尔德菌的脂肪酶a120g突变体的dna。序列号6为lipa的正向引物。序列号7为lipa的反向引物。序列号9为lipx的正向引物。序列号10为lipx的反向引物。序列号11为a120x的正向引物。序列号12为a120x的反向引物。序列号13为编码来自洋葱伯克霍尔德菌的脂肪酶q88a突变体的dna。序列号14为编码来自洋葱伯克霍尔德菌的脂肪酶q88g突变体的dna。序列号15为编码来自洋葱伯克霍尔德菌的脂肪酶q88d突变体的dna。序列号16为编码来自洋葱伯克霍尔德菌的脂肪酶q88m突变体的dna。序列号17为编码来自洋葱伯克霍尔德菌的脂肪酶q88l突变体的dna。
技术特征：1.以下的(1)至(3)中任一项所示的多肽：(1)由在序列号1所示的氨基酸序列中第120位的氨基酸残基被置换为甘氨酸残基的氨基酸序列构成的多肽、(2)在序列号1所示的氨基酸序列中第120位的氨基酸残基被置换为甘氨酸残基的氨基酸序列中，除了被导入了上述置换的氨基酸残基以外的1个或数个氨基酸残基发生了置换、添加、插入或缺失，具有对l-薄荷醇的酯化活性和/或对l-薄荷醇酯的水解活性，并且与由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽相比对l-薄荷醇和/或l-薄荷醇酯的底物特异性提高的多肽、(3)在序列号1所示的氨基酸序列中第120位的氨基酸残基被置换为甘氨酸残基的氨基酸序列中，相对于序列号1所示的氨基酸序列的、除了被导入了上述置换的氨基酸残基以外的序列一致性为80％以上，具有对l-薄荷醇的酯化活性和/或对l-薄荷醇酯的水解活性，并且与由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽相比对l-薄荷醇和/或l-薄荷醇酯的底物特异性提高的多肽。2.以下的(4)至(6)中任一项所示的多肽：(4)由在序列号1所示的氨基酸序列中第88位的氨基酸残基被置换为丙氨酸残基、甘氨酸残基、天冬氨酸残基、甲硫氨酸残基或亮氨酸残基的氨基酸序列构成的多肽、(5)在序列号1所示的氨基酸序列中第88位的氨基酸残基被置换为丙氨酸残基、甘氨酸残基、天冬氨酸残基、甲硫氨酸残基或亮氨酸残基的氨基酸序列中，除了被导入了上述置换的氨基酸残基以外的1个或数个氨基酸残基发生了置换、添加、插入或缺失，具有对l-薄荷醇的酯化活性和/或对l-薄荷醇酯的水解活性，并且与由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽相比对l-薄荷醇和/或l-薄荷醇酯的底物特异性提高的多肽、(6)在序列号1所示的氨基酸序列中第88位的氨基酸残基被置换为丙氨酸残基、甘氨酸残基、天冬氨酸残基、甲硫氨酸残基或亮氨酸残基的氨基酸序列中，相对于序列号1所示的氨基酸序列的、除了被导入了所述置换的氨基酸残基以外的序列一致性为80％以上，具有对l-薄荷醇的酯化活性和/或对l-薄荷醇酯的水解活性，并且与由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽相比对l-薄荷醇和/或l-薄荷醇酯的底物特异性提高的多肽。3.一种dna，其编码权利要求1或2所述的多肽。4.一种重组载体，其包含权利要求3所述的dna。5.一种转化体，其通过利用权利要求4所述的重组载体转化宿主而得到。6.一种权利要求1或2所述的多肽的制造方法，其包括培养权利要求5所述的转化体的工序。7.一种酶组合物，其包含权利要求1或2所述的多肽。8.一种酶制剂，其包含权利要求1或2所述的多肽或权利要求7所述的酶组合物。9.一种l-薄荷醇酯的制造方法，其包括使权利要求1或2所述的多肽、权利要求7所述的酶组合物、或权利要求8所述的酶制剂作用于包含l-薄荷醇及d-薄荷醇的混合物而将l-薄荷醇酯化的工序。10.一种l-薄荷醇的制造方法，其包括使权利要求1或2所述的多肽、权利要求7所述的酶组合物、或权利要求8所述的酶制剂作用于包含l-薄荷醇酯及d-薄荷醇酯的混合物而水解l-薄荷醇酯的工序。
技术总结本发明提供一种在L-薄荷醇和/或其酯的制造中能够进一步提高对L型的底物特异性的技术。由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽的A120G、Q88A、Q88G、Q88D、Q88M、Q88L突变体、及在该突变体中具有被导入了前述置换的氨基酸残基以外的任意差异部位，具有对L-薄荷醇的酯化活性和/或对L-薄荷醇酯的水解活性，并且与由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽相比对L-薄荷醇和/或L-薄荷醇酯的底物特异性提高的多肽在L-薄荷醇和/或其酯的制造中能够进一步提高制造物的光学纯度。高制造物的光学纯度。
技术研发人员：吉田和典 佐藤幸秀 龟田伦史 池部仁善
受保护的技术使用者：天野酶制品株式会社
技术研发日：2021.03.12
技术公布日：2022/11/1
