一种检测黄曲霉毒素b1的间接竞争酶联免疫方法
技术领域
1.本发明属于毒素分析检测技术领域，具体涉及一种检测黄曲霉毒素b1的间接竞争酶联免疫方法。
背景技术：2.黄曲霉毒素(afs)是基于黄曲霉和寄生曲霉而生成的次级代谢产物，是危害最大的真菌毒素之一，其存在范围广，污染范围大，对人们的生命健康安全带来了巨大威胁。其中，黄曲霉毒素b1(afb1)作为强毒性、高致癌性的黄曲霉毒素之一，在自然条件下极易污染农产品，经人体食用后可引起肝炎、肝癌，严重威胁人体健康，其半数致死量为0.36mg/kg，属特剧毒的毒物范围。
3.目前，针对afb1的检测方法有薄层层析法、高效液相检测法、毛细管电泳法、荧光光度法和酶联免疫吸附法等，其中酶联免疫吸附法由于具有灵敏度高、检测步骤简单、成本低、干扰因素少的优点而广泛使用。
4.然而，现有的传统酶联免疫吸附技术多采用天然过氧化物酶(如天然辣根过氧化物酶)进行研究，但天然过氧化物酶价格昂贵，受环境因素影响大，且容易变性失活，难以储存。此外，由于目前的传统检测方法缺乏特异性，使得检测结果易出现假阳性。因此，迫切需要开发更加经济、简单、特异的方法检测农产品中的afb1含量。
技术实现要素：5.为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种检测黄曲霉毒素b1的间接竞争酶联免疫方法，其易于操作、成本低、检测快速灵敏，且能够消除由于天然过氧化物酶不稳定性造成的误差，检测结果准确可靠，并且特异性高。
6.为实现本发明目的，本发明的检测黄曲霉毒素b1的间接竞争酶联免疫方法，采用的技术方案是：
7.一种检测黄曲霉毒素b1的间接竞争酶联免疫方法，包括以下步骤：
8.1)提取待测样品中的黄曲霉毒素b1，得到待测样品溶液；
9.2)将黄曲霉毒素b1-bsa完全抗原包被在酶标板上，然后洗涤、拍干、封闭处理，再同时加入待测样品溶液和黄曲霉毒素b1单克隆抗体溶液进行竞争反应；
10.3)竞争反应后洗涤，然后加入表面偶联第二抗体igg的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒分散液，于保温保湿环境下反应以实现纳米颗粒在酶标板板底的固定；
11.4)步骤3)反应后洗涤、拍干，加入缓冲液和tmb显色液进行避光反应，然后终止反应，采用酶标仪测定吸光度，根据测得的吸光度以及黄曲霉毒素b1的标准工作曲线，实现待测样品中黄曲霉毒素b1的定量检测；
12.其中，黄曲霉毒素b1单克隆抗体溶液的浓度为2μg/ml；表面偶联第二抗体igg的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒分散液的浓度为0.5mg/ml；待测样品溶液、黄曲霉毒素b1单克隆抗体溶液、表面偶联第二抗体igg的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒分散液的体积比为1∶1∶1；步骤3)
中，采用的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒呈均匀球形，粒径为50～200nm；表面偶联第二抗体igg的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒在制备时，偶联的步骤为：先采用aptes对fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒进行氨基化改性，然后采用交联剂sulfo-smcc实现第二抗体igg在fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒表面的偶联。
13.本发明方法中，采用具有高类过氧化物酶活性的异相双金属纳米粒子(fe3o4@sio2@cuo)用于取代天然辣根过氧化物酶(hrp)。同时通过在fe3o4@sio2@cuo表面偶联第二抗体igg，制备成信号标记物fe3o4@sio2@cuo-igg，利用该标记物催化底物3,3,5,5-四甲基联苯胺(tmb)显色。
14.本发明通过催化活性实验证实，相较于纳米颗粒fe3o4、fe3o4@sio2，本发明的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒，结构稳定且具有更强的类过氧化物酶活性；同时，相较于天然辣根过氧化物酶(hrp)，本发明的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒，催化活性在很宽的ph范围内(从3.0到5.0)保持稳定，并且在30℃至50℃之间、反应时间为10～60min内均具有较高的催化活性，而天然hrp对ph敏感，且活性在30℃以上显著下降，催化活性随着反应时间的增加也明显降低。可见，相较于其他纳米颗粒或天然hrp酶，本发明的纳米颗粒具有更强的环境适应性和通用性，能够极大地满足不同的酶联免疫体系中黄曲霉毒素b1的定量检测需求。
15.进一步地，为了保证整个体系的酶联免疫反应效果，从而改善检测黄曲霉毒素b1检测的灵敏度和准确性，本发明对黄曲霉毒素b1单克隆抗体、偶联第二抗体igg的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒、待测样品溶液的用量进行了严格的控制，从而使得显色更明显，显色程度能够更好地与黄曲霉毒素b1的含量构建起联系，使得黄曲霉毒素b1的高灵敏度和准确性检测成为可能。
