黄芩素在制备治疗脆性X染色体综合征的药物中的应用

黄芩素在制备治疗脆性x染色体综合征的药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及一种治疗遗传性智力与认知功能障碍性疾病的药物的应用，特别涉及一种治疗脆性x染色体综合征的药物的应用，属于药物应用技术领域。


背景技术：

2.脆性x染色体综合征(又称martin-bell综合征)是由于在人体内x染色体形成过程中脆性x智力低下基因(fmr1)的突变所导致。在x染色体的一段dna中，由于遗传的关系有时会发生改变，一种为完全改变，另一种为dna过度甲基化。如果这两种改变的程度较小，那么患者在临床表现方面可以没有特殊的症状或者只有轻微的症状。反之，如果这两种改变的程度较大，就可能出现如下所述的脆性x综合征的种种症状，例如认知障碍、语言障碍等。
3.脆性x染色体综合征(fragile x syndrome,fxs)不仅是一种常见的遗传性智力与认知功能障碍性疾病，而且是引起孤独症谱系障碍最常见的单基因缺陷性疾病，主要表现为智力障碍、社交互动障碍与认知障碍等，极大地影响了患者的行为能力与生活质量，迫切需要有效的临床治疗方案。
4.fxs疾病的发生主要是由于x染色体上脆性x智力低下基因(fmr1)突变，从而导致脆性x智力低下蛋白(fmrp)的功能缺失所引起。尽管人们对脆性x染色体综合征的病因有着浓厚的研究兴趣，特别是它有可能成为解析孤独症成因的有效途径之一，但是该疾病背后的确切病因机制仍然未被阐明。
5.目前临床上仍然缺乏有效治疗fxs的方法，并且大多数针对fxs的治疗方法都是基于其特定的症状制定的，这也导致缺少足够的对照实验来证明这些方法的有效性，只有通过精神药理学干预与其他支持性策略相结合，包括言语治疗、感觉统合职业治疗、个性化教育计划和量身定制的行为干预，才能最大限度地发挥治疗效果。
6.如今兴奋剂是治疗fxs中最常见的药物，但这些药物的功效及其副作用也是因人而异，最常用的治疗药物是兴奋剂。虽然兴奋剂针对患有fxs的年幼男性的多动症、冲动和注意力不集中的症状有效，但患有fxs的成年男性对兴奋剂的反应却较低。
7.尽管现在已然开展系列针对促代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptor 5，mglur5)、糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3β，gsk-3β)和γ－氨基丁酸(γ-aminobutyric acid， gaba)受体的药物研究，但是这种单一药物的治疗效果只在动物实验有明显结果，而在临床实验中效果并不明显。单一药物治疗的研究结果说明动物实验与临床试验之间存在差距，提示现有的单一药物的治疗策略未达到临床治疗的需求。另外还使用选择性血清素再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitors，ssris)作为治疗与fxs相关的情绪障碍、焦虑和强迫行为的药物，该类药物在缓解社交焦虑、发脾气和攻击性方面等行为中具有疗效；此外，还使用抗精神病药物治疗fxs，但是抗精神病药物相关的副作用如体重增加、糖尿病、恶心、便秘和迟发性运动障碍等导致效果差。非典型抗精神病药也被用于治疗自伤、攻击性行为和孤独症，虽然非典型抗精神病药物阿立哌唑(aripiprazole)在情绪稳定、注意力和学习成绩方面有所改善，但其应
在低剂量下使用，以避免高剂量引起的躁动，而且其产生的副作用也不容小觑。
8.神经系统疾病生理病理过程极为复杂，预后差，仍然缺乏有效的治疗措施。fxs是近年来引起高度重视的一种单基因遗传疾病，发病率仅次于唐氏综合征的遗传性智力低下疾病。 fxs导致的智力障碍给患者及其家人带来了生理及心理的巨大痛苦，漫长的病程给家庭和社会带来了沉重的负担。通过精神药理学干预与其他支持性策略相结合，包括言语治疗、感觉统合职业治疗、个性化教育计划和量身定制的行为干预，才能最大限度地发挥治疗效果。
9.但是迄今为止，依然缺乏有效的治疗药物可以治愈或者缓解该疾病患者的主要不良症状。因此，探索脆性x染色体综合征的病因机制并开发新的治疗药物迫在眉睫。而且研究fmrp 缺失后导致异常表达的基因和蛋白，并考察相关靶点异常表达对神经元在结构，形态和功能的具体影响，可以为综合治疗fxs寻找新的药物干预靶点提供积极的临床应用价值和深刻的社会意义。
10.黄芩(scutellaria baicalensis georgi)，别名山茶根、土金茶根，是唇形科黄芩属多年生草本植物；肉质根茎肥厚，叶坚纸质，披针形至线状披针形，总状花序在茎及枝上顶生，花冠紫、紫红至蓝色，花丝扁平，花柱细长，花盘环状，子房褐色，小坚果卵球形，花果期7～9月.黄芩的根入药，味苦、性寒，有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效。主治温热病、上呼吸道感染、肺热咳嗽、湿热黄胆、肺炎、痢疾、咳血、目赤、胎动不安、高血压、痈肿疖疮等症。黄芩的临床抗菌性比黄连好，而且不产生抗药性。
11.黄芩素(bai)是从黄芩根中提取的一种黄酮类化合物，已列入《中国药典》。bai是黄芩根中的主要活性化合物之一，具有类黄酮结构的植物源性ahr激动剂。bai由于具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗菌和抗肿瘤及神经保护作用，能够对帕金森病、阿尔茨海默病和脑缺血损伤等神经疾病起到治疗作用。然而，目前黄芩素在治疗fxs上的应用尚未见报道。
12.为了探索黄芩素对脆性x染色体综合征疾病的治疗作用及作用效果，发明人进行了体外神经干细胞增殖、分化实验；体外新生神经元树突复杂度实验和认知功能调控实验。


技术实现要素：

13.本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题，提供黄芩素治疗遗传性智力与认知功能障碍性疾病的性能和功效，尤其是针对脆性x染色体综合征的药物中的新应用，提供黄芩素的新的药用用途。
14.为实现上述目的，本发明一方面提供黄芩素在制备治疗遗传性智力与认知功能障碍性疾病的药物中的应用。
15.其中，所述遗传性智力与认知功能障碍性疾病为孤独症、脆性x染色体综合征或与相关神经发育障碍性疾病认知功能障碍，优选为脆性x染色体综合征。
16.特别是，所述药物由黄芩素和药学上可接受的载体组成。
17.所述黄芩素纯度≥60％，优选为超过90％，进一步优选为超过95％。
18.所述药学上可接受的载体通常被认可用于这一目的且作为药剂的非活性成分。有关药学上可接受的载体的汇编可以在《药物赋形剂手册》(handbook of pharmaceutical excipients，第2版，由a.wade和p.j.weller编辑；american pharmaceutical association出版， washington and the pharmaceutical press，london，1994)等工具书中找到。
19.本发明中所述的黄芩素在用于治疗脆性x染色体综合征时，可以单独使用，也可以通过含有黄芩素的药物组合物的形式使用。
20.本发明所述药物通过胃肠道给药或/和非胃肠道给药途径给药。
21.所述的非胃肠道给药途径选自注射给药、呼吸道给药、皮肤给药、粘膜给药或腔道给药。
22.非胃肠道给药制剂选自注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂等；胃肠道给药制剂选自片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、乳剂或糖浆剂等。
23.本发明提供以黄芩素为活性成分，用于治疗脆性x染色体综合征的药物和相应的药物剂型。
24.其中，所述药物以口服制剂、注射剂或局部给药制剂形式存在。
