cers5作为标志物在制备胃癌预后检测制剂中的应用
技术领域
1.本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及cers5作为标志物在制备胃癌预后检测制剂中的应用。
背景技术：2.胃癌是目前全球最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率分别位于第5位和第4位，据统计2020年新发胃癌病人超过100万人。胃癌的总体预后不佳，5年生存率仅为35.1%。手术切除治疗仍然是目前治疗胃恶性肿瘤的主要方法。近年来，随着化疗、放疗、免疫、靶向治疗等治疗技术的发展，胃癌的治疗方案逐渐走向综合化。但受限于药物的毒副作用以及耐药性，胃癌的总体治疗效果仍旧不佳。目前，胃癌的早期筛查和诊断手段主要依靠于影像学检查、肿瘤标志物、内镜检查和组织活检等。内镜下活检得到病理诊断是目前胃癌诊断的金标准，但限于内镜操作的有创性，胃癌的早筛早诊还未能普及。因此，寻找胃癌早诊或治疗靶点，显得尤为重要。
3.神经酰胺合成酶（ceramide synthases, cerss）是内质网中必不可少的膜蛋白，到目前为止，已经在哺乳动物中发现了包括cers5在内的六种类型的cerss(cers1-cers6)。cerss参与了神经酰胺（cers）的从头合成途径和挽救途径。同时，具有生物活性的鞘磷脂神经酰胺(cers)既是生物膜的结构成分，又是诱导细胞死亡和肿瘤抑制的信号分子。不同cerss具有不同的脂肪酰辅酶a链长，这意味着cers可能参与了不同组织的调节，影响其新陈代谢。有研究证实cerss水平的改变与肿瘤细胞的凋亡以及恶性进展密切有关。但是，目前关于cers5在胃癌中的功能亟待揭示。
技术实现要素：4.本发明的目的之一在于提供一种与亚洲人群胃癌预后相关的标志物的应用，该标志物为cers5，其可作为标志物构建用于评估胃癌患者的胃癌预后的模型，还可作为标志物制备胃癌预后检测制剂。
5.本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：cers5作为标志物在构建用于评估胃癌患者的胃癌预后的模型中的应用，胃癌患者为亚洲人群胃癌患者，模型通过如下方法构建，1）将亚洲人群胃癌患者样本构建组织芯片；2）采用免疫组化法检测组织芯片中cers5的表达；3）采用h评分系统进行cers5表达强度评估，其中，-如果胃癌患者样本的cers5水平》临界值，这提示胃癌患者的预后不良；-如果胃癌患者样本的cers5水平≤临界值，这提示胃癌患者的预后良好。
6.cers5在胃癌患者的胃癌组织和/或转移淋巴结组织高表达，其表达水平是影响亚洲人群胃癌不良预后的独立影响因素。亚洲人群胃癌患者的胃癌组织和/或转移淋巴结组织中cers5的表达水平越高，提示胃癌患者的预后越差；亚洲人群胃癌患者样本中cers5的
表达水平越低，提示胃癌患者的预后预后越好。此外，cers5水平升高与从acrg收集的胃癌患者预后不良显着相关，但与tcga无关，这表明cers5是亚洲人群胃癌的预后标志物。
7.优先地，胃癌患者为原发胃癌患者。
8.优先地，样本包括胃癌组织和/或转移淋巴结组织。
9.优先地，胃癌患者样本为福尔马林固定和/或石蜡包埋的胃癌患者样本。
10.优先地，h评分系统的公式如下：h评分=（∑is
×
ap)，其中is表示染色强度，无染色为0分，弱染色为1分，中度染色为2分；ap表示阳性染色的细胞的百分比，0%为0分，1%-25%为1分，26%-50%为2分，51%-75%为3分，76%-100%为4分。
11.优先地，临界值=4分。
12.本发明还提供cers5作为胃癌患者预后标志物的应用，胃癌患者为亚洲人群胃癌患者，cers5在胃癌患者样本中被检测；胃癌患者样本中cers5的表达水平越高，提示胃癌患者的预后不良；胃癌患者样本中cers5的表达水平越低，提示胃癌患者的预后良好。
13.优先地，胃癌患者为原发胃癌患者。
14.优先地，胃癌患者样本包括胃癌组织和/或转移淋巴结组织。
15.优先地，胃癌患者样本为福尔马林固定和/或石蜡包埋的胃癌患者样本。
16.优先地，胃癌患者样本采用免疫组化染色后，利用免疫组化h评分系统进行cers5表达强度的评估。
17.更优先地，h评分系统的公式如下：h评分=（∑is
×
ap)，其中is表示染色强度，无染色为0分，弱染色为1分，中度染色为2分。ap表示阳性染色的细胞的百分比，0%为0分，1%-25%为1分，26%-50%为2分，51%-75%为3分，76%-100%为4分。