16.进一步地，本发明在构建酶联免疫体系过程中考虑到，由于afb1自身是半抗原，即小分子抗原，只有一个抗原表位，并无法有效固定在酶标板板底，因此本发明经过实验验证后提出：首先将完全抗原afb1-bsa固定在板底，封闭后同时加入afb1单克隆抗体和afb1待测样品竞争反应，然后加入偶联了igg的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒，通过igg和单克隆抗体的结合，实现纳米颗粒在板底的固定，从而催化tmb底物显色，通过建立afb1标准曲线，由此最终实现了对afb1标准品及实际样品定量检测的问题。
17.综上，本发明的检测黄曲霉毒素b1的间接竞争酶联免疫方法，首次采用fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒作为纳米材料酶代替天然酶，构建了一种基于afb1抗原-抗体特异性结合的间接竞争酶联免疫法(elisa)用于检测产品中的afb1，能够为黄曲霉毒素b1的检测提供全新的测定思路。
18.并且，本发明的上述检测方法，仅需一台吸光度测定仪器，所需仪器简单，具有易于操作、成本低、检测快速灵敏的特点，尤其能够消除由于天然过氧化物酶不稳定性造成的误差，检测结果准确可靠，并且特异性高。
19.在本发明的优选方案中，待测样品为谷物，包括但不限于花生、玉米、小麦，只要检测样品中含有一定量的afb1，且具有afb1的检测需求即可。
20.本发明对提取待测样品中afb1的提取溶剂种类不作特殊限定，其只要能够实现黄曲霉毒素b1的有效提取即可。优选地，为了保证黄曲霉毒素b1的提取效果，从而不影响后续测定，步骤1)中，提取待测样品中的黄曲霉毒素b1时，采用的提取溶剂为50％甲醇水(v/v)，每克待测样品对应5ml提取溶剂。为了进一步促进提取效率和提取效果的提高，可以采用加
溶剂后超声辅助提取然后离心的前处理方式。如可以是：称取待测样品磨碎成粉末或小颗粒状，加入然后溶剂，混匀后置于超声分散器中超声，然后离心取上层清液保留用于检测使用。
21.本发明中，黄曲霉毒素b1-bsa完全抗原记为afb1-bsa，由于afb1是自身是半抗原，无法被固定在酶标板板底，因此本发明首先将完全抗原afb1-bsa包被在板底，封闭后同时加入afb1单克隆抗体和待测样品竞争反应，然后加入偶联了igg的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒，通过igg和单克隆抗体的结合，实现纳米颗粒在板底的固定，由此催化底物显色。作为优选地方案，完全抗原包被的步骤为：采用碳酸盐包被缓冲液将afb1-bsa稀释到浓度为1μg/ml，然后以100ng/孔铺在酶标板上，将酶标板放置于4℃环境中过夜。进一步优选地，完全抗原的封闭处理为：以200μl/孔加入封闭液于37℃环境中保温保湿2h。更优选的，采用的封闭液为浓度为10mg/ml的牛血清蛋白溶液，配制方法为：1g牛血清蛋白中加入100ml的pbs。
22.竞争反应在本发明中，是将afb1-bsa包被在酶标板上，然后同时加入待测样品溶液和黄曲霉毒素b1单克隆抗体溶液，这时，待测样品溶液中的afb1会和酶标板上的afb1-bsa竞争结合黄曲霉毒素b1单克隆抗体，待测样品溶液中afb1浓度越大，竞争结合的黄曲霉毒素b1单克隆抗体就越多，与板底上的afb1-bsa结合的抗体就越少，最后反应孔的显色就越浅，因此将显色溶液的吸光度代入标准曲线，可达到定量检测黄曲霉毒素b1的目的。优选地，步骤2)中，竞争反应的条件为：37℃保温保湿环境下进行竞争反应1h。
23.为了保证fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒的类过氧化物酶活性从而改善检测灵敏度和准确性，优选地，步骤3)中，fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
24.①
在氮气保护下，将20ml去离子水与7.5ml盐酸酸化后的fecl3溶液搅拌混合0.5h，然后匀速滴加5ml na2so3溶液，当溶液颜色由红棕色变成黄色时，开始滴加200ml nh3·
h2o溶液并剧烈搅拌，反应沉淀出黑色固体，继续搅拌40min，真空干燥得到fe3o4纳米颗粒；其中，fecl3溶液、na2so3溶液、nh3·
h2o溶液的浓度依次为2mol/l、1mol/l、0.85mol/l；
25.②
将600μl浓度为8.4mg/ml的fe3o4纳米颗粒分散液添加到4ml、0.08mol/l的十六烷基三甲基溴化铵水溶液中得到分散液，将分散液加入到由24ml去离子水、8ml乙二醇和0.57ml nh3·
h2o组成的混合物中，70℃水浴加热并以120rpm的速度搅拌10min，接着加入0.57ml正葵烷搅拌40min，随后逐滴滴加0.14ml的1,3,5-三甲苯搅拌2h以进行均质化，然后加入366μl硅酸四乙酯继续搅拌3h后离心，沉淀即为包覆了sio2层的fe3o4纳米颗粒，然后将其放入含有48mg nh4no3的48ml乙醇中，并在60℃下搅拌2h，然后重复萃取3次以除去十六烷基三甲基溴化铵，离心收集产物，用乙醇洗涤后真空干燥得到fe3o4@sio2纳米颗粒；
26.③