25.特别是，所述口服制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂或溶液剂；所述注射剂包括注射液剂型或注射用冻干粉针剂型；局部给药制剂包括霜剂、软膏剂、喷雾剂、气雾剂或贴剂。
26.其中，所述药物制剂是以所述黄芩素为有效活性成分，并包括了药剂学上可接受的其它载体组分。
27.药物中的载体包括赋形剂，如淀粉、水等；润滑剂，如硬脂酸镁等；崩解剂，如微晶纤维素等；填充剂，如乳糖等；粘结剂，如预胶化淀粉、糊精等；甜味剂；抗氧化剂；防腐剂；矫味剂；香料等。
28.在制备口服制剂时可选用的载体可以是淀粉、糊精或环糊精及各种化学修饰环糊精、蔗糖、硬脂酸盐等常规制药辅料。在制备冻干粉针剂时可以通过无菌喷雾干燥、低温真空干燥、冷冻干燥等方法制备。各制剂的后期制备工艺及设备均属于制药领域的常规技术，本发明对此不作限定。
29.本发明中所述药物以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂、凝胶剂、巴布剂形式存在，即药物制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂、凝胶剂、巴布剂等形式，但不局限于以上形式。
30.本发明与现有技术相比，具有如下的优点、好处：
31.1、本发明对已知化合物黄芩素发掘了新的药用价值，将其用于治疗脆性x染色体综合征，并可以制备成治疗脆性x染色体综合征的药物，为中药材黄芩的应用开拓了一个新的应用领域。
32.2、本发明使用黄芩素进行体外神经干细胞试验，结果表明：黄芩素显著抑制fmr1ko小鼠体外成体神经干细胞的增殖，而对wt小鼠成体神经干细胞的增殖没有影响；黄芩素显著促进fmr1ko小鼠体外成体神经干细胞的神经元分化，而对wt小鼠成体神经干细胞的分化没有影响。
33.3、本发明使用黄芩素进行体外新生神经元树突复杂度试验，结果表明：fmr1ko小鼠的海马新生神经元相较于wt小鼠海马新生神经元的树突复杂度降低，树突长度减少、树突节点数和树突末端数量均减少。黄芩素干预后可以显著促进体外培养fmr1ko小鼠的海马新生神经元的树突复杂度，增加了树突长度、树突节点数和树突末端数量。
34.4、本发明对fmr1基因缺陷型动物(fmr1ko小鼠)认知功能实验证明，黄芩素可以矫
正 fmr1ko小鼠的认知功能障碍与社交互动障碍；通过调控神经发生提高fmr1ko小鼠的空间记忆能力、改善fmr1ko小鼠的模式分离认知功能缺陷；通过调控成体神经发生提高fmr1ko 小鼠的学习记忆力；通过调控神经发生矫正并改善fmr1ko小鼠的社交互动障碍。
35.5、本发明的黄芩素的药理作用强，用于治疗脆性x染色体综合征的功效显著，见效快、毒副作用小、安全性好，能够长期服用，具有良好的药用前景。
36.6、本发明的产品原料来源丰富、价廉、临床使用安全，制备工艺简单，可制成各种剂型，且服量小，使用方便，因此易于推广。
附图说明
37.图1a为神经干细胞体外增殖显微镜观察图；
38.图1b为神经干细胞体外增殖统计图；
39.图1c为神经干细胞体外分化显微镜观察图；
40.图1d为神经干细胞体外分化统计图；
41.图2a为体外培养p0天海马神经元显微观察图；
42.图2b为原代海马神经元sholl分析实验方案示意图；
43.图2c为原代海马神经元树突复杂性sholl分析统计图；
44.图2d为原代海马新生神经元树突长度sholl分析统计图；
45.图2e为原代海马新生神经元树突节点数量sholl分析统计图；
46.图2f为原代海马新生神经元树突末端数量sholl分析统计图；
47.图3a为小鼠新位置识别实验示意图；
48.图3b为小鼠新位置识别实验判别指数统计图；
49.图4a为小鼠模式分离实验示意图；
50.图4b为小鼠模式分离实验判别指数统计图；
51.图5a为小鼠新物体识别实验示意图；
52.图5b为小鼠新物体识别实验判别指数统计图；
53.图6a为小鼠社交互动实验示意图；
54.图6b为小鼠社交互动实验判别指数统计图。
具体实施方式
55.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
56.试验例1神经干细胞增殖、分化实验
57.一、实验材料
58.1、实验动物：
59.雄性野生型(wild-type，wt，或fmr1
+/y
)小鼠，购自中国医学科学院医学实验动物研究所。
60.雌性fmr1基因敲除(knock out，ko)小鼠(fmr1ko，或fmr1-/-)，购自杰克逊实验室。
61.fmr1基因敲除(knock out，ko)，可以用fmr1ko代表，也可以用fmr1-/-(雌鼠)/fmr1-/y
(雄鼠)。雄性野生型(wild-type，wt)，可用wt代表，也可用fmr1
+/+
(雌鼠)/fmr1
+/y
(雄鼠)。
62.所有小鼠在天津中医药大学实验动物中心进行繁殖饲养，无特定病原体级(spf级)动物饲养室，饲养温度为22-25℃，采用12小时照明/12小时黑暗的昼夜节律周期，小鼠可以自由摄取水和食物，通过天津中医药大学动物伦理委员会的批准和认可。小鼠生长到八周后达到成熟时，将雌鼠het(fmr1-/+
)与雄鼠wt按照1：2比例的合笼繁殖。选用p0天小鼠，取大脑海马进行神经元原代培养。
63.如前所述，脆性x染色体综合征的发生主要是由于x染色体上fmr1基因突变，从而导致 fmrp的功能缺失所引起。为了避免雌鼠生理周期及双条x染色体上fmr1基因的不同表达对于生理机能的影响所导致的实验数据与结论偏差，本研究只选用成年野生型和fmr1基因缺陷型雄鼠作为实验样本。
64.体外原代培养野生型(wt)小鼠和fmr1基因缺陷型(fmr1ko)小鼠的成体dg区神经干细胞，在细胞给药后采用免疫荧光染色联合神经体视学定量分析方法进行定量分析。结果表明，黄芩素显著降低了fmr1ko神经干细胞的异常增殖，并促进其分化为神经元。
65.2、细胞
66.8-10周龄雄性fmr1ko小鼠和wt小鼠各3只，分别在体式镜下分析小鼠dg区，随后在细胞培养房中进行原代成体神经干细胞的培养，干细胞分别保存在孵箱中，温度为37℃， 5％co2。
67.获得2种类型的成体神经干细胞，即wt型成体神经干细胞、fmr1ko型成体神经干细胞，且每种类型的成体神经干细胞有3个(即n＝3)，分别标记为wt1、wt2、wt3；ko1、ko2、 ko3。
68.3、试剂(如表1)
69.表1 体外神经干细胞增殖、分化试验用试剂列表
70.[0071][0072]
神经细胞基础培养基：neurobasal培养基；
[0073]
干细胞培养期间的培养基：neurobasal培养基+b27+l-glu+双抗，细胞培养基配好后在每次细胞换液之前再添加生长因子：egf和fgf；其中：
[0074]
b-27
tm
添加剂(50x)，无血清；使用浓度：将10ml b27加入到500ml的neurobasal；
[0075]
青霉素/链霉素双抗溶液(双抗，gibco,100x)，使用浓度：将8ml双抗加入到500ml的neurobasal，每毫升包含10000单位青霉素(碱)和10000μg链霉素；
[0076]
谷氨酰胺l-glutamine(gibco，200mm)，使用浓度：将8ml l-谷氨酸加入到500ml的 neurobasal。
[0077]
二、实验方法
[0078]
(一)前期准备
[0079]
1、试验分组及给药
[0080]
a组：wt+dmso，wt型成体神经干细胞+0.005％dmso；b组：ko+dmso，fmr1ko型成体神经干细胞+0.005％dmso；c组：wt+bai，wt型成体神经干细胞+终浓度为10μm的bai；d 组：ko+bai，即fmr1ko型成体神经干细胞+终浓度为10μm的bai。
[0081]
