1.本发明涉及生物医药下游分离纯化领域，具体涉及一种窄粒径分布琼脂糖凝胶微球的制备方法。
背景技术：2.琼脂糖是一种由多个半乳糖交替连接形成的线性多糖，主要由1,3连结的β-d-半乳糖和1,4连结的3,6-内醚-l-半乳糖交替连接构成。琼脂糖亲水性好，并且几乎不存在带电基团，对敏感的生物大分子极少引起变性，常作为层析介质用于生物医药的分离纯化。琼脂糖分子结构的糖链之间存在次级链(氢键)，因此在合适条件下可维持凝胶网状结构，并且琼脂糖凝胶微球具有五角形的大孔，可以容许大分子量的物质扩散，这也是其应用于生物大分子分离纯化的优势所在。
3.琼脂糖凝胶微球是一种多孔、亲水、不含带电基团、生物相容性好的天然多糖型生物层析填料。并且因为琼脂糖凝胶微球富含多羟基，可通过化学键合获得具有不同功能基团的衍生物微球，从而应用于不同类型的层析工艺。目前，琼脂糖凝胶微球主要用于分离纯化病毒、蛋白质、酶、多肽等大分子生物活性物质，在生物医药、血液制品、疫苗、化妆品及保健品等行业应用广泛。
4.目前，层析分离中主要应用的琼脂糖微球，如sepharose系列，以及以此为基础偶联不同配基所制备的一系列疏水、亲和、离子交换层析微球等，其平均粒径均在90μm左右，粒径分布范围一般在45～165μm之间(林楠.常规膜乳化法制备大粒径琼脂糖微球.diss.北京:北京化工大学,2009.)。近年来，研究人员对琼脂糖凝胶微球的制备做了不少工作。在公告号为cn108905977a的专利中报道了一种琼脂糖凝胶微球的制备方法，以琼脂糖固体为基质，经交联剂活化后与硫酸酐反应，得到硫酸酐琼脂糖，再将其制备成所述琼脂糖凝胶微球，所得的微球尺寸在10～1000μm。在公告号为cn111073061a的专利中公开了一种通过两相成球法制备的琼脂糖凝胶微球，其粒径集中在20～300μm。此外，在公告号为cn1304101c的专利中公开了一种膜乳化法结合机械搅拌法制备的琼脂糖凝胶微球，得到的微球尺寸在1～100μm，其工艺流程较长，对设备要求较高。
5.在琼脂糖凝胶微球实际制备过程中，由于小乳滴易被大乳滴吸收，而大乳滴又在剪切力的作用下产生小乳滴，因而所制备的琼脂糖凝胶微球常出现粒径分布不均、粒径分布范围过大等问题。
6.总的来说，制备粒径在45～165μm之间(层析分离中主要应用的琼脂糖微球的粒径范围)、窄粒径分布的琼脂糖凝胶微球依旧是目前研究的难点。因此，开发窄粒径分布并且工艺简单的琼脂糖凝胶微球的制备工艺，对促进我国生物医药产业，特别是下游层析分离纯化领域的健康发展具有重要意义。
技术实现要素：7.针对琼脂糖凝胶微球制备过程中常出现的粒径分布过宽，以及获得粒径均一琼脂
糖凝胶微球工艺流程较长、设备要求较高等问题，本发明提供了一种窄粒径分布琼脂糖凝胶微球的制备方法，制备得的琼脂糖凝胶微球中粒径范围在50～160μm内的微球占比不低于85％。
8.本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种合成简便，窄粒径分布，易于规模放大生产的琼脂糖凝胶微球的制备方法。
9.本发明实现上述目的采用的技术方案是：
10.一种窄粒径分布琼脂糖凝胶微球的制备方法，包括以下步骤：
11.(1)将琼脂糖加入至去离子水中，搅拌并加热至琼脂糖完全溶解，待澄清溶胶形成后，持续搅拌下，加入葡聚糖和na2hpo4，继续搅拌5～30min，搅拌速率为100～200rpm，得到a液；
12.所述琼脂糖、所述去离子水、所述葡聚糖、所述na2hpo4的比例为0.2～3g:20ml:0.001～0.1g:0.1～1g；
13.所述葡聚糖以水溶液形式加入，葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为0.1～5％；
14.所述na2hpo4以水溶液形式加入，na2hpo4水溶液中na2hpo4的质量浓度为0.05～0.5g ml-1
；
15.(2)将乳化剂加入到油相中并加热至60～120℃，持续搅拌20～30min，搅拌速率为250～350rpm，得到b液；
16.所述乳化剂为span80和tween80的组合，其中span80和tween80的质量比为1～10:1；
17.所述油相和所述去离子水的体积比为10～100:20；
18.所述b液中，乳化剂的质量浓度为1～10％；
19.(3)将步骤(1)所得的a液加入到步骤(2)所得的b液中，持续搅拌，搅拌速率为100～200rpm，乳化一定时间，得到相应产物；