将84mg硝酸铜在18ml去离子水中充分溶解后，用1mol/l的naoh溶液调节ph值为10～11，加入12mg的fe3o4@sio2纳米颗粒，震荡10min使其分散均匀，然后将混合液在80℃下水浴24h，生成黑色沉淀，用去离子水和无水乙醇洗涤两次，真空干燥，得到fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒。
27.本发明采用上述步骤制备所得fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒，呈均匀球形，粒径为50～200nm，具有单斜晶型这一稳定结构，并且经试验证实其具有比其他纳米颗粒更优良的类过氧化物酶催化活性，且其表面能够氨基化后有效偶联第二抗体igg。
28.基于改善第二抗体igg与fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒偶联成功率和偶联效果的考虑，优选地，步骤3)中，表面偶联第二抗体igg的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒在制备时，具体步骤
为：
29.a)将fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒均匀分散于无水乙醇中，然后加入aptes，于80℃冷凝回流24h，然后洗涤、干燥，得到氨基化的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒；然后取氨基化的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒，洗涤后加入交联剂sulfo-smcc振荡0.5h；其中，fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒与aptes的用量比为40mg∶150μl；氨基化的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒与sulfo-smcc的用量比为10mg∶60μl；交联剂sulfo-smcc的浓度为2mg/ml；
30.b)采用pbs稀释第二抗体igg，然后加入含edta的硼酸缓冲液、2-亚氨基硫烷盐酸盐溶液，振荡反应1h；其中，第二抗体igg、pbs、含edta的硼酸缓冲液、2-亚氨基硫烷盐酸盐溶液的体积用量为1.5μl∶20μl∶500μl∶200μl；2-亚氨基硫烷盐酸盐溶液的浓度为2mg/ml；
31.c)将步骤b)得到的反应体系加入到步骤a)得到的反应体系中，混合振荡2h，即得表面偶联第二抗体igg的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒，记为fe3o4@sio2@cuo-igg。
32.进一步地，本发明在制备得到表面偶联第二抗体igg的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒后，先对其洗涤，然后采用ph为3.6的醋酸钠缓冲液稀释成所需浓度的分散液即可。
33.ph、温度和反应时间均会影响fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒的催化活性。为了改善fe3o4@sio2@cuo的催化活性，优选地，步骤4)中，所述缓冲液为ph为3.6的醋酸钠缓冲液；所述水浴避光反应的温度为37℃，时间为10～15min。进一步地，所述终止反应为：加入终止液室温放置4～6min使得反应终止；所述终止液可以采用2m的硫酸溶液。
34.优选地，本发明步骤2)～步骤4)中，所述洗涤为：采用洗涤液洗涤3次，每次3min；所述洗涤液为0.1m的pbst，ph为7.4。
35.本发明中，具体可采用酶标仪测定待测样品的吸光度值。优选地，步骤4)中，测定吸光度时，测定波长为450nm。
36.本发明的有益效果为：
37.本发明方法中，使用具有过氧化物酶催化活性的纳米颗粒(fe3o4@sio2@cuo)，偶联第二抗体(igg)，代替传统酶联免疫分析方法中天然辣根过氧化物酶(hrp)标记的二抗，进行间接竞争酶联免疫法检测afb1。与其他检测afb1的方法相比，本发明方法利用纳米颗粒取代传统间接竞争酶联免疫检测中的hrp，能够有效消除由于hrp不稳定性造成的误差，因而使得检测结果更加准确。同时，由于afb1单克隆抗体能够与样品中的抗原特异性结合，使得检测结果具有很高的特异性。此外，本方法所需仪器简单，易于操作，具有成本低、检测快速灵敏的优点。
38.进一步地，本发明方法经过方法学实验验证，对afb1的检测范围为0.06～61.9ng/ml，检出限为0.0037ng/ml，显著低于国家标准规定谷物农产品中afb1的最大限量(国家标准【gb 2761-2017】规定花生和花生制品afb1限量为2μg/kg，玉米和玉米制品中afb1限量为20μg/kg，小麦和小麦制品中afb1的限量为5μg/kg)。同时，吸光度与标准品浓度对数值的线性关系良好：y＝-0.38903lg(x)+1.109863，相关系数r2＝0.98953，花生、玉米和小麦样品的平均加标回收率分别为105.3％、96.15％和88.15％，可见本发明能够成功应用于实际样品中afb1的检测，具有良好的准确性和重复性，具有较高实际应用和推广价值。
附图说明
39.图1是本发明的间接竞争酶联免疫法检测过程示意图；