分别对两种wt与fmr1ko成体神经干细胞进行空白和给药处理，其中：空白处理(空白组)在培养基中加入0.005％dmso，即wt+dmso组，wt型成体神经干细胞+0.005％dmso； ko+dmso组，fmr1ko型成体神经干细胞+0.005％dmso；给药处理(给药组)在培养基中加入终浓度为10μm的bai，即wt+bai组，wt型成体神经干细胞+终浓度为10μm的bai；ko+bai 组，fmr1ko型成体神经干细胞+终浓度为10μm的bai。
[0082]
2、玻片包被处理
[0083]
将直径为14mm细胞爬片放入24孔板中，然后加入适量体积(200-300μl)的多聚鸟氨酸 (poly-l-ornithine)，包被过夜；回收多聚鸟氨酸后，向含有细胞爬片的24孔板里加入层粘连蛋白(laminin，0.01068mg/ml)适量(200-300微升)，再次进行包被，直到细胞种板前再回收层粘连蛋白；其中，按照如下方法制备浓度为0.01068mg/ml的laminin：将2.67mg/
ml的laminin原液用灭菌超纯水稀释250倍，即得；回收的poly-l-ornithine、laminin均可以反复利用。
[0084]
干细胞进行增殖分化实验时，需要复孔，保证数据的稳定性和真实性，每个干细胞2个复孔，具体分组如表2所示，其中dmso浓度为0.005％；bai浓度为10μm。
[0085]
表2 干细胞实验分组
[0086][0087]
按照上述方法制作2个24孔板，其中一个孔板用于增殖试验，另一孔板用于分化试验。
[0088]
3、干细胞消化、计数处理
[0089]
3a)将编号为wt1、wt2、wt3；ko1、ko2、ko3的干细胞分别从各自对应的培养皿中各吸取8ml成体神经干细胞悬液，再分别转移至各自对应的离心管(15ml)中，离心(3min， 1200r)并弃去上清液，留存细胞沉淀；
[0090]
因为成体神经干细胞为悬浮细胞，所以在收集细胞时，需要将含有细胞的培养基收集到15ml离心管中，1200r/3min，随后弃去上清，留存细胞沉淀，再进行3b)的操作步骤。
[0091]
3b)分别向每个离心管中加入使用浓度为0.05％的1
×
trypsin(胰蛋白酶液，1ml)，孵育1
‑ꢀ
2min；
[0092]
3c)孵育结束后，再分别向每个离心管内加入defined trypsin inhibitor(明确的胰蛋白酶抑制剂，1ml)，吹打20-30次，离心(2min，1200r)；吸弃上清液，留沉淀；
[0093]
3d)分别向每个离心管内加入干细胞培养基(neural basal培养基+b27+l-glu+双抗+egf+fgf， 1ml，其中egf和fgf终浓度是10ng/ml)，吹打均匀，干细胞重悬后用40微米的筛网进行过滤，将全部1ml干细胞悬液打在筛网上，过滤至50ml离心管内，使得成体干细胞呈单个细胞状态，即获得呈单细胞状态的成体干细胞悬浮液。
[0094]
3e)取6个ep管(1.5ml)，向各ep管中分别加入90μl的neural basal培养基，分别精确吸取步骤3d)中过滤后的呈单细胞状态的成体干细胞悬浮液各10μl加入到对应的ep管内，混匀后，再分别从中吸取10μl，分别滴在血细胞计数板上，显微镜下观察计数。
[0095]
细胞计数的目的是为了可以在细胞种板时保持每一组的每一个复孔细胞数量保持一致， wt1/wt2/wt3；ko1/ko2/ko3的每种细胞分开计数并取平均值，再分开种板；其中计数结果分别为(个)：
[0096]
wt1：17.5*105；
ꢀꢀꢀꢀ
wt2：18.25*105；
ꢀꢀꢀ
wt3；20.25*105；
[0097]
ko1：26*105；
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
ko2：25.75*105；
ꢀꢀꢀ
ko3：28*105。
[0098]
(二)增殖处理
[0099]
1、前期准备步骤中消化、计数完成后的呈单细胞状态的成体干细胞按照1*105的
接种量加入到经过包被处理的含有包被玻片的24孔板中，细胞种板时，24孔板中的一个孔中种的干细胞数量为100000个(1*105)，每孔中培养基体积为1ml，在细胞孵箱中培养18h；
[0100]
2、培养18h后，将24孔板中每个孔内的培养基吸走500μl，加入新的培养液500μl，其中所述新培养液含有brdu(浓度:5μm)；生长因子需2倍量(终浓度20ng/ml)；以此培养基为基础，空白组：保持0.005％dmso；给药组：黄芩素(bai)终浓度为10μm，然后在孵箱中孵育6h。
[0101]
3、细胞免疫荧光
[0102]
3a、孵育6h后将24孔板从细胞培养间取出，每孔吸出0.5ml培养基，再向每孔中加入4％多聚甲醛(0.5ml)，常温放置，20min后将孔中所有液体全部吸出，再向每孔中加入1ml的4％多聚甲醛，常温放置15min；然后吸走孔中液体，并用pbs洗涤，5min/次，共三次；
[0103]
3b、将预热到37℃的hcl(1m)加入到24孔板中，1ml/孔；接着放入温箱，静置(37℃， 30min)，进行酸透处理；然后加入硼酸盐缓冲液(ph8.5，2ml)，室温静置15min后，吸出每孔中液体，再用pbs洗涤3次，5min/次；
[0104]
hcl酸透的目的：brdu抗体识别单链dna，所以抗体孵育前需要首先解开双链dna。盐酸的酸变性或热变性效果最好；
[0105]
3c、抗体的制备及孵育
[0106]
3c-1)配制抗体稀释液：向0.5g bsa，2ml的trionx-100和2ml的goat serum(羊血清)中加入1
×
tbs，直至40ml，斡旋至溶解，-20℃保存；
[0107]
3c-2)一抗，配制brdu的抗体：使用步骤3c-1)配制的抗体稀释液配制brdu抗体，使一抗brdu按照1：4000(通常为1:3000-1:5000)加入到步骤3b)酸透处理后并pbs洗涤后的孔板中，每孔加300μl，常温孵育过夜；然后用pbs洗涤,5min/次，共三次；
[0108]
3c-3)二抗，alexa fluor 568 goat anti-rat lgg(h+l)，使用步骤3c-1)的抗体稀释液配制荧光二抗(1:2000)，加入到步骤3c-2)一抗处理后且pbs洗涤后的孔板中，每孔加300微升，常温下孵育2h，获得荧光二抗；
[0109]
3c-4)dapi溶液与荧光二抗孵育时间的最后15min共同孵育，或者等待荧光二抗孵育时间结束后，吸干净二抗后，每孔中再加入500μl的dapi溶液。
[0110]
(孵育完荧光二抗后，需要孵育dapi：4',6-二脒基-2-苯基吲哚,是一种能够与dna强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测,显示蓝色荧光)
[0111]
3c-5)dapi溶液孵育结束后，pbs洗涤,5min/次，共三次，去除dapi溶液；
[0112]
4、封片、固定、镜检、计数
[0113]
取一个普通的载玻片(长)，在其上两个不同的位置上分别滴加15μl(通常为10-20μl) 的抗荧光淬灭剂，然后将步骤3)中孵育后的细胞爬片从24孔板中取出，有细胞的一面朝下，固定在载玻片，然后于正置显微镜下观察，计数；其中：显微镜荧光调到红色通道，观察并计数带有红色荧光的细胞，红色荧光细胞为brdu标记的表示增殖的细胞数量；显微镜荧光调到dapi通道，观察并计数蓝色荧光的细胞，蓝色荧光dapi标记的是所有细胞；分别计算brdu 和dapi数量，计算brdu/dapi的比例。
[0114]
神经干细胞体外增殖的显微镜观察结果如图1a，其中brdu标记增殖细胞呈红色；dapi标记全部细胞核呈蓝色，图中：“—”表示只加入了溶剂0.005％的dmso，不加入药物bai；“+”表示加入bai，其bai终浓度为10μm。
[0115]
5、数据分析及结果