18.进一步优先地，h评分≤临界值的胃癌患者为cers5低表达组，h评分》临界值的胃癌患者为cers5高表达组。更进一步优先地，临界值=4分。
19.更进一步优先地，胃癌患者的胃癌组织中cers5高表达组的5年总生存率为32.8%，胃癌患者的胃癌组织中cers5低表达组的5年总生存率为52.8%。
20.本发明还提供cers5作为标志物在制备胃癌预后检测制剂中的应用，检测制剂用于亚洲人群胃癌患者样本中cers5水平的检测。
21.优先地，检测制包括cers5抗体。
22.本发明还提供一种胃癌预后检测制剂，包括检测胃癌患者样本中cers5表达量的试剂。
23.优先地，胃癌患者为亚洲人群胃癌患者，胃癌患者样本为胃癌组织和/或转移淋巴结组织。
24.优先地，试剂为cers5抗体。
25.本发明还提供一种胃癌预后检测用试剂盒，包含，上述的检测胃癌患者样本中cers5水平的试剂。
26.优先地，测定的cers5水平为cers5蛋白水平。
27.优先地，cers5蛋白水平通过免疫组化染色、elisa或western印迹方法测定。
28.本发明还提供cers5在胃癌辅助诊断中的应用。cers5的表达水平与ca50数值大小呈正相关，胃癌组织中cers5高表达组胃癌患者的糖蛋白抗原ca50异常率为20.4%，胃癌组织中cers5低表达组胃癌患者的ca50异常率仅为6.3%，这意味着cers5在胃癌辅助诊断中具
有一定的价值。
29.本发明由于采用了cers5作为胃癌预后标志物，因而具有如下有益效果：cers5在胃癌患者的胃癌组织和/或转移淋巴结组织高表达，其表达水平是影响亚洲人群胃癌不良预后的独立影响因素。亚洲人群胃癌患者的胃癌组织和/或转移淋巴结组织中cers5的表达水平越高，提示胃癌患者的预后越差；亚洲人群胃癌患者样本中cers5的表达水平越低，提示胃癌患者的预后预后越好。其中，亚洲人群胃癌患者的胃癌组织中cers5高表达组的5年总生存率为32.8%，亚洲人群胃癌患者的胃癌组织中cers5低表达组的5年总生存率为52.8%。此外，cers5水平升高与从acrg收集的胃癌患者预后不良显着相关，但与tcga无关，这表明cers5是亚洲人群胃癌的预后标志物。因此，本发明提供一种与亚洲人群胃癌预后相关的标志物cers5的应用，其可作为标志物构建用于评估胃癌患者的胃癌预后的模型，还可作为标志物制备胃癌预后检测制剂。
附图说明
30.图1为胃癌患者肿瘤组织、癌旁组织和转移淋巴结组织中cers5的免疫组化染色；图2 cers5在胃癌中的差异表达，a为基于150例临床样本的cers5在肿瘤组织和癌旁组织中的差异表达，b为基于tcga的cers5在肿瘤组织和正常组织中的差异表达，c为基于acrg的cers5在肿瘤组织和正常组织中的差异表达，d为基于99例临床标本的cers5在肿瘤组织和转移淋巴结组织中的差异表达；图3为cers5与胃癌患者预后的相关性，a为cers5低表达和cers5高表达的胃癌患者的总生存率，b为来自tcga数据库的具有不同cers5水平的胃癌患者的存活概率，c为来自acrg数据库的具有不同cers5水平的胃癌患者的存活概率。
具体实施方式
31.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
32.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
33.实施例1：1.材料和方法1.1.患者收集了2013年1月至2017年12月间在中国科学院大学附属肿瘤医院（浙江省肿瘤医院）收治的接受胃癌根治手术的患者150例，患者均为亚洲人群。其中纳入标准：（1）术后病理明确诊断为胃癌；（2）患者病历资料相对完整；（3）术前未行放化疗、靶向治疗或免疫治疗等抗肿瘤综合治疗；（4）有完整的生存随访数据。排除标准：（1）合并有其他类型的恶性肿瘤患者；（2）其他恶性肿瘤转移而来的患者。回顾收集了该批患者的病历数据，包括人口统计学特征和临床病理特征，并通过电话随访获得总生存期，最后随访时间为2021年8月。总生存期(os)定义为从初次手术到死亡或最后一次随访的持续时间。
34.1.2.免疫组化染色法将组织样品经福尔马林固定、石蜡包埋制备组织标本，收集具有代表性的胃癌组
织标本、癌旁组织标本和转移淋巴结标本，构建组织芯片并进行免疫组化法染色。将切片在 56-60