40.图2是本发明的间接竞争法酶联免疫检测afb1的标准工作曲线；
41.图3是本发明中afb1标准品浓度对数值与吸光度的线性关系；
42.图4为本发明所制备的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒的透射电子显微镜(tem)图；
43.图5为本发明所制备的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒的元素映射图；
44.图6为本发明所制备的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒的红外光谱(ft-ir)图；
45.图7为本发明所制备的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒的x射线衍射(xrd)图；
46.图8为本发明所制备的fe3o4@sio2@cuo-igg的荧光分析图；
47.图9为本发明所制备的fe3o4、fe3o4@sio2和fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒催化反应的颜色变化图；
48.图10为本发明所制备的fe3o4、fe3o4@sio2和fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒催化反应溶液的紫外吸收光谱图；
49.图11为不同ph的反应体系对fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒催化活性的影响；
50.图12为不同反应温度对fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒催化活性的影响；
51.图13为不同反应时间对fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒催化活性的影响；
52.图14为间接竞争法酶联免疫检测不同真菌毒素与afb1的对比图。
具体实施方式
53.以下结合具体实施例对本发明的检测黄曲霉毒素b1的间接竞争酶联免疫方法进行具体的说明，但这并不限定本发明的技术方案。
54.以下实施例中，涉及的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒，采用如下制备方法制备得到：
55.①
在通有n2的三颈烧瓶中加入20ml去离子水，然后加入7.5ml用盐酸酸化后的fecl3溶液(2mol/l)，搅拌0.5h后匀速滴加5ml na2so3(1mol/l)，当溶液颜色由红棕色变成黄色时，开始缓慢加入200ml浓度0.85mol/l的nh3·
h2o溶液并剧烈搅拌，反应沉淀出黑色固体，在45℃下真空干燥得到fe3o4纳米颗粒。
56.②
将600μl含有fe3o4纳米颗粒的氯仿溶液(8.4mg/ml)添加到4ml的十六烷基三甲基溴化铵(ctab)水溶液(0.08mol/l)中得到分散液，将分散液加入到由24ml去离子水，8ml乙二醇和0.57ml nh3·
h2o组成的混合物中，70℃水浴加热并以120rpm的速度搅拌10min，接着加入0.57ml正葵烷搅拌40min，随后逐滴滴加0.14ml的1，3，5-三甲苯并搅拌2h以进行均质化，随后加入366μl硅酸四乙酯(teds)继续搅拌3h后离心，沉淀即为包覆了sio2层的fe3o4纳米颗粒，然后将其放入含有48mg nh4no3的48ml乙醇中，并在60℃下搅拌2h。重复萃取3次以除去表面活性剂ctab，然后离心收集产物，用乙醇洗涤后在45℃下真空干燥得到fe3o4@sio2纳米颗粒。
57.③
将84mg硝酸铜在18ml去离子水中充分溶解后，用1mol/l的naoh调节溶液的ph值至10～11之间，加入12mg的fe3o4@sio2纳米颗粒，震荡10min使其分散均匀。将混合液在80℃下水浴24h，生成黑色沉淀，用去离子水和无水乙醇洗涤两次，在45℃下真空干燥，得到fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒。
58.以下实施例中，涉及的表面偶联第二抗体igg的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒，具体的偶联步骤为：
59.将40mg fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒悬浮于20ml无水乙醇中，超声均匀后加入150μl
的aptes，在80℃水浴锅中冷凝回流24h。用无水乙醇洗涤后，在45℃下真空干燥，得到氨基化的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒。然后取1.5μl第二抗体igg(兔抗鼠)加到20μl pbs(0.01m)中，然后加入500μl含edta的硼酸缓冲液和200μl的2-亚氨基硫烷盐酸盐溶液(traut’s reagent，2mg/ml)，在振荡器中反应1h。称取10mg氨基化后的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒，用无edta的0.1m pbs洗三次，加入60μl sulfo-smcc(2mg/ml)，震荡0.5h。最后将上述得到的抗体溶液加入到含有纳米颗粒的溶液中，混合震荡2h，得到fe3o4@sio2@cuo-igg。用无菌0.01m pbs清洗三次后，用0.02mol/l醋酸钠缓冲液(ph3.6)稀释成0.5mg/ml浓度保存待用。