20.(4)将步骤(3)所得的产物降温固化，静置分层后，移去上层油层，使用洗涤剂除去下层产物中的油相，得到所述窄粒径分布琼脂糖凝胶微球。
21.优选地，在步骤(1)中，所述琼脂糖、所述去离子水、所述葡聚糖、所述na2hpo4的比例为0.6～2g:20ml:0.001～0.02g:0.1～0.5g。
22.优选地，在步骤(2)中，所述油相为甲苯、正辛烷、液体石蜡、正庚烷中的一种或几种，进一步优选为甲苯。
23.优选地，在步骤(2)中，所述油相和所述去离子水的体积比为60～80:20。
24.优选地，在步骤(2)中，所述b液中，乳化剂的质量浓度为2～5％。
25.优选地，在步骤(2)中，所述乳化剂中span80和tween80的质量比为2～6:1。
26.优选地，在步骤(3)中，所述乳化的时间为10～60min。
27.优选地，在步骤(3)中，在所述乳化的过程中，即时取样至光学显微镜下观察，获得预期凝胶微球尺寸后，停止乳化。
28.优选地，在步骤(4)中：
29.所述洗涤剂为乙醇、水、丙酮、正己烷中的一种或几种；进一步优选为乙醇和水的组合，其中乙醇的体积分数为10％。
30.本发明采用改进的两相成球法制备琼脂糖凝胶微球，为了有效调控琼脂糖凝胶微球的粒径分布，本发明的改进之处在于：
31.(a)使用葡聚糖溶液预改性琼脂糖溶胶，通过葡聚糖分子与琼脂糖分子的交叉互联有效减少琼脂糖分子间的相互碰撞，有效避免琼脂糖分子间的过度交联；
32.(b)使用na2hpo4有效改善琼脂糖-葡聚糖混合溶液的离子环境，促进两分子的交联进程；
33.(c)在乳化工艺中，选用质量比为1～10：1的span80和tween80作为乳化剂，该乳化剂组合为双功能乳化剂，其中span80的亲水亲油平衡值为4.3，tween80的亲水亲油平衡值为15.0，在该质量比条件下，得到的乳状液的稳定性好，并通过设置搅拌速率为100～200rpm，有效避免了大乳滴在搅拌过程中因剪切力作用而产生过多的小乳滴；
34.(d)为使制备所得琼脂糖凝胶微球的粒径分布更加集中，调节琼脂糖、去离子水、葡聚糖、na2hpo4、油相及油相中双功能乳化剂的比例。在该比例下，葡聚糖、na2hpo4的改性作用与双功能乳化剂的乳化作用能达到良好的协同效果，保证了乳状液的稳定性，利于制备窄粒径分布的琼脂糖凝胶微球。实施例1为优选条件下的实施例，所制备的琼脂糖凝胶微球的粒径分布集中，其中粒径在50～160μm的微球占比达到96％以上。
35.本发明与现有技术相比，其有益效果至少体现在：
36.1、与膜乳化法、高压喷射法相比，本发明提供的制备方法工艺简单、对设备要求低、易于规模工业生产。
37.2、本发明提供的制备方法的反应条件温和、生产周期短、对环境污染较小。
38.3、本发明提供的制备方法所得琼脂糖凝胶微球的粒径分布集中，在实施例1中制备的琼脂糖凝胶微球的粒径集中分布在50～160μm内，其占比达到96％以上。50～160μm是层析分离中主要应用的琼脂糖凝胶微球的粒径范围，因而本发明提供的方法极大降低了凝胶微球的筛分成本。
39.4、本发明提供的制备方法所得琼脂糖凝胶微球的粒径易于调控，可根据不同的目标粒径调控乳化时间得到不同粒径的凝胶微球产品，应用范围广。
附图说明
40.图1为实施例1所得琼脂糖凝胶微球的光学显微镜图；
41.图2为实施例1所得琼脂糖凝胶微球的粒径分布图。
具体实施方式
42.下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
43.实施例1
44.在100ml三口烧瓶中，加入0.85g琼脂糖和20ml水，充分搅拌下，升温至105℃，直至琼脂糖完全溶解，并形成澄清透明的溶胶。此时降温至80℃，持续搅拌下，缓慢滴加2ml 0.2％的葡聚糖溶液和2ml 0.1gml-1
的na2hpo4溶液，机械搅拌速率为150rpm，继续搅拌20min，将此混合液记为a液。
45.在250ml三口烧瓶中，依次加入70ml甲苯，2.25g span80和0.75gtween80乳化剂，温度设为70℃，搅拌速率为300rpm，搅拌30min，将该溶液标记为b液。
46.随后，将a液迅速倒入b液中，持续充分搅拌，搅拌速率为150rpm，乳化30min时，取样至光学显微镜下观察，此时凝胶微球达到理想尺寸，迅速降温固化。静置分层，移去上层油相，下层充分洗涤，得到目标产品，保存于水中。