[0116]
采用神经体视学软件stereo investigator进行计数分析，对每组的3个分析数据取平均值，统计分析结果如图1b。
[0117]
a组：wt+dmso组中处于成体神经干细胞增殖(brdu
+
/brdu
+
dapi
+
)占比为35.95％；b组： ko+dmso组中处于成体神经干细胞增殖(brdu
+
/brdu
+
dapi
+
)占比为61.35％；c组：wt+bai组中处于成体神经干细胞增殖(brdu
+
/brdu
+
dapi
+
)占比为35.95％；d组：ko+bai组中处于成体神经干细胞增殖(brdu
+
/brdu
+
dapi
+
)占比为42.05％；
[0118]
brdu
+
标记新生干细胞，brdu
+
/dapi
+
表示新生干细胞的占比。由以上数据可知黄芩素显著抑制了fmr1ko小鼠体外成体神经干细胞的增殖。并且将fmr1ko型成体神经干细胞的增殖水平降低到与wt型相近的水平，且黄芩素对wt型成体神经干细胞的增殖没有影响，因此黄芩素可用于治疗x染色体的形成过程中的脆性x智力低下基因(fmr1)的突变所致疾病。
[0119]
(三)分化处理
[0120]
1、前期准备步骤中的消化、计数完成后的呈单细胞状态的成体干细胞按照2*105的接种量加入到经过包被处理的含有包被玻片的24孔板中，细胞种板时，24孔板中的一个孔中种的干细胞数量为200000个(2*105)，每孔中培养基体积为2ml，在细胞孵箱中培养18h；
[0121]
2、培养18h后，将24孔板中每个孔内的培养基中吸走500微升，加入新的培养液500微升，其中新培养液含毛喉素(终浓度5μm)；维甲酸(终浓度1μm)；以此培养基为基础，空白组：保持0.005％dmso；给药组：黄芩素终浓度10μm，然后在孵箱中孵育3天，并且连续三天进行换液及给药。
[0122]
3、细胞免疫荧光
[0123]
3a、孵育后的24孔板从细胞培养间取出，每孔吸出0.5ml培养基，每孔则还剩0.5ml培养基，再向每孔中加入4％多聚甲醛(0.5ml)，常温放置，20min后将孔中所有液体全部吸出，再向每孔中加入1ml的4％多聚甲醛，常温放置15min；然后吸走孔中液体，用pbs洗涤,5min/ 次，共三次；
[0124]
3b、抗体的制备及孵育
[0125]
3b-1)配制抗体稀释液：与“二、增殖处理”的步骤3c-1)相同；
[0126]
3b-2)一抗，配制tuj1的抗体：使用步骤3b-1)配制的抗体稀释液配制tuj1抗体，使一抗tuj1按照1:3000加入到步骤3a)处理后的孔板中，每孔加300微升，常温孵育过夜；然后用 pbs洗涤,5min/次，共三次；
[0127]
3b-3)二抗，alexa fluor 568 goat anti-rat lgg(h+l)，使用步骤3b-1)配制的抗体稀释液配制荧光二抗(1:2000)，然后加入到孔板中，每孔加300微升，常温下孵育2h，获得荧光二抗；
[0128]
3b-4)dapi溶液可以与荧光二抗孵育时间的最后15min共同孵育，或者等待荧光二抗孵育时间结束后，将二抗吸取干净后，每孔中再加入500微升的dapi溶液。
[0129]
(孵育完荧光二抗后，需要孵育dapi：4',6-二脒基-2-苯基吲哚,是一种能够与dna强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测,显示蓝色荧光)
[0130]
3b-5、dapi溶液孵育结束后，用pbs洗涤,5min/次，共三次；
[0131]
4、封片、固定、镜检、计数
[0132]
取一个普通的载玻片(长)，在其上两个不同的位置上分别滴加15微升(通常为10-20微升)的抗荧光淬灭剂，然后将步骤2)中孵育后的细胞爬片从24孔板中取出，有细胞的一面朝下，固定在载玻片，然后于正置显微镜下观察，计数；显微镜荧光调到红色通道，观察并计数带有红色荧光的细胞，红色荧光细胞为tuj1标记的表示分化的神经干细胞的细胞数量；显微镜荧光调到dapi通道，观察并计数蓝色荧光的细胞，蓝色荧光dapi标记的是所有细胞；分别计算tuj1和dapi数量，计算tuj1/dapi的比例。
[0133]
神经干细胞分化后显微镜观察结果如图1c，其中tuj1标记的分化细胞呈红色；dapi标记全部细胞核呈蓝色，图中：“—”表示只加入了溶剂0.005％的dmso，不加入药物bai；“+”表示加入bai，其bai终浓度为10μm。
[0134]
5、数据分析及结果
[0135]
采用神经体视学软件stereo investigator进行计数分析，对每组的3个分析数据取平均值，统计分析结果如图1d。
[0136]
a组：wt+dmso组中处于成体神经干细胞分化(tuj1
+
/tuj1
+
dapi
+
)占比为13.71％；b组： ko+dmso组中处于成体神经干细胞分化(tuj1
+
/tuj1
+
dapi
+
)占比为3.81％；c组：wt+bai组中处于成体神经干细胞分化(tuj1
+
/tuj1
+
dapi
+
)占比为14.00％；d组：ko+bai组中处于成体神经干细胞分化(tuj1
+
/tuj1
+
dapi
+
)占比为13.53％。
[0137]
tuj1
+
标记神经元，tuj1
+
/dapi
+
代表由神经干细胞转化为神经元的占比。通过以上数据可以看出黄芩素显著促进了fmr1ko小鼠体外成体神经干细胞的神经元分化。并且将fmr1ko型成体神经干细胞的神经元分化水平升高到与wt型成体神经干细胞相近的水平，且黄芩素对 wt型成体神经干细胞的分化没有影响，因此黄芩素可用于治疗x染色体的形成过程中的脆性x智力低下基因(fmr1)的突变所致疾病。
[0138]
试验例2黄芩素对fmr1ko小鼠海马新生神经元树突复杂度作用的影响
[0139]
体外原代培养新生神经元，第四天转染gfp质粒，并每天连续给药直到第七天，封片。 sholl分析结果表明，黄芩素可以显著促进体外fmr1基因缺陷型(fmr1ko)新生神经元的树突成熟度，包括树突长度、树突节点数和树突末端数量等。
[0140]
神经细胞胞浆向外伸出树枝状的突起叫树突，树突是从神经元发出的一至多个突起，起始部较粗，反复分支，逐渐变细，呈树枝状，树突外面的细胞膜上有许多受体，因此树突是神经元接受化学信使的部位，其它神经元轴突末端终于树突表面，形成突触。神经元的树突及其分支越多，则接受冲动的面积越大，即接受化学信使的突触越多。
[0141]
一、实验材料
[0142]
1、实验动物
[0143]
雄性野生型(wild-type，wt，或fmr1
+/y
)小鼠，购自中国医学科学院医学实验动物研究所。雌性fmr1基因敲除(knock out，ko)小鼠(fmr1ko，或fmr1-/-)均购自杰克逊实验室。
[0144]
fmr1基因敲除(knock out，ko)，可以用fmr1ko代表，也可以用fmr1-/-(雌鼠)/fmr1-/y (雄鼠)。雄性野生型(wild-type，wt)，可以用wt代表，也可以用fmr1
+/+
(雌鼠)/fmr1
+/y (雄鼠)
[0145]
所有小鼠在天津中医药大学实验动物中心进行繁殖饲养，无特定病原体级(spf级)动物饲养室，饲养温度为22-25℃，采用12小时照明/12小时黑暗的昼夜节律周期，小鼠可以自由摄取水和食物，通过天津中医药大学动物伦理委员会的批准和认可。小鼠生长到
八周后达到成熟时，将雌鼠het(fmr1-/+
)与雄鼠wt按照1：2比例的合笼繁殖。选用p0天小鼠，取大脑海马进行神经元原代培养。
[0146]
如前所述，脆性x染色体综合征的发生主要是由于x染色体上fmr1基因突变，从而导致 fmrp的功能缺失所引起。为了避免雌鼠生理周期及双条x染色体上fmr1基因的不同表达对于生理机能的影响所导致的实验数据与结论偏差，本研究只选用成年野生型和fmr1基因缺陷型雄鼠作为实验样本。