60.实施例1
61.本实施例的检测黄曲霉毒素b1的间接竞争酶联免疫方法，示意图见图1，具体步骤如下：
62.1)样品中afb1的提取：称取1g样品(花生、玉米或小麦农产品)磨碎成粉末或小颗粒状，加入5ml提取液(50％甲醇水溶液，v/v)，混匀后置于超声分散器中超声15min，离心(4000rpm，5min)后取3ml上层清液作为待测样品液用于检测使用；
63.2)包被：使用包被缓冲液(0.05mol/l碳酸盐缓冲液，ph9.6)将黄曲霉毒素b1-bsa完全抗原(afb1-bsa)稀释成浓度为1μg/ml，以100ng/孔铺在酶标板上，将酶标板放置于4℃环境中过夜；
64.3)封闭：使用洗涤液(0.1m pbst，ph7.4)洗涤3次，每次3min，拍干后加入封闭液(牛血清蛋白溶液，10mg/ml)，加入量为200μl/孔，于37℃环境中保温保湿2h；
65.4)竞争反应：用洗涤液洗涤3次，每次3min，拍干后向各孔中分别加入50μl待测样品溶液，再加入50μl的afb1单克隆抗体溶液(2μg/ml)，置于37℃保温保湿环境下进行竞争反应1h；
66.5)加入酶标二抗：用洗涤液洗涤3次，每次3min，每孔加入50μl表面偶联第二抗体igg的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒(fe3o4@sio2@cuo-igg)(0.5mg/ml)，置于37℃保温保湿环境下反应1h；
67.6)显色反应：用洗涤液洗涤3次，每次3min，拍干后向每孔加入100μl醋酸钠缓冲液(ph3.6)，再加入6μl现配的tmb显色液，然后在37℃水浴锅中避光反应15min；
68.7)终止反应：在每孔中同时加入50μl终止液(2m h2so4)，室温放置5min使得反应终止；
69.8)测定吸光度(od值)：使用酶标仪，测定波长为450nm处的od值；根据测得的吸光度以及黄曲霉毒素b1的标准工作曲线，测定样品中黄曲霉毒素b1的含量。
70.以上实施例中，涉及的黄曲霉毒素b1的标准工作曲线的建立过程如下：将afb1标准品用50％的甲醇水溶液(v/v)按4倍稀释成15个梯度，使afb1标准品浓度分别为(0.93
×
10-9
)～0.25mg/ml，同时设置空白对照组，共16个梯度；然后进行上述步骤2)～8)的操作，将其中的样品液换成不同浓度的标准品溶液，反应终止后使用酶标仪测定波长450nm处的od值。
71.以afb1标准品浓度以10为底的对数值为横坐标，以450nm处的od值为纵坐标，绘制标准曲线并计算线性回归方程。结果如图2所示，450nm处的od值随afb1标准品浓度的增大而逐渐减小，呈现标准的s型。
72.如图3所示，在0.06～61.9ng/ml范围内，吸光度与标准品浓度的对数值线性关系
良好：y＝-0.38903lg(x)+1.109863，相关系数r2＝0.98953。与阴性对照在450nm处的od值相差0.1以上的最低afb1浓度，被认为是能发生抑制的最低afb1浓度，以此浓度作为检出限，因此本发明方法的检出限为0.0037ng/ml。
73.实验例1 fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒的表征
74.采用透射电子显微镜对制备的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒形貌进行表征，结果见图4。透射电子显微镜图像显示，该纳米颗粒呈均匀球形，粒径范围为50～200nm，平均粒径为100nm左右(参见图4)。fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒的元素映射图(图5)表明，该颗粒中含有fe、si、cu和o元素，且fe元素较集中，为纳米颗粒的内核，其余元素分布较均匀。
75.fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒制备过程中，将各个步骤中制得的fe3o4、fe3o4@sio2和fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒采用傅立叶红外光谱表征元素的特征吸收峰，可观察到图6的结果。纳米fe3o4的ftir光谱在575cm-1
处有一个很强的吸收峰，对应于fe-o键的振动。fe3o4@sio2的光谱在796和1080cm-1
处有附加的峰，归属于对称和不对称的si-o-si伸缩振动。500-600cm-1
附近的吸收峰归属于cu-o键的振动模式，图6表明成功制备fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒。
76.将各个步骤中制得的fe3o4、fe3o4@sio2和fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒利用x射线衍射仪对其晶体结构进行了进一步的精确分析(参见图7)。图7结果表明fe3o4纳米粒子具有六个特征衍射峰(30.2
°
、35.5
°
、43.3
°
、53.7
°
、57.2
°
和62.9
°
