一株副干酪乳酪杆菌pc804及其应用
【技术领域】
1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株分离自泡菜的具有益生特 性的副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)pc804，还涉及其在 益生菌发酵乳制品中的应用。
背景技术：2.泡菜是一种传统的发酵蔬菜制品，泡菜中乳酸菌多样性丰富，包括植 物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)、发酵粘液乳杆菌 (limosilactobacillus fermentium)、干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus casei) 等，对其乳酸菌进行研究具有重要的价值。
3.乳酸菌(lactic acid bacteria，lab)是指发酵糖类，主要产物为乳酸 的一类无芽孢、革兰氏染色阳性的细菌的总称，广泛存在于人们生活中， 在发酵食品中大量存在。乳酸菌不仅对食品感官特性具有重要作用，还具 有调节肠道菌群、增强免疫力、促进营养吸收等益生功能。大量研究发现， 发酵食品中存在的乳酸菌可以促进生物体对营养物质的吸收、降低体内胆 固醇，以及通过增加非特异性(细胞功能、自然杀伤细胞活性)和特异性 (细胞因子产生、抗体产生、淋巴细胞增殖、迟发型超敏反应)宿主免疫 应答提高机体免疫力等。乳酸菌有着相当长的安全使用历史，长期以来发 酵产品中所使用的乳酸菌普遍被人们认为是安全(gras)菌种。
4.副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)是一种兼性厌氧、革 兰氏阳性、异型发酵乳酸菌，广泛存在于人类口腔、肠道、发酵乳制品(尤 其是奶酪)和植物原料发酵物(泡菜、酒和饲料)中。它具有干酪乳杆 菌属的特性，可通过胞外酶的作用分解蛋白产生小分子肽，在降血压、抗 肿瘤、抗氧化、降低胆固醇等方面发挥着重要作用。同时，副干酪乳酪杆 菌无毒副作用、无抗药性及易被人体降解，具有调节肠道平衡、增强非特 异性免疫力、促进吸收等益生功能。
技术实现要素：5.本发明的目的是提供一株分离自酸粥的具有一定益生特性的副干酪乳 酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)pc804，已在中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为cgmcc no.23917。
6.本发明提供副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)pc804在 食品添加剂中的应用。
7.其中，食品添加剂是乳品发酵剂。
8.另一方面，本发明还提供副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei) pc804发酵乳品中的应用，其中，所述发酵乳品为发酵酸奶，饮用型酸奶， 发酵乳饮料或发酵豆乳。
9.本发明的副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)pc804能够 抵御消
化道环境的不利影响并在肠道内很好的黏附和定植。其活菌体具有 增强免疫抵抗作用、提高肠道菌群多样性、增加肠道菌群稳定性的效果， 用于人以及动物时，能够密集、停留在肠内的消化管道壁上，从而起到使 有害菌不能够停留的作用，并且产生乳酸来降低肠内的ph值，抑制有害 细菌的繁殖。并且，所用的活菌体生成细菌素和过氧化物，从而能够抑制 病原菌的繁殖，对负责吸收营养成分的肠绒毛的活动起到帮助作用。
10.本发明的副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)pc804经过 感官评鉴确认具有优秀的滋味与口感评分和气味评分，且制备成褐色乳饮 料后，所得产品后熟后4℃留样每间隔7天测定货架期内酸度和益生菌活 菌数变化较小，在贮藏期间保持较高的活菌数，证明本发明的pc804具 有良好的益生特性，可应用于商业化发酵乳制品中。
11.本发明涉及以下微生物：
12.副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)pc804，于2021年11 月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心， 保藏编号为cgmcc no.23917。
【附图说明】
13.图1：副干酪乳酪杆菌pc804电镜图(3000倍)
14.图2：副干酪乳酪杆菌pc804在培养基上的菌落形态
15.图3：副干酪乳酪杆菌pc804在模拟人工消化道中的存活率变化情况
【具体实施方式】
16.下面将结合实施例对本发明作进一步说明，以下实施例仅为说明性的， 本发明并不受这些实例的限制。
17.在本发明中，如无特殊说明，用于解释浓度的“％”均为重量百分比。
18.本发明涉及以下培养基：