[0147]
2、培养细胞
[0148]
wt和fmr1ko小鼠的海马新生神经元，于5％co2、37℃培养箱中培养。
[0149]
3、药品
[0150]
黄芩素(baicalein；bai)，纯度≥98％，购自萨恩化学技术(上海)有限公司，cas:491-67-8。
[0151]
4、主要试剂
[0152][0153]
5、主要仪器
[0154]
正置显微镜，carl zeiss。
[0155]
二、实验方法
[0156]
1、试剂配制
[0157]
1)lb培养基的配制：取10g nacl、10g tryptone(胰蛋白胨粉)、5g yeast extract(酵母提取物)溶解于1l的超纯水中，并于高压灭菌后使用。
[0158]
2)lb固体培养基的配制：取胰蛋白胨粉10g、酵母粉10g、nacl 10g、琼脂粉10-20g，溶解于1l的超纯水中，并于高压灭菌后使用。待培基液体冷却至50-60℃时，加入50mg/ml氨
苄青霉素1ml，使其充分溶解，趁培基未凝固前，迅速分装于培养皿中(10ml/个)，待冷却凝固后，盖上培养皿盖子，倒置(以防水滴在固体培基上)，于4℃冰箱中保存备用。
[0159]
3)葡萄糖溶液的配制：取18.0g葡萄糖溶解于近100ml的超纯水中，待完全溶解后定容于100ml，0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌后使用。
[0160]
4)5m nacl：称取292.5g nacl，溶解于灭菌超纯水中，稀释到1l。
[0161]
5)soc(super optimal broth with catabolite repression)培养基的配制：取20g tryptone(胰蛋白胨)、5g yeast extract、0.5g nacl、0.186g kcl、12g mgso4、0.95g mgcl2溶解于近1l的超纯水中，调节ph至7.0，并定容于1l，进行高压灭菌，然后向其中加入试剂配制3)中配制的已除菌的葡萄糖溶液20ml。
[0162]
6)氨苄青霉素溶液的配制(50mg/ml)：称取2.5g氨苄青霉素置于50ml塑料离心管中，加入近50ml灭菌超纯水充分混合溶解之后，定容至50ml，0.22μm滤膜过滤除菌，小份分装 (1ml/管)后，置于-20℃保存。
[0163]
7)4％多聚甲醛(pfa):取40g pfa粉末置于1l烧杯中，再加入1l pbs磷酸盐缓冲液，搅拌器搅拌，搅拌过程中再添加6mg naoh，直至完全溶解，再用盐酸调ph值至7.0-7.4，冷却，分装，置于-20℃冰箱保存。
[0164]
8)多聚赖氨酸的配制：将10
×
多聚赖氨酸按照1：9的稀释方式用灭菌的超纯水稀释成1
×
多聚赖氨酸，并用0.22μm的微孔滤膜进行过滤处菌，然后置于4℃进行保存。注意多聚赖氨酸可以循环使用，但再次使用时用过滤，若出现浑浊或者染菌应丢弃。
[0165]
9)神经元相关培养基
[0166]
①
号培养基，取材培养基：dmem-f12+1％青链霉素；
[0167]
②
号培养基，种板培养基：dmem-f12+10％fbs+1％青链霉素；
[0168]
③
号培养基，4h换液-培养阶段培养基：neurogro+2％b27+1％青链霉素+0.5mm l-glu；
[0169]
消化液：胰蛋白酶-edta(0.25％)，含酚红，直接使用。
[0170]
2、实验分组及给药
[0171]
a组：wt+veh，wt型p0天海马神经元+0.005％dmso；
[0172]
b组：ko+veh，fmr1ko型p0天海马神经元+0.005％dmso；
[0173]
c组：wt+bai，wt型p0天海马神经元+终浓度为10μm的bai；
[0174]
d组：ko+bai，fmr1ko型p0天海马神经元+终浓度为10μm的bai。
[0175]
分别对两种wt与fmr1ko神经元细胞进行空白和给药处理，其中：空白处理(空白组) 在培养基中加入0.005％dmso，即wt+veh组，wt型神经元细胞+0.005％dmso；ko+veh组， fmr1ko型神经元细胞+0.005％dmso；给药处理(给药组，c、d组)在培养基中加入终浓度为 10μm的bai，即wt+bai组，wt型神经元细胞+终浓度为10μm的bai；ko+bai组，fmr1ko型神经元细胞+终浓度为10μm的bai。
[0176]
3、质粒转化
[0177]
(1)将dh5α感受态大肠杆菌细胞及rv-gfp质粒置于冰浴中。
[0178]
(2)取1个1.5ml离心管，加入dh5α感受态细胞100μl；接着向离心管内加入质粒rv
‑ꢀ
gfp(1μl)，轻弹管体，使质粒与感受态细胞充分混匀；然后置于冰浴中静置30min。
[0179]
(3)将离心管于42℃的水浴中放置60-90s，然后快速转移离心管于冰浴中2-3min，
注意该过程不要摇动离心管。将rv-gfp的质粒导入大肠杆菌体内，从而大量扩增。
[0180]
(4)向另一个15ml离心管中加入900μlsoc培养基，再加入步骤(3)中导入质粒的dh5α感受态细胞，混匀后置于37℃摇床振荡培养(180rpm，90min)，进行导入质粒的感受态细胞的培养。
[0181]
(5)吸取步骤(4)中的培养混合液(100μl)，加入含氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)的lb固体培养基上，并用无菌的接种环轻轻将细胞均匀涂开；然后倒置培养皿，37℃培养箱培养12-16h，即可观察到菌落。
[0182]
(6)向已高压灭菌的1个250ml锥形瓶中加入含氨苄青霉素(50μg/ml)的lb液体培养基200ml，备用。
[0183]
(7)用已高压灭菌的枪头挑取1个单个菌粒，加入到步骤(6)的锥形瓶中，于37℃下培养，200rpm，摇菌12-16h。
[0184]
(8)摇菌后的菌液，进行离心(15min，4500rpm，4℃)，弃上清，留沉淀，将沉淀于-40℃保存，用于提取质粒。
[0185]
4、质粒提取
[0186]
采用高纯度质粒大提试剂盒，按照试剂盒的说明和实验方法并进行质粒提取，具体如下：
[0187]
(1)将质粒提取试剂盒的溶液p1在使用前先加入rnasea，混匀，于2-8℃保存。
[0188]
(2)向步骤“3、质粒转化”中提取的留有菌体沉淀的离心管中加入步骤1)中的混合溶液，涡旋，悬浮细菌细胞沉淀。
[0189]
(3)向离心管中加入质粒提取试剂盒的溶液p2，立即混匀，使菌体充分裂解，室温放置5min。
[0190]
(4)向离心管中加入质粒提取试剂盒的溶液p4，立即充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀；接着于室温放置4-5min后，离心(7800rpm，15min)，使白色沉淀离心至管底；然后将全部溶液小心倒入过滤器cs1中(注意避免倒入大量沉淀而阻塞过滤器)，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50ml的离心管中。
[0191]
(5)向滤液中加入0.35倍滤液体积的异丙醇、1/2倍异丙醇体积的nacl，上下颠倒充分混匀。
[0192]
(6)温度4℃，转速7800rpm离心90min，轻轻倒掉上清液，将离心管倒置在吸水纸上。
[0193]
(7)向离心管中加入70％乙醇充分漂洗沉淀；4℃，7800rpm，离心15min，轻轻倒掉上清液，将离心管倒置在吸水纸上，重复1-2次，充分漂洗沉淀。
[0194]
(8)将离心管敞口室温放置30min，使乙醇充分挥发，加入depc水涡旋混匀，提取得到rv-gfp质粒。
[0195]
用dna微量测定仪检测rv-gfp质粒的浓度与纯度，测定结果如下：
[0196]
质粒浓度：5789.9ng/微升a260/280＝1.953a260/a230＝2.110