47.图1为实施例1所得琼脂糖凝胶微球的光学显微镜图，其粒径分布均匀；图2为实施例1所得的琼脂糖凝胶微球的粒径分布图，其粒径分布窄，其中粒径在50～160μm的微球占比达到96％以上。
48.实施例2
49.在100ml三口烧瓶中，加入2.45g琼脂糖和20ml水，充分搅拌下，升温至105℃，直至琼脂糖完全溶解，并形成澄清透明的溶胶。此时降温至80℃，持续搅拌下，缓慢滴加3ml 1.0％的葡聚糖溶液和6ml 0.1gml-1
的na2hpo4溶液，机械搅拌速率为150rpm，继续搅拌20min，将此混合液记为a液。
50.在250ml三口烧瓶中，依次加入50ml甲苯，4.00g span80和0.50gtween80乳化剂，温度设为70℃，搅拌速率为300rpm，搅拌30min，将该溶液标记为b液。
51.随后，将a液迅速倒入b液中，持续充分搅拌，搅拌速率为150rpm，乳化40min时，取样至光学显微镜下观察，此时凝胶微球达到理想尺寸，迅速降温固化。静置分层，移去上层油相，下层充分洗涤，得到目标产品，保存于水中。通过实施例2所得琼脂糖凝胶微球的粒径集中在20～250μm，其中粒径范围在50～160μm的微球占比达到85％以上。
52.对比例1
53.对比例1与实施例1的区别仅在于葡聚糖的用量。
54.在100ml三口烧瓶中，加入0.85g琼脂糖和20ml水，充分搅拌下，升温至105℃，直至琼脂糖完全溶解，并形成澄清透明的溶胶。此时降温至80℃，持续搅拌下，缓慢滴加2ml 6％的葡聚糖溶液和2ml 0.1g ml-1
的na2hpo4溶液，机械搅拌速率为150rpm，继续搅拌20min，将此混合液记为a液。
55.在250ml三口烧瓶中，依次加入70ml甲苯，2.25g span80和0.75gtween80乳化剂，温度设为70℃，搅拌速率为300rpm，搅拌30min，将该溶液标记为b液。
56.随后，将a液迅速倒入b液中，持续充分搅拌，搅拌速率为150rpm，乳化30min时，迅速降温固化。静置分层，移去上层油相，下层充分洗涤，得到目标产品，保存于水中。通过对比例1得到的琼脂糖凝胶微球的粒径为20～550μm。
57.对比例2
58.对比例2与实施例1的区别仅在于na2hpo4的用量。
59.在100ml三口烧瓶中，加入0.85g琼脂糖和20ml水，充分搅拌下，升温至105℃，直至琼脂糖完全溶解，并形成澄清透明的溶胶。此时降温至80℃，持续搅拌下，缓慢滴加2ml 0.2％的葡聚糖溶液和2ml 0.6gml-1
的na2hpo4溶液，机械搅拌速率为150rpm，继续搅拌20min，将此混合液记为a液。
60.在250ml三口烧瓶中，依次加入70ml甲苯，2.25g span80和0.75gtween80乳化剂，温度设为70℃，搅拌速率为300rpm，搅拌30min，将该溶液标记为b液。
61.随后，将a液迅速倒入b液中，持续充分搅拌，搅拌速率为150rpm，乳化30min时，迅
速降温固化。静置分层，移去上层油相，下层充分洗涤，得到目标产品，保存于水中。通过对比例2得到的琼脂糖凝胶微球的粒径为30～600μm。
62.对比例3
63.对比例3与实施例1的区别仅在于乳化剂中span80和tween80的比例。
64.在100ml三口烧瓶中，加入0.85g琼脂糖和20ml水，充分搅拌下，升温至105℃，直至琼脂糖完全溶解，并形成澄清透明的溶胶。此时降温至80℃，持续搅拌下，缓慢滴加2ml 0.2％的葡聚糖溶液和2ml 0.1gml-1
的na2hpo4溶液，机械搅拌速率为150rpm，继续搅拌20min，将此混合液记为a液。
65.在250ml三口烧瓶中，依次加入70ml甲苯，2.8g span80和0.2gtween80乳化剂，温度设为70℃，搅拌速率为300rpm，搅拌30min，将该溶液标记为b液。
66.随后，将a液迅速倒入b液中，持续充分搅拌，搅拌速率为150rpm，乳化30min时，迅速降温固化。静置分层，移去上层油相，下层充分洗涤，得到目标产品，保存于水中。通过对比例3得到的琼脂糖凝胶微球粒径过于分散，其粒径为10～750μm。
67.对比例4
68.对比例4与实施例1的区别仅在于甲苯的用量。
69.在100ml三口烧瓶中，加入0.85g琼脂糖和20ml水，充分搅拌下，升温至105℃，直至琼脂糖完全溶解，并形成澄清透明的溶胶。此时降温至80℃，持续搅拌下，缓慢滴加2ml 0.2％的葡聚糖溶液和2ml 0.1gml-1
的na2hpo4溶液，机械搅拌速率为150rpm，继续搅拌20min，将此混合液记为a液。