°
c 下孵育 15 分钟，进行两次二甲苯换液，用乙醇、90% 乙醇、80% 乙醇复水，然后在温和流动的自来水中冲洗，并用 1
×
pbs 洗涤。随后将切片放入微波炉中用水孵育3次，每次5分钟，缓慢冷却至室温，3%双氧水孵育5分钟，接着添加一抗(anti-cers5 1:500)，4
°
c孵育过夜，1
×
pbs洗5分钟
×
3次；然后在组织芯片上添加二抗(山羊抗兔igg h&l，1:1000)，孵育30分钟，1
×
pbs洗5分钟
×
3次；然后用兔特异性hrp/dab（abc）检测ihc试剂盒（abcam，ab64261）检测dab，用苏木精对细胞核进行染色。最后，将组织芯片脱水并用中性凝胶密封。
35.1.3.染色结果判读以h评分系统进行cers5表达强度的评估。h评分系统的公式如下：h评分=（∑is
×
ap)，其中is表示染色强度，无染色为0分，弱染色为1分，中度染色为2分。ap表示阳性染色的细胞的百分比，0%为0分，1%-25%为1分，26%-50%为2分，51%-75%为3分，76%-100%为4分。cers5的h评分中位数为4分，设定为临界值，将不同cers5水平的患者分为高表达组和低表达组。
36.1.4.公共肿瘤数据库胃癌患者的rna-seq数据从癌症基因组图谱(tcga)和亚洲癌症研究组(acrg)(21)数据库下载，其中405例来自tcga，246例来自acrg。比较了胃癌组织和癌旁组织中的cers5水平。根据相应的临床病理资料，采用kaplan-meier法确定cers5水平与胃癌患者生存时间的相关性。
37.1.5. 数据分析采用spss 25.0软件进行统计分析，采用卡方检验、校正卡方检验和fisher精确检验分析cers5表达水平与临床病理特征的相关性，采用kaplan-meier法绘制生存曲线，采用单因素和多因素cox回归分析影响胃癌患者预后的独立因素。同时计算危险比(hr)和95%置信区间(ci)。p《0.05代表统计学意义。
38.2. 结果2.1. 临床病理学特征纳入研究的胃癌病人的中位年龄为61岁，其中男性106例（70.7%），女性44例（29.3%）。从肿瘤位置分布来看，远端胃癌占多数，占61.3%。从肿瘤tnm分期来看，大部分患者为iii期，占总78.7%，ii期和iv期病人分别占12.0%和9.3%。150例患者中，病理提示分化程度为低分化和中低分化为主，分别占44.0%和34.7%。我们对入组的病人均有定期随访，末次随访时间为2021年8月，在随访期间，有81例病人死亡。更多具体的临床病理资料见表1。
39.表1 150例胃癌患者临床病理特征
备注：x代表未知2.2. cers5在胃癌组织和癌旁组织中的表达水平通过免疫组化染色，发现150例胃癌患者组织中有118例存在cers5的表达，占78.7%，cers5表达阴性（0分）的胃癌患者为32例，占21.3%（图1和表2）。根据免疫组化h评分评价标准，cers5的h评分中位数为4分，将h评分=4分设定为临界值，我们定义h评分≤4分的患者为cers5低表达组，h评分》4分的患者为cers5高表达组。50/150例(33.3%)患者的肿瘤组织中存在高水平的cers5，而只有24/150例(16.0%)患者的癌旁组织中存在cers5(图2a和表3)。这些数据表明，相较于癌旁组织而言，cers5在胃癌患者肿瘤组织中呈高水平表达。为了探索cers5在不同人群来源的胃癌患者组织中的表达情况，分别从tcga数据库和acrg数据库中提取cers5的rna-seq数据。在比例和临床特征方面，tcga数据库主要为欧美人群，acrg数据库主要为亚洲人群。从tcga收集了373个肿瘤组织和32个正常组织，从acrg收集了122个肿瘤组织和123个正常组织。结果表明，与tcga和acrg中的正常组织相比，cers5在癌组织中过表达（图2b和2c），这意味着无论人群如何，cers5在胃癌患者中普遍上调。
40.为了研究cers5在不同人群胃癌患者中的作用，我们从tcga和acrg数据库下载了cers5的rna-seq数据。在比例和临床特征方面，tcga主要以欧洲人群为基础，而acrg则以亚洲人群为基础。从tcga收集了373个肿瘤组织和32个正常组织，从acrg分别收集了122个肿瘤组织和123个正常组织。结果表明，cers5在不同人群来源胃癌组织中均呈现一个高水平表达的状态，tcga数据库与acrg数据库的结论一致（图2b和2c），以上结果表明，cers5在胃腺癌患者中普遍高表达，且其表达水平与种族没有相关性。