[0197]
提取的质粒做好标记(日期，质粒种类，浓度)，于-20℃冰箱保存，备用。
[0198]
5、细胞培养
[0199]
5-1、将直径为14mm细胞爬片放入24孔板中，加入适量体积(200-300微升)的1
×
多聚赖氨酸包被液，进行包被(8h以上)，于实验前回收包被液，并用灭菌超纯水洗涤爬片2-3
次；
[0200]
5-2、准备好高压灭菌的器械，包括镊子培养皿等。
[0201]
5-3、将
①
号培养基分装至分别标记编号的培养皿、ep管中，并于冰上预冷；
[0202]
5-4、取出p0天(0-24h内新出生的小鼠)小鼠，酒精消毒3min后取小鼠尾巴组织保存至 1.5ml的ep管中；再用一把细剪刀，剪下小鼠头部，其中：雄性wt和fmr1ko小鼠，分为4 组，即wt+veh、ko+veh、wt+bai、ko+bai组，每组为三只小鼠，即n＝3，四组共12只小鼠，具体分组如表3所示，其中dmso浓度为0.005％；bai浓度为10μm。
[0203]
表3 神经元细胞实验分组
[0204][0205]
5-5、首先使用镊子切除脑干，然后再将全脑从中间分成左右两个半球，海马的位置在半球的腹内侧，全程在体视镜下操作，使用显微镊子将脑膜剥落，然后再将两侧的海马进行剥离。
[0206]
5-6、将大脑迅速放入到
①
号培养基中，分离海马，并将大脑两侧海马转移到对应编号的 ep管，于细胞操作间内将海马剪成小段1-2mm3的小块，分别收集至15ml离心管中，加入300 μl消化液(gibco,25200056)，然后于37℃含有5％co2培养箱孵育5min。
[0207]
5-7、孵育后离心(1500r/1min)，去除上清液；再向各15ml离心管内加入2ml
②
号培养基，轻轻吹打至无组织块，然后将细胞悬液过40μm筛网，收集细胞悬液于新的15ml离心管内，使得上述细胞呈单个细胞状态，再继续吹打均匀，并按照每孔接种(3-5)
×
105个细胞的接种量加入到含有经过包被处理的细胞爬片的24孔板中，进行种板处理，细胞种板时，每孔中培养基体积为1ml，在细胞孵箱中培养4h。
[0208]
5-8、种板处理4h后，将24孔板内每孔的培养基更换为
③
号培养基；其中种板处理当天为第0天，此后每隔一天进行半量换液，即半量更换
③
号培养基，种板第4天进行转染及按照表3的分组进行给药处理，种板第7天进行固定处理。
[0209]
6、细胞转染及给药处理
[0210]
(1)准备工作：
[0211]
高压灭菌实验所需材料(不同规格的枪头，1.5ml ep管等，因为是在细胞房操作需要无菌环境)，超净台内照射紫外灭菌，保证无菌操作；将
③
号培养基放到室温，备用；
[0212]
配制转染试剂(按照24孔板中一个孔的试剂用量配制)：灭菌超纯水：17.5μl；步骤“4、质粒提取”获得的rv-gfp质粒：1μg；2m cacl2：2.5μl；2
×
hebs：25μl。
[0213]
(2)于种板第4天，在转染前1h将孔板内培养基更换为新的
③
号培养基；
[0214]
(3)分别向12支ep管(1.5ml)内加入转染试剂，即每支ep管内依次加入质粒(1μg)，水(17.5μl)，2
×
hebs(25μl)，混匀后，再滴加cacl2溶液(2.5μl)，混匀后室温静置10min；制得dna-cacl
2-hbs混合体系；
[0215]
(4)将步骤(3)制备的dna-cacl
2-hbs混合体系分别滴加至种板后的24孔板的每个孔内，然后将24孔板放在细胞孵箱中培养1h。
[0216]
(5)将24孔板放到超净工作台中，使用pbs缓冲液(常温)冲洗细胞两次(洗去沉淀，减少细胞死亡)；
[0217]
(6)按照分组更换
③
号培养基，空白组：每孔加入1ml
③
号培养基+0.005％dmso；给药组：每孔加入1ml
③
号培养基+黄芩素(终浓度为10μm)。
[0218]
(7)然后将24孔板放回细胞孵箱中培养生长，即进行神经元培养。
[0219]
7、神经元的固定、封片与计量
[0220]
(1)神经元培养到第七天后，将24孔板从细胞培养间取出，每孔吸出0.5ml培养基，再向每孔中加入4％多聚甲醛(0.5ml)，常温放置，固定20min后将孔中所有液体全部吸出，再向每孔中加入1ml的4％多聚甲醛，常温放置固定15min；然后吸走孔中液体，并用pbs洗涤,5min/次，共三次；
[0221]
(2)取一个普通的载玻片(长)，在其上两个不同的位置上分别滴加15μl(通常为10-20μl) 的抗荧光淬灭剂，然后将步骤(1)中固定并洗涤后的附有神经元的细胞爬片从24孔板中取出，有细胞的一面朝下，固定在载玻片上，然后于正置显微镜下观察，计量tracing(实时描绘)；其中：显微镜荧光调到绿色通道，随机选取表达绿色荧光的神经元，计量树突长度，树突节点，树突末端等。
[0222]
使用正置显微镜下荧光场观察gfp
+
的神经元细胞形态变化(图2a)。分析bai对wt或 fmr1ko小鼠海马新生神经元的树突复杂度的影响，使用体视学分析系统对gfp
+
的新生神经元进行实时描绘，并用神经形态学分析系统量化神经元形态结构，即对gfp
+
的新生神经元树突长度(图2d)、树突节点数(图2e)、树突末端个数(图2f)的量化。
[0223]
8、结果分析
[0224]
采用grapapad prism软件进行双因素方差分析(two-way anova)或spss统计分析软件进行多变量方差分析(manova)进行阈值分析，数据处理结果以mean
±
sem表示，当p《0.05时认为有显著性水平差异，具有统计学意义。
[0225]
8a)黄芩素对wt、fmr1ko小鼠海马新生神经元细胞形态的影响
[0226]
新生神经元细胞形态的显微镜观察结果如图2a，
[0227]
由图2a可知，与wt+veh相比，ko+veh的神经元细胞的树突复杂度低，树突长度短，树突分支少；给予bai后，与ko+veh相比，ko+bai的神经元细胞树突复杂度增加，树突长度增长，树突分支增多；与wt+veh相比，ko+bai的神经元细胞的形态可以恢复到与wt型小鼠海马新生神经元类似的水平。
[0228]
实验结果表明，bai对fmr1ko小鼠海马新生神经元树突形态有改善作用：bai可以显著促进体外fmr1ko小鼠海马新生神经元的树突复杂度，包括树突长度、树突节点数和树突末端数量等。(每组至少3只不同动物的至少20-35个gfp
+
的神经元)。
[0229]
在体外培养的神经元中，通过使用磷酸钙转染法对神经元细胞进行转染，在培养过程中加入bai进行药物干预。使用神经体视学分析方法对表达绿色gfp荧光的神经元进行形态分析，fmr1ko小鼠的海马新生神经元相比wt，在形态上存在明显差异，即fmr1ko神经元树突复杂性网络复杂性低于wt神经元，黄芩素给药干预后fmr1ko型海马新生神经元细胞的形态可以恢复到与wt型小鼠海马新生神经元类似的水平(图2a)。
[0230]
8b)黄芩素对wt、fmr1ko小鼠海马新生神经元复杂度的影响
[0231]
采用sholl分析方法对wt或fmr1ko小鼠海马新生神经元复杂度进行考察，sholl分
析实验方案示意图如图2b所示；sholl分析方法鉴定海马新生神经元复杂度的统计分析结果如图 2c。
[0232]
sholl analysis以神经元胞体为圆心(不包括胞体)开始画一系列同心圆(如图2b)，得到随离胞体距离变化的神经元突起交点(intersections)个数,以此来反映神经元的复杂性。通过计算与每个圆相交的分支数，得出对不同区域的神经元树突和轴突的分支模式，从而定量表征被成像神经元形态特征，分析结果如图2c。
[0233]
wt+veh；ko+veh；wt+bai；ko+bai在等距离下距离胞体交点数最小值均值-最大值均值分别是[1.89，7.07]；[0.83，3.6]；[2.95，7.12]；[2.72，6.76]。实验结果表明fmr1ko小鼠的新生神经元比wt小鼠的新生神经元的复杂性低，黄芩素可以显著增加fmr1ko小鼠海马新生神经元的树突复杂性。