)，且六个衍射峰的位置与标准品的基本一致，峰型尖锐，说明本发明成功合成fe3o4纳米粒子。fe3o4@sio2纳米颗粒的谱图与纳米fe3o4相同，但峰强度有所降低。这归因于sio2在fe3o4晶核上的层叠。fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒的x射线衍射图中观察到了和cuo标准品相对应的9个特征峰，证明了fe3o4@sio2@cuo的单斜晶型结构。这些结果进一步证明了fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒的成功制备。
77.实验例2 fe3o4@sio2@cuo偶联抗体fe3o4@sio2@cuo-igg的活性分析
78.利用该间接荧光免疫分析法分析fe3o4@sio2@cuo是否与igg偶联成功。荧光染料alexa flour 488(羊抗兔)可以与二抗igg(兔抗鼠)特异性结合，在荧光显微镜的蓝色激发光照射下显示绿色荧光。取100μl fe3o4@sio2@cuo-igg溶液，加入5μl alexa flour 488荧光染料(羊抗兔)，避光振荡反应12h；用无菌pbs洗涤2～3次，取10μl于载玻片上，在荧光显微镜下观察。实验以未偶联igg的fe3o4@sio2@cuo为对照，结果如图8所示。
79.图8结果表明：fe3o4@sio2@cuo-igg具有明显的绿色荧光，而对照组无荧光，说明igg与fe3o4@sio2@cuo成功偶联。
80.实验例3验证fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒的类过氧化物酶活性并确定最佳反应条件
81.(1)验证fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒的类过氧化物酶活性：以tmb为显色底物，在h2o2存在下进行催化氧化反应，考察了本发明制备的fe3o4、fe3o4@sio2和fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒的类过氧化物酶活性。以50μl天然辣根过氧化物酶(hrp)(25ng/ml)作为阳性对照，分别将50μlfe3o4、fe3o4@sio2和fe3o4@sio2@cuo纳米模拟酶(1mg/ml，溶剂为超纯水)加入到由20μl h2o2(30％)和10μl tmb(10mg/ml，溶剂为dmso)组成的500μl醋酸钠缓冲液(0.2m，ph3.6)中，37℃孵育10分钟后，用紫外-可见分光光度计测定上清液在652nm处的吸光度。
82.如图9所示，含有fe3o4(a1-a4)、fe3o4@sio2(b1-b4)和fe3o4@sio2@cuo(c1-c4)纳米颗粒的溶液被催化后呈蓝色，加入50μl h2so4(0.5mol/l)后反应终止，溶液由蓝色变为黄色，颜色深度与终止前保持一致。
83.吸收光谱如图10所示，在没有纳米颗粒的情况下，阴性对照(tmb-h2o2)在652nm处的吸收峰很微弱(d)，而含有fe3o4@sio2@cuo纳米粒子的反应体系在652nm处有一个强吸收峰(c)，此外，fe3o4@sio2颗粒(b)的催化活性略低于裸露的fe3o4纳米颗粒(a)，这是由于sio2占据了fe3o4的表面，导致催化中心的减少。负载cuo后的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒的催化活性明显增强，这归因于fe3o4和cuo的协同作用。
84.以上结果表明了fe3o4、fe3o4@sio2和fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒都具有类过氧化物酶活性，但是本发明的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒的活性最强。
85.(2)最佳反应条件的确定：fe3o4@sio2@cuo的催化活性受ph、温度和反应时间的综合影响。因此，在不同ph(2.8～7.6)、不同温度(30～60℃)、不同反应时间(0～60min)下，考察了fe3o4@sio2@cuo的相对催化活性，同时以天然辣根过氧化物酶(hrp)为阳性对照，结果如图11～13所示，fe3o4@sio2@cuo在图中以fsc表示。
86.结果表明，该纳米颗粒的催化活性在很宽的ph范围内(从3.0到5.0)保持稳定(图11)，对ph的敏感性低于天然hrp，在30℃至50℃之间具有较高的催化活性，而天然hrp的活性在30℃以上显著下降(图12)。此外，该纳米颗粒在反应时间为10～60min内活性保持稳定，而hrp的催化活性随着反应时间的增加而降低(图13)。因此，ph3.6、37℃、反应时间10min为最佳反应条件，此时fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒的催化活性最强。
87.实验例4方法特异性验证
88.为探究本发明方法对afb1的检测特异性，选择玉米赤霉烯酮(zen)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)和赭曲霉毒素a(ota)三种真菌毒素作为afb1的结构类似物进行与本发明实施例1同样的检测，其中zen、don、ota的浓度为1ng/ml，afb1浓度为0.2ng/ml，同时设置空白对照组。结果如图14所示。