41.表2 cers5在肿瘤组织中的表达水平备注：评分≥1为表达；评分＞4分为高表达
表3 cers5在肿瘤组织和癌旁组织中的表达水平备注：**代表p《0.0012.3. cers5在胃癌组织和转移淋巴结组织中的表达水平为了进一步分析cers5表达水平在胃癌组织和转移淋巴结组织中的差异性，收集来自同一患者的成对组织并进行ihc染色。发现99/150胃癌患者存在胃周淋巴结转移，转移率达66.0%。此外，99例胃周淋巴结转移患者中cers5高表达有29例（29.3%），低表达有70例（70.7%）；与之匹配的99例胃癌组织样本中，cers5高表达有38例（38.4%），低表达有61例（61.6%）；然而，在与之匹配的99例癌旁组织样本中，cers5高表达有14例（14.1%），cers5低表达有85例（85.9%）（表4）。结果显示，cers5在转移淋巴结组织中的表达明显高于配对癌旁组织（p=0.01），而cers5在胃癌组织和转移淋巴结组织中的表达无显着差异（p=0.176）。这些数据表明，与胃癌患者的癌旁组织相比，cers5 在癌组织和转移性淋巴结组织中均过表达（图2d）。
42.表4 cers5在肿瘤组织、癌旁组织和转移淋巴结组织中的表达水平备注：*代表p《0.05；**代表p《0.0012.4. cers5表达和临床病理学特征为了明确cers5与临床病理特征之间的相关性，对收集的回顾性临床病理资料进行整理，运用卡方检验，校正卡方或fisher精确检验等多种统计方法进行统计分析进行相关性分析。如表5所示，cers5低表达时胃癌患者的发病部位主要是远端胃癌（66/96，68.8%），cers5高表达时胃癌患者的发病部位主要是近端（23/54，42.6%)和远端（26/54，48.1%）胃癌。cers5水平与肿瘤位置的相关性具有统计学意义（p=0.045），表明cers5参与了胃癌的分布。另外，我们还发现高表达cers5的胃癌患者，其糖蛋白抗原ca50异常率为20.4%（11/54），低表达cers5的患者的ca50异常率仅为6.3%（6/96）（表5，p=0.011），cers5与胃癌患者的ca50值之间存在相关性（表5，p=0.011）。糖蛋白抗原ca50作为一种非特异性的广谱肿瘤标志物，主要用于胰腺癌、结直肠癌、胃癌的辅助诊断，我们研究发现，cers5的表达水平与ca50数值大小呈正相关，这意味着cers5在胃癌辅助诊断中具有一定的价值。然而，其余指标如年龄、性别、吸烟史、饮酒史、家族史、tnm分期、lauren分型、肿瘤大小、肿瘤分化程度、ca125等常见消化道肿瘤标志物等均与cers5表达量无显著相关性。
43.表5 cers5与胃癌临床病理特征的相关性
备注：*代表p《0.05；x代表未知2.5. cers5表达对胃癌预后的影响
为探讨cers5水平与胃癌患者预后的影响，我们对150例胃癌患者定期随访获取生存数据，采用kaplan-meier法绘制生存曲线分析胃癌组织cers5表达水平对患者预后的影响。如图3a所示，cers5高表达组胃癌患者预后明显差于低表达组，cers5低表达组5年生存率为52.8%，而cers5高表达组仅为32.8%。这些结果提示cers5的表达水平与胃癌患者的预后呈负相关。为了在更大的队列中验证 cers5 与胃癌预后的相关性，我们从 tcga 收集了 399 例胃癌患者样本，并将他们分为两个不同的组，高表达组和低表达组，如图 3b 所示，cers5 水平与 tcga 胃癌患者的预后无显著相关性。由于tcga主要基于欧洲人群，因此我们从以亚洲人群为基础的acrg收集了胃癌患者的生存数据，以进一步研究cers5在不同人群中的作用。通过 kaplan-meier 方法分析了 300 名胃癌患者的样本和来自 acrg (gse66229， https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) 的相应生存数据，结果显示，gse66229 数据集中 cers5 高表达水平的患者比 cers5 低表达水平的患者预后更差，表明 cers5 的表达水平与预后显著负相关（图3c）。以上结果表明cers5表达水平与亚洲人群来源的胃癌患者预后相关，而与欧美人群来源的胃癌预后无相关性。