70.在250ml三口烧瓶中，依次加入130ml甲苯，2.25g span80和0.75g tween80乳化剂，温度设为70℃，搅拌速率为300rpm，搅拌30min，将该溶液标记为b液。
71.随后，将a液迅速倒入b液中，持续充分搅拌，搅拌速率为150rpm，乳化30min时，迅速降温固化。静置分层，移去上层油相，下层充分洗涤，得到目标产品，保存于水中。通过对比例4得到的琼脂糖凝胶微球粒径为30～600μm。
72.此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
技术特征：1.一种窄粒径分布琼脂糖凝胶微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将琼脂糖加入至去离子水中，搅拌并加热至琼脂糖完全溶解，待澄清溶胶形成后，持续搅拌下，加入葡聚糖和na2hpo4，继续搅拌5～30min，搅拌速率为100～200rpm，得到a液；所述琼脂糖、所述去离子水、所述葡聚糖、所述na2hpo4的比例为0.2～3g:20ml:0.001～0.1g:0.1～1g；所述葡聚糖以水溶液形式加入，葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为0.1～5％；所述na2hpo4以水溶液形式加入，na2hpo4水溶液中na2hpo4的质量浓度为0.05～0.5g ml-1
；(2)将乳化剂加入到油相中并加热至60～120℃，持续搅拌20～30min，搅拌速率为250～350rpm，得到b液；所述乳化剂为span80和tween80的组合，其中span80和tween80的质量比为1～10:1；所述油相和所述去离子水的体积比为10～100:20；所述b液中，乳化剂的质量浓度为1～10％；(3)将步骤(1)所得的a液加入到步骤(2)所得的b液中，持续搅拌，搅拌速率为100～200rpm，乳化一定时间，得到相应产物；(4)将步骤(3)所得的产物降温固化，静置分层后，移去上层油层，使用洗涤剂除去下层产物中的油相，得到所述窄粒径分布琼脂糖凝胶微球。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中：所述琼脂糖、所述去离子水、所述葡聚糖、所述na2hpo4的比例为0.6～2g:20ml:0.001～0.02g:0.1～0.5g。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述油相为甲苯、正辛烷、液体石蜡、正庚烷中的一种或几种。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述油相和所述去离子水的体积比为60～80:20。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述b液中，乳化剂的质量浓度为2～5％。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述乳化剂中span80和tween80的质量比为2～6:1。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述乳化的时间为10～60min。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，在所述乳化过程中，即时取样至光学显微镜下观察，获得预期凝胶微球尺寸时，停止乳化。9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述洗涤剂为乙醇、水、丙酮、正己烷中的一种或几种。
技术总结本发明公开了一种窄粒径分布琼脂糖凝胶微球的制备方法。该方法使用葡聚糖预改性琼脂糖，添加Na2HPO4、双功能乳化剂，调节试剂配比及乳化工艺，经固化、洗涤得到窄粒径分布的琼脂糖凝胶微球。本发明可制得粒径集中在50～160μm的琼脂糖凝胶微球。该制备方法的有益效果：与微膜乳化法及高压喷射法相比，工艺简单、对设备要求低、易于放大生产；反应条件温和、生产周期短；琼脂糖凝胶微球的粒径分布集中；可通过调控乳化时间得到不同粒径的凝胶微球，应用范围广。用范围广。用范围广。
技术研发人员：徐偲 王晓钟 戴立言 陈英奇
受保护的技术使用者：浙江大学衢州研究院
技术研发日：2022.05.23
技术公布日：2022/11/1