89.由图14可知，即使其他真菌毒素的浓度为afb1浓度的5倍，也根本不会发生竞争反应，不会引起吸光度的变化，表明本发明的测定方法对于afb1的检测具有高度的特异性。
90.实验例5方法准确性和精确性验证
91.为评估本方法的准确性和精确性，采用不发霉的花生、玉米和小麦样品，提取样本溶液，向其中加入不同浓度的afb1标准溶液，作为加标样品进行定量检测，同时设置空白对照。计算加标回收率和相对标准偏差(rsd)，每组实验平行做六次。结果如表1所示。其中，加标回收率的计算方法为：
[0092][0093]
rsd的计算过程为：在实际样品检测过程中，每个样品检测平行重复6次，对应得到6个吸光度数值，计算得到标准偏差。rsd计算公式如下：
[0094][0095]
表1花生、玉米和小麦样品中afb1的加标回收率
[0096][0097]
由表1结果可知，花生、玉米和小麦样品的平均加标回收率分别为105.3％、96.15％和88.15％，表明该分析方法适用于检测花生、玉米和小麦样品中的afb1，且准确度良好。rsd均小于5.7％，表明该方法重复性良好。
[0098]
综上可知，本发明方法使用具有过氧化物酶催化活性的纳米颗粒(fe3o4@sio2@cuo)，偶联第二抗体igg，代替传统酶联免疫分析方法中天然辣根过氧化物酶(hrp)标记的二抗，进行间接竞争酶联免疫法检测afb1。与其他检测afb1的方法相比，本发明方法能够有效消除由于hrp不稳定性造成的误差，因而使得检测结果更加准确。同时，由于afb1单克隆抗体能够与样品中的抗原特异性结合，使得检测结果具有很高的特异性。此外，本方法所需仪器简单，易于操作，具有成本低、检测快速灵敏的优点。进一步地，本发明方法经过方法学实验验证，对afb1的检测范围为0.06～61.9ng/ml，检出限为0.0037ng/ml，显著低于国家标准规定谷物农产品中afb1的最大限量。同时，吸光度与标准品浓度对数值的线性关系良好：y＝-0.38903lg(x)+1.109863，相关系数r2＝0.98953，花生、玉米和小麦样品的平均加标回收率分别为105.3％、96.15％和88.15％，可见本发明能够成功应用于实际样品中afb1的检测，具有良好的准确性和重复性，具有较高实际应用和推广价值。
技术特征：1.一种检测黄曲霉毒素b1的间接竞争酶联免疫方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取待测样品中的黄曲霉毒素b1，得到待测样品溶液；2)将黄曲霉毒素b1-bsa完全抗原包被在酶标板上，然后洗涤、拍干、封闭处理，再同时加入待测样品溶液和黄曲霉毒素b1单克隆抗体溶液进行竞争反应；3)竞争反应后洗涤，然后加入表面偶联第二抗体igg的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒分散液，于保温保湿环境下反应以实现纳米颗粒在酶标板板底的固定；4)步骤3)反应后洗涤、拍干，加入缓冲液和tmb显色液进行避光反应，然后终止反应，采用酶标仪测定吸光度，根据测得的吸光度以及黄曲霉毒素b1的标准工作曲线，实现待测样品中黄曲霉毒素b1的定量检测；其中，黄曲霉毒素b1单克隆抗体溶液的浓度为2μg/ml；表面偶联第二抗体igg的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒分散液的浓度为0.5mg/ml；待测样品溶液、黄曲霉毒素b1单克隆抗体溶液、表面偶联第二抗体igg的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒分散液的体积比为1∶1∶1；步骤3)中，采用的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒呈均匀球形，粒径为50～200nm；表面偶联第二抗体igg的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒在制备时，偶联的步骤为：先采用aptes对fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒进行氨基化改性，然后采用交联剂sulfo-smcc实现第二抗体igg在fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒表面的偶联。2.如权利要求1所述的检测黄曲霉毒素b1的间接竞争酶联免疫方法，其特征在于，步骤1)中，所述待测样品为谷物；提取待测样品中的黄曲霉毒素b1时，采用的提取溶剂为50％甲醇水(v/v)，每克待测样品对应5ml提取溶剂。3.如权利要求1所述的检测黄曲霉毒素b1的间接竞争酶联免疫方法，其特征在于，步骤2)中，黄曲霉毒素b1-bsa完全抗原记为afb1-bsa，所述包被的步骤为：采用碳酸盐包被缓冲液将afb1-bsa稀释到浓度为1μg/ml，然后以100ng/孔铺在酶标板上，将酶标板放置于4℃环境中过夜。4.如权利要求1所述的检测黄曲霉毒素b1的间接竞争酶联免疫方法，其特征在于，步骤2)中，所述封闭处理为：以200μl/孔加入封闭液于37℃环境中保温保湿2h。5.如权利要求1所述的检测黄曲霉毒素b1的间接竞争酶联免疫方法，其特征在于，步骤2)中，竞争反应的条件为：37℃保温保湿环境下竞争反应1h。6.如权利要求1所述的检测黄曲霉毒素b1的间接竞争酶联免疫方法，其特征在于，步骤3)中，fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