19.mrs液体培养基：蛋白胨(动物源)10g、牛肉浸粉8g、酵母浸粉 4g、葡萄糖20g、tween-80 1ml、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、柠檬酸 三胺2g、硫酸锰0.05g、硫酸镁0.2g，蒸馏水1l，调节ph至6.5
±
0.2， 121℃，15min灭菌。
20.mrs固体培养基：蛋白胨(动物源)10g、牛肉浸粉8g、酵母浸粉 4g、葡萄糖20g、tween-80 1ml、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、柠檬酸 三胺2g、硫酸锰0.05g、硫酸镁0.2g，蒸馏水1l，调节ph至6.5
±
0.2， 琼脂15g，121℃、15min灭菌。
21.实施例1副干酪乳酪杆菌pc804的获取
22.将从四川省大邑县泡菜中采集到的泡菜样品进行倍比稀释，得到10-5
、10-6
、10-7
稀释梯度，吸取各梯度泡菜样品200μl均匀涂布于mrs 固体培养基平皿内，37℃厌氧培养48-72h。挑取形态、大小、颜色不同 的单克隆接种于mrs液体培养基中，于37℃恒温培养箱培养24h。待 菌株生长良好后，进行革兰氏染色、镜检。保存分离株，并提取菌株基 因组dna用于后续测定分析。
23.将冷冻保存的供试菌株接种于mrs液体培养基中，37℃恒温培养 24h，传代培养2～3代后，取2ml对数生长末期的菌体培养物置于无 菌ep管内离心，经8000
×
g离心3min(4℃)后收集菌体，弃上清，采 用乳酸菌专用ctab冻融法提取菌株的基因组dna。
24.采用pacbio smrt rsii第三代测序平台对lacticaseibacillusparacasei pc804全基因组进行测定，确认所得菌株副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)。
25.本发明筛选得到的副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei) pc804具有如下形态学特征：菌体在显微镜下呈短杆状，两端平齐呈方 形，细胞成单、成对或成链状排列(如图1所示)，无芽孢、无鞭毛， 不会移动。
26.该副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)pc804在mrs培养 基上形成的菌落呈乳白色，有光泽，边缘整齐，多呈凸透镜状突起，直径 在0.5-1mm之间(如图2所示)。
27.实施例2耐受性测定
28.1、菌株胃肠液耐受性
29.模拟胃肠液的制备方法：将pbs灭菌后，用1mol/l hcl调节ph值 至2.5，加入3.0mg/ml胃蛋白酶，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成人 工模拟胃液；
30.人工模拟胰液的制备方法：将pbs灭菌后，用0.1mol/l naoh调节 ph值至8.0，加入0.1％胰蛋白酶和1.8％牛胆盐，用0.22μm微孔滤膜过 滤除菌，制成人工模拟胰液。
31.胃肠液耐受性：将分离纯化得到的菌株活化培养两代，离心洗菌两次， 收集菌体，取0.5ml复筛菌体悬液加入到4.5ml ph 2.5模拟人工胃液中， 37℃消化3h，同时分别于0h和3h用mrs琼脂培养基倾注法计数测定 活菌数。
32.之后，取0.5ml已消化3h的人工含菌胃液加入到4.5ml的人工肠液 中，继续于37℃水浴培养，分别于4h和8h用mrs琼脂培养基倾注法 计数测定活菌数，每个样品做4个平行。
33.菌株存活率计算公式
[0034][0035]
n1――菌株处理后活菌数；
[0036]
n0――菌株初始活菌数。
[0037]
结果显示，副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)pc804在 ph2.5的人工胃液中消化3小时(存活率57.94％)，之后继续在ph8.0的 人工消化液中消化8小时，最终存活率为30.68％(如图3所示)。
[0038]
结果表明副干酪乳酪杆菌pc804具有良好的胃肠道消化液耐受性， 能够以活的状态进入人体肠道，发挥健康功效。上述特性是作为益生菌的 基础。本发明的副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)pc804是 具有益生菌活性的益生菌，可以预期当其以干燥的细胞形态或发酵产物形 态用于人或动物的情况下，能够对宿主的肠道菌群产生有利的影响，具有 增强免疫抵抗作用、提高肠道菌群多样性、增加肠道菌群稳定性的益生特 点。
[0039]
2、菌株胆盐耐受性
[0040]
分离纯化得到的菌株活化培养三代后，以1％的接种量分别接种到含 0.3％牛胆盐(培养基中添加0.2g/100ml巯基乙酸钠，0.3g/100ml牛胆 盐)和不含牛胆盐的mrs培养基中，后者作为空白对照，置于37℃厌氧 培养。培养期间，每隔一小时取样于620nm测定od值，每组测定三个 平行，直到od值增加0.3个单位及以上时停止培养。并计算菌株在含有 胆盐