[0234]
8c)黄芩素对wt、fmr1ko小鼠海马新生神经元树突长度的影响
[0235]
对海马新生神经元树突长度采用sholl分析方法进行，sholl分析方法鉴定海马新生神经元树突长度的统计分析结果如图2d。
[0236]
由图2d可知：wt+veh；ko+veh；wt+bai；ko+bai组的树突平均长度依次为：1056.48μm； 308.16μm；1919.17μm；1167.93μm；实验结果表明fmr1ko小鼠的新生神经元的树突长度与wt小鼠新生神经元树突长度相比，较短，而bai可以显著提高fmr1ko小鼠新生神经元的树突长度。与wt+veh相比，给予bai的fmr1ko小鼠新生神经元的树突长度恢复到了wt型小鼠海马新生神经元的树突长度的水平。
[0237]
8d)黄芩素对wt、fmr1ko小鼠新生神经元树突节点数量的影响
[0238]
对海马新生神经元树突节点采用sholl分析方法进行，sholl分析方法鉴定海马新生神经元树突节点数量的统计分析结果如图2e。
[0239]
由图2e可知：wt+veh；ko+veh；wt+bai；ko+bai组的树突节点数平均个数依次为：7.83； 1.4；8.02；8.52；实验结果表明：fmr1ko小鼠的新生神经元比wt小鼠具有更少的树突节点数量，bai给药干预后可以显著增加fmr1ko小鼠新生神经元的树突节点数量。与wt+veh相比，给予bai的fmr1ko小鼠海马新生神经元的树突节点数量恢复到wt型小鼠海马新生神经元的树突节点数量的水平。
[0240]
8e)黄芩素对wt、fmr1ko小鼠新生神经元树突末端数量的影响
[0241]
对海马新生神经元树突末端采用sholl分析方法进行，sholl分析方法鉴定海马新生神经元树突末端数量统计分析结果如图2f。
[0242]
由图2f可知：wt+veh；ko+veh；wt+bai；ko+bai组的树突末端数平均个数依次为： 13.27；4.63；12.47；14.17；实验结果表明：fmr1ko小鼠的新生神经元比wt小鼠具有更少的树突末端数量数量，bai给药干预后可以显著提高fmr1ko小鼠新生神经元的树突末端数量。与wt+veh相比，给予bai的fmr1ko小鼠的树突末端数量恢复到wt型小鼠海马新生神经元的树突末端数量的水平。
[0243]
试验例3认知功能调控试验
[0244]
采用动物认知功能检测方法证明，黄芩素可以矫正fmr1基因缺陷型小鼠(fmr1ko)的认知功能障碍与社交互动障碍。为了进一步研究黄芩素对认知障碍的改善作用是否通过促进成体神经发生发挥功能，本发明使用神经发生特异性阻断剂替莫唑胺(temozolomide，tmz)进行干预。结果表明，替莫唑胺可以阻断黄芩素对fmr1基因缺陷型小鼠(fmr1ko)认知
功能障碍的治疗作用。该研究结果表明，黄芩素可以通过调控神经发生治疗脆性x染色体综合征小鼠的认知功能障碍。
[0245]
一、新位置识别实验
[0246]
新位置识别实验是用于检测小鼠空间记忆能力的经典行为学。为了探索黄芩素是否能够矫正脆性x染色体综合征模型小鼠的空间记忆能力，使用腹腔注射黄芩素的方式对小鼠进行给药干预后，进行新位置识别实验测试。
[0247]
为了进一步研究黄芩素对空间记忆的改善作用是否通过促进成体神经发生发挥功能，使用神经发生特异性阻断剂替莫唑胺(temozolomide，tmz)提前阻断神经发生，并与黄芩素联合给药之后，进行新位置识别实验测试。
[0248]
1材料与方法
[0249]
1.1材料：
[0250]
一个正方形旷场：不同物体(a物体、b物体)，面巾纸，75％的酒精，两个计时器。
[0251]
1.2实验动物、药物：
[0252]
7-8周龄fmr1ko和wt小鼠。
[0253]
黄芩素(baicalein；bai)，纯度≥98％，购自萨恩化学技术(上海)有限公司，cas:491-67-8。
[0254]
替莫唑胺(temozolomide；tmz),购自selleck公司，cas no.85622-93-1。
[0255]
2实验分组及给药
[0256]
2.1实验分组：wt+veh：wt小鼠腹腔注射生理盐水；ko+veh：fmr1ko小鼠腹腔注射生理盐水；wt+bai：wt小鼠腹腔注射黄芩素；ko+bai：fmr1ko小鼠腹腔注射黄芩素；wt+as/tmz：wt小鼠腹腔注射替莫唑胺及黄芩素；ko+bai/tmz：fmr1ko小鼠腹腔注射替莫唑胺及黄芩素，共6组，每组7-9只(即n＝7-9)。
[0257]
2.2给药方式：
[0258]
①
：wt+veh,ko+veh组：7-8周龄fmr1ko和wt小鼠每天腹腔注射一次生理盐水，连续注射7天。
[0259]
②
：wt+bai,ko+bai组：7-8周龄fmr1ko和wt小鼠每天腹腔注射一次黄芩素，连续注射7天，给药剂量为30mg/kg
[0260]
③
：wt+bai/tmz，ko+bai/tmz组：6周龄的fmr1ko和wt小鼠在第6周，第7周，第 8周和第9周的前三天每天腹腔注射一次替莫唑胺(tmz)，在第9周每天腹腔注射一次黄芩素(bai)，连续注射7天，bai的给药剂量为30mg/kg。
[0261]
3实验步骤
[0262]
该测试是通过评估啮齿类动物根据空间线索识别熟悉物体新位置的能力来测量它们的空间记忆能力。
[0263]
首先，按照新位置识别实验示意图如图3a所示，实验动物被带到行为学测试实验室，适应至少1个小时。在训练阶段，每只动物被单独放置在一个正方形场地中，两个完全相同的物体被放置在与一面贴有彩色墙纸距离相同的位置上，允许小鼠自由探索6min，该训练过程重复3次。在测试阶段，其中一个已经熟悉的物体的位置被移动到了另一个新的位置上。记录6min内，实验动物对新旧两个不同位置物体的探索时间。一个正常的动物，应该花更多的时间在探索新位置的物体上。判别标准是根据识别新位置物体所花费的时间百分比
与识别原位置物体所花费的时间之间的差异来计算的。在测试阶段，对物体的探测定义为动物的鼻子距离物体1cm之内的任何探索行为，包括头部方向、攀爬、嗅探等。判别指数的计算方法为：判别指数＝(新位置物体识别时间/总识别时间
×
100)-(原位置物体识别时间/总识别时间
×
100)。
[0264]
每只小鼠测试结束后，需要用75％的酒精将场擦拭干净，以消除同类气味干扰对下一只实验小鼠测试行为的影响。
[0265]
4实验结果
[0266]
数据采用grapapad prism软件进行双因素方差分析(two-way anova)，数据处理结果以 mean
±
sem表示，当p《0.05时认为有显著性水平差异，具有统计学意义。
[0267]
wt+veh；ko+veh；wt+bai；ko+bai；wt+bai/tmz；ko+bai/tmz组的判别指数依次为：45.88％；
ꢀ‑
50.80％；55.60％；17.73％；-72.61％；-44.28％。小鼠对新位置识别实验统计结果如图3b所示。
[0268]
由实验结果可知：wt小鼠更倾向于探索新物体，而fmr1ko小鼠更倾向于探索旧物体，这说明fmr1ko小鼠的空间记忆能力有缺陷，黄芩素给药后可以矫正这种缺陷，而tmz可以阻断黄芩素对fmr1ko小鼠的空间记忆改善作用。说明黄芩素可以通过调控神经发生改善fmr1 ko小鼠的空间记忆。
[0269]
二、模式分离实验
[0270]
模式分离实验是一种高级的探索小鼠区分类似事件能力的方式。本实验将探讨黄芩素能否通过促进神经发生矫正脆性x染色体综合征模型小鼠的模式分离缺陷。
[0271]
1材料与方法
[0272]
1.1材料：一个正方形旷场；物体a(2个)；物体b(2个)，物体a与物体b不相同；面巾纸；75％的酒精；两个计时器。