①
在氮气保护下，将20ml去离子水与7.5ml盐酸酸化后的fecl3溶液搅拌混合0.5h，然后滴加5ml na2so3溶液，当溶液颜色由红棕色变成黄色时，开始滴加200ml nh3·
h2o溶液并剧烈搅拌，反应沉淀出黑色固体，继续搅拌40min，真空干燥得到fe3o4纳米颗粒；其中，fecl3溶液、na2so3溶液、nh3·
h2o溶液的物质的量浓度依次为2mol/l、1mol/l、0.85mol/l；
②
将600μl浓度为8.4mg/ml的fe3o4纳米颗粒分散液添加到4ml、0.08mol/l的十六烷基三甲基溴化铵水溶液中，然后将其加入到由24ml去离子水、8ml乙二醇和0.57ml nh3·
h2o组成的混合物中，70℃水浴加热并以120rpm的速度搅拌10min，接着加入0.57ml正葵烷搅拌40min，随后逐滴滴加0.14ml的1,3,5-三甲苯搅拌2h以进行均质化，然后加入366μl硅酸四乙酯继续搅拌3h后离心，沉淀即为包覆了sio2层的fe3o4纳米颗粒，然后将其放入含有48mg nh4no3的48ml乙醇中，并在60℃下搅拌2h，然后重复萃取3次以除去十六烷基三甲基溴化铵，
离心收集产物，用乙醇洗涤后真空干燥得到fe3o4@sio2纳米颗粒；
③
将84mg硝酸铜在18ml去离子水中充分溶解后，用1mol/l的naoh溶液调节ph值为10～11，加入12mg的fe3o4@sio2纳米颗粒，震荡10min使其分散均匀，然后将混合液在80℃下水浴24h，生成黑色沉淀，用去离子水和无水乙醇洗涤两次，真空干燥，得到fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒。7.如权利要求1或6所述的检测黄曲霉毒素b1的间接竞争酶联免疫方法，其特征在于，步骤3)中，表面偶联第二抗体igg的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒在制备时，具体步骤为：a)将fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒均匀分散于无水乙醇中，然后加入aptes，于80℃冷凝回流24h，然后洗涤、干燥，得到氨基化的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒；然后取氨基化的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒，洗涤后加入交联剂sulfo-smcc振荡0.5h；其中，fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒与aptes的用量比为40mg∶150μl；氨基化的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒与sulfo-smcc的用量比为10mg∶60μl；交联剂sulfo-smcc的浓度为2mg/ml；b)采用pbs稀释第二抗体igg，然后加入含edta的硼酸缓冲液、2-亚氨基硫烷盐酸盐溶液，振荡反应1h；其中，第二抗体igg、pbs、含edta的硼酸缓冲液、2-亚氨基硫烷盐酸盐溶液的体积用量依次为1.5μl∶20μl∶500μl∶200μl；2-亚氨基硫烷盐酸盐溶液的浓度为2mg/ml；c)将步骤b)得到的反应体系加入到步骤a)得到的反应体系中，混合振荡2h，即得表面偶联第二抗体igg的fe3o4@sio2@cuo纳米颗粒，记为fe3o4@sio2@cuo-igg。8.如权利要求1～6任一项所述的检测黄曲霉毒素b1的间接竞争酶联免疫方法，其特征在于，步骤4)中，所述缓冲液为ph为3.6的醋酸钠缓冲液；所述水浴避光反应的温度为37℃，时间为10～15min；所述终止反应为：加入终止液室温放置4～6min使得反应终止；所述终止液为2m的硫酸溶液。9.如权利要求1～6任一项所述的检测黄曲霉毒素b1的间接竞争酶联免疫方法，其特征在于，步骤2)～步骤4)中，所述洗涤为：采用洗涤液洗涤3次，每次3min；所述洗涤液为0.1m的pbst，ph为7.4。10.如权利要求1～6任一项所述的检测黄曲霉毒素b1的间接竞争酶联免疫方法，其特征在于，步骤4)中，测定吸光度时，测定波长为450nm。
技术总结本发明属于毒素分析检测技术领域，具体涉及一种检测黄曲霉毒素B1的间接竞争酶联免疫方法。本发明的黄曲霉毒素B1的检测方法，采取间接竞争法，首先将完全抗原AFB1-BSA固定在板底，封闭后同时加入AFB1单克隆抗体和AFB1待测样品，然后加入表面偶联第二抗体IgG的Fe3O4@SiO2@CuO纳米颗粒，通过IgG和单克隆抗体的结合，实现纳米颗粒在板底的固定，从而催化TMB底物显色，通过建立AFB1标准曲线，最终实现对AFB1标准品及实际样品的定量检测。本发明的上述方法，易于操作、成本低、检测快速灵敏，且能够消除由于天然过氧化物酶不稳定性造成的误差，检测结果准确可靠，并且特异性高。并且特异性高。并且特异性高。
技术研发人员：王雪琴 陶海珍 李瑞芳 王子朝 赵英源 陈旭阳 赵宣平 刘传
受保护的技术使用者：河南工业大学
技术研发日：2022.07.14
技术公布日：2022/11/1