和不含胆盐的mrs培养基中生长，od值增加0.3个单位所需的时 间，二者之差被称为延迟时间(lt)。
[0041]
结果显示，副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)pc804在 不含胆盐的培养基中培养，od
620nm
值增加0.3个单位所需的时间为4h， 在含有胆盐的培养基中所需的时间为4.5h，延迟时间为0.5h。根据 gilliland等人的胆盐耐受性实验结论(抗性菌株延迟时间≤0.25h，耐受性 菌株0.25h＜延迟时间≤0.67h，弱耐受性菌株0.67h＜延迟时间＜1.00h， 敏感菌株延迟菌株≥1.00h)，延迟时间为0.4h的副干酪乳酪杆菌pc804 属于胆盐耐受性菌株。
[0042]
对于活细胞来说，胆盐能破坏细胞膜，且在小肠中对益生菌存活性影 响最大的因素就是胆盐，所以，对胆盐的耐受性是评价益生菌的重要指标 之一。因此，这株分离自泡菜的副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillusparacasei)pc804具有良好的益生特性。
[0043]
实施例3副干酪乳酪杆菌pc804在褐色乳饮料中的应用
[0044]
现有的褐色乳饮料是以脱脂乳粉和还原糖为原料，水合后经高温热处 理、冷却，通过长时间发酵，再经过调配、均质等工艺制得的一种口味香 浓、营养丰富、具有调节胃肠道功能的发酵型乳饮料。褐色乳饮料的特殊 颜色是根据美拉德反应的机理，由牛乳中的蛋白质和氨基酸与还原糖在高 温条件下发生美拉德反应从而使产品具有特殊的褐色。褐色乳饮料口味独 特营养丰富，研究发现褐色乳酸菌饮料具有较好抗氧化、延缓衰老等作用。
[0045]
用本发明的副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)pc804制 作褐色乳饮料：
[0046]
蒸馏水预热至60℃后，按比例加入10％的脱脂乳和2％的白砂糖，在 60℃恒温水浴锅化料15min，然后水合30min，混合均匀后均质，然后在 95℃高温条件下褐变3h，冷却至37℃时接入副干酪乳酪杆菌pc804(1
ꢀ×
107cfu/g)在37℃下培养，进行发酵，发酵终点至ph4.5以下，滴定 酸度200，发酵约108小时，得到基料。发酵结束后进行感官评定，结果 见表1。
[0047]
表1褐色乳饮料感官评鉴结果
[0048][0049]
感官评鉴得分是一株益生菌是否能够作为商业发酵剂的重要因素之 一。尽管不少益生菌都能够作为菌种用于制备发酵饮品，但经常存在滋味 或口感评分较低或气味较差的缺陷，使得所得产品风味下降，难以被消费 者接受，因此无法应用于商业发酵剂。
[0050]
进一步制备褐色乳饮料：蒸馏水预热至60℃后，按比例加入苹果汁 和白砂糖，柠檬酸调至ph3.7，化料15min，95℃水浴杀菌5min，冷却 至37℃，按比例加入基料，混合均匀后均质，分装后置于4℃冰箱贮藏。 后熟后4℃留样每间隔7天测定货架期内酸度和益生菌活菌数变化，结果 见表2。
[0051]
表2褐色乳饮料在4℃贮藏期间酸度和益生菌活菌数的变化
[0052][0053]
由表2的测定结果可知，褐色乳饮料中添加副干酪乳酪杆菌pc804 没有后酸化现象；发酵结束后pc804的活菌数达到107cfu/g以上且在贮 藏期间保持较高的活菌数，证明本发明得到的副干酪乳酪杆菌pc804具 有良好的益生特性。
技术特征：1.一株副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)pc804，所述副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)pc804于2021年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为cgmcc no.23917。2.权利要求1的副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)pc804在食品添加剂中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述食品添加剂是乳品发酵剂。4.权利要求1的副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)pc804发酵乳品中的应用。
技术总结本发明公开了一株分离自泡菜的具有益生特性的副干酪乳酪杆菌，命名为副干酪乳酪杆菌PC804，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.23917。本发明中的副干酪乳酪杆菌PC804在胃肠液中有较高的存活率，良好的胆盐耐受性，在人体内具有较强的存活能力。副干酪乳酪杆菌PC804具有增强免疫抵抗作用、提高肠道菌群多样性、增加肠道菌群稳定性的益生特点。此外，PC804作为益生菌可以很好的应用于发酵乳制品。酵乳制品。
技术研发人员：张文羿 王记成 姚国强 刘文俊 何秋雯 白梅
受保护的技术使用者：内蒙古农业大学
技术研发日：2022.07.07
技术公布日：2022/11/1