44.为了明确胃癌患者的cers5表达水平及临床病理特征对预后的影响，首先，采用单因素cox回归分析对纳入研究的各项因素进行分析（表6），结果发现cers5的表达水平(p=0.023）、胃癌家族史（p=0.008）、lauren分型（p=0.015）、n分期（p＜0.001）、m分期（p＜0.001）、tnm分期（p=0.001）、血管瘤栓（p=0.001）、cea（p=0.005）和ca125（p＜0.001）是影响病人预后的相关因素。接下来，将单因素cox回归分析结果中p＜0.1的指标纳入多因素cox回归分析，结果发现cers5表达（p=0.046）、lauren分型（p=0.022）、n分期（p=0.010）、m分期（p=0.023）和ca125（p=0.001）这5个指标是影响胃癌患者预后的独立影响因素（表7）。
45.表6 150例胃癌患者的单因素cox回归分析
备注：*代表p＜0.05；**代表p＜0.001表7 150例胃癌患者的多因素cox回归分析
备注：*代表p＜0.05本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
46.以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.cers5作为标志物在构建用于评估胃癌患者的胃癌预后的模型中的应用，所述的胃癌患者为亚洲人群胃癌患者，所述的模型通过如下方法构建，1）将亚洲人群胃癌患者样本构建组织芯片；2）采用免疫组化法检测组织芯片中cers5的表达；3）采用h评分系统进行cers5表达强度评估，其中，-如果胃癌患者样本的cers5水平>临界值，这提示胃癌患者的预后不良；-如果胃癌患者样本的cers5水平≤临界值，这提示胃癌患者的预后良好。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的胃癌患者为原发胃癌患者。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的样本包括胃癌组织和/或转移淋巴结组织。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的h评分系统的公式如下：h评分=（∑is
×
ap)，其中is表示染色强度，无染色为0分，弱染色为1分，中度染色为2分；ap表示阳性染色的细胞的百分比，0%为0分，1%-25%为1分，26%-50%为2分，51%-75%为3分，76%-100%为4分。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的临界值=4分。6.cers5作为胃癌患者预后标志物的应用，所述的胃癌患者为亚洲人群胃癌患者，cers5在胃癌患者样本中被检测；胃癌患者样本中cers5的表达水平越高，提示胃癌患者的预后不良；胃癌患者样本中cers5的表达水平越低，提示胃癌患者的预后良好。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的胃癌患者为原发胃癌患者。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的胃癌患者样本包括胃癌组织和/或转移淋巴结组织。9.cers5作为标志物在制备胃癌预后检测制剂中的应用，所述的检测制剂用于亚洲人群胃癌患者样本中cers5水平的检测。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的检测制包括cers5抗体。
技术总结本发明公开了CERS5作为标志物在制备胃癌预后检测制剂中的应用，属于肿瘤分子生物学领域，检测制剂用于亚洲人群胃癌患者样本中CERS5水平的检测，CerS5的表达水平是影响亚洲人群胃癌不良预后的独立影响因素。本发明还提供CERS5作为标志物在构建用于评估胃癌患者的胃癌预后的模型中的应用，胃癌患者为亚洲人群胃癌患者，将亚洲人群胃癌患者样本构建组织芯片；采用免疫组化法检测组织芯片中CERS5的表达；采用H评分系统进行CERS5表达强度评估，如果胃癌患者样本的CERS5水平>临界值，提示胃癌患者的预后不良；如果胃癌患者样本的CERS5水平≤临界值，提示胃癌患者的预后良好。提示胃癌患者的预后良好。提示胃癌患者的预后良好。
技术研发人员：程向东 张盛洁 王以 袁莉 徐志远 胡灿
受保护的技术使用者：浙江省肿瘤医院
技术研发日：2022.07.13
技术公布日：2022/11/1