[0273]
1.2实验动物、药物：与“一、新位置识别实验”的实验动物、药物相同
[0274]
2实验分组及给药
[0275]
2.1实验分组：wt+veh：wt小鼠腹腔注射生理盐水；ko+veh：fmr1ko小鼠腹腔注射生理盐水；wt+bai：wt小鼠腹腔注射黄芩素；ko+bai：fmr1ko小鼠腹腔注射黄芩素；wt+as/tmz： wt小鼠腹腔注射替莫唑胺及黄芩素；ko+bai/tmz：fmr1ko小鼠腹腔注射替莫唑胺及黄芩素，共6组，每组7-11只(即n＝7-11)。
[0276]
2.2给药方式：与“一、新位置识别实验”的药物给药方式相同
[0277]
3实验步骤
[0278]
如图4a，在训练期间，将已编好号的小鼠放置于空场中训练一段时间,随后被单独放置在第一个正方形场地中，有特定的地板图案和两个相同的物体(a物体)，并被允许探索10 min。30分钟后，同一只动物被放置在第二个正方形场地中，与第一个实验不同的地板模式和两个完全不同的另一套物体(b物体)，并被允许探索10min。
[0279]
实验时随机取两次训练壁纸中的一种当作背景，并于测试时的相同位置分别放置一个a 物体和一个b物体，并采用录像机录制每只小鼠在该场景下对a物体和b物体的互动情况，测试时间为10min，之后利用计时器对小鼠的互动情况进行计数分析，在测试阶段，对物体的探测定义为动物的鼻子距离物体1cm之内的任何探索行为，包括头部方向、攀爬、嗅探等。
[0280]
每只小鼠测试结束后用纯净水清洁，以免影响实验结果。根据公式计算判别指数，判别指数＝(新物体探测时间/总探测时间)-(旧物体探测时间/总探测时间)
×
100％，判断小鼠对新、旧物体的偏好。
[0281]
4实验结果
[0282]
数据采用grapapad prism软件进行双因素方差分析(two-way anova)，数据处理结果以 mean
±
sem表示，当p《0.05时认为有显著性水平差异，具有统计学意义。
[0283]
wt+veh；ko+veh；wt+bai；ko+bai；wt+bai/tmz；ko+bai/tmz组的判别指数依次为：31.44％；-24.32％；32.26％；34.56％；-26.89％；-38.81％。小鼠模式分离实验结果统计图如图4b所示。
[0284]
实验结果表明wt小鼠更倾向于探索新物体，而fmr1ko小鼠与wt小鼠表现相反，说明 fmr1ko小鼠的模式分离有缺陷，黄芩素给药后可以矫正这种缺陷。而tmz可以阻断黄芩素对fmr1ko小鼠的模式分离改善作用。说明黄芩素可以通过调控神经发生改善fmr1ko小鼠的模式分离缺陷。
[0285]
由上述实验可知：黄芩素可以通过调控成体神经发生改善脆性x染色体综合征模型小鼠的模式分离缺陷。
[0286]
三新物体识别实验
[0287]
这项测试是基于啮齿动物的自然倾向，即喜欢探索新奇的物体而不是熟悉的物体。本实验检测的是小鼠的新物体识别能力，用于探索黄芩素能否通过调控成体神经发生矫正脆性x染色体综合征模型小鼠的学习、记忆障碍。
[0288]
1实验材料
[0289]
1.1材料：一个正方形旷场；物体a；物体b，物体a与物体b不相同；面巾纸。75％的酒精；两个计时器。
[0290]
1.2实验动物、药物：与“一、新位置识别实验”的实验动物、药物相同
[0291]
2实验分组及给药
[0292]
2.1实验分组：wt+veh：wt小鼠腹腔注射生理盐水；ko+veh：fmr1ko小鼠腹腔注射生理盐水；wt+bai：wt小鼠腹腔注射黄芩素；ko+bai：fmr1ko小鼠腹腔注射黄芩素；wt+as/tmz： wt小鼠腹腔注射替莫唑胺及黄芩素；ko+bai/tmz：fmr1ko小鼠腹腔注射替莫唑胺及黄芩素，共6组，每组7-9只(即n＝7-9)。
[0293]
2.2给药方式：与“一、新位置识别实验”的药物给药方式相同
[0294]
3实验步骤
[0295]
该测试是以啮齿类动物优先探索陌生物体而非熟悉物体的特点来测量它们的新物体识别能力。新物体识别是记忆任务的一种形式，它不依赖于空间提示。在这个任务中，动物被训练来识别特定对象。
[0296]
如图5a，首先，实验动物被带到行为学测试实验室，适应至少1个小时。在训练阶段，每只动物单独放置在一个走廊长度相同的l型场地中，两个完全相同的物体被放置在两侧走廊尽头，并被允许探索10min。在测试阶段，其中一个已经熟悉的物体被替换成一个新物体，记录10min内，实验动物对新旧两个不同物体的探索时间。一个正常的动物，应该花更多的时间在探索陌生物体上。判别标准是根据识别陌生物体所花费的时间百分比与识别熟悉物体所花费的时间之间的差异来计算的。在测试阶段，对物体的探测定义为动物的鼻子
距离物体1cm 之内的任何探索行为，包括头部方向、攀爬、嗅探等。判别指数的计算方法为：判别指数＝(陌生物体识别时间/总识别时间
×
100)-(熟悉物体识别时间/总识别时间
×
100)。
[0297]
每只小鼠测试结束后用纯净水将场景进行清洁以免影响后续小鼠实验结果。
[0298]
4实验结果
[0299]
数据采用grapapad prism软件进行双因素方差分析(two-way anova)，数据处理结果以 mean
±
sem表示，当p《0.05时认为有显著性水平差异，具有统计学意义。
[0300]
小鼠新物体识别实验的结果统计如图5b所示。wt+veh；ko+veh；wt+bai；ko+bai； wt+bai/tmz；ko+bai/tmz组的判别指数依次为：32.80％；-13.3％；29.04％；36.34％；-18.05％；
ꢀ‑
8.21％。
[0301]
实验结果表明：wt小鼠更倾向于探索新物体，而fmr1ko小鼠与wt小鼠表现相反，这说明fmr1ko小鼠的学习记忆能力有缺陷，黄芩素给药后可以矫正这种缺陷。而tmz可以阻断黄芩素对fmr1ko小鼠的学习记忆改善作用。
[0302]
由上述实验可知：黄芩素可以通过调控成体神经发生改善脆性x染色体综合征模型小鼠的记忆力。
[0303]
四、社交互动实验
[0304]
社交互动障碍是孤独症患者最显著的表现形式之一。本实验使用了三箱交互社交行为学测试实验来检测黄芩素是否可以通过调控神经发生矫正脆性x染色体综合征模型小鼠的社交行为缺陷。
[0305]
1实验材料
[0306]
1.1材料:长方形的操作箱，金属笼子；两只小鼠；面巾纸；75％的酒精；两个计时器。
[0307]
1.2实验动物、药物：与“一、新位置识别实验”的实验动物、药物相同
[0308]
2实验分组及给药
[0309]
2.1实验分组：wt+veh：wt小鼠腹腔注射生理盐水；ko+veh：fmr1ko小鼠腹腔注射生理盐水；wt+bai：wt小鼠腹腔注射黄芩素；ko+bai：fmr1ko小鼠腹腔注射黄芩素；wt+as/tmz： wt小鼠腹腔注射替莫唑胺及黄芩素；ko+bai/tmz：fmr1ko小鼠腹腔注射替莫唑胺及黄芩素，共6组，每组6-10只(即n＝6-10)。
[0310]
2.2给药方式：与“一、新位置识别实验”的药物给药方式相同
[0311]
3实验步骤
[0312]
该测试是以啮齿类动物天生喜群居、对新物件具有探索倾向的特点来检测它们的社交行为变化。社会行为测试装置为三室箱，分隔墙由黑色有机玻璃制成，里面有直径7cm的小圆门，动物可以在三箱中自由活动。
[0313]
如图6a，首先，实验动物被带到行为学测试实验室，适应至少1个小时。该实验包括三个阶段:习惯化、社会交往测试和社会新颖性识别。在测试阶段，实验动物第一次被置于中间箱，并允许自由探索左中右三室10min；接下来，一只陌生动物放置在左室侧的钢丝笼中，右室侧钢丝笼中放入玩具，在社会交往测试中，记录10min内，实验动物对玩具和陌生动物的探索时间。在社会新颖性识别测试中，之前曾经互动过的动物保持不变(左室侧)，右室侧内的玩具被置换成一只新的陌生动物(右室侧)，记录10min内，实验动物对熟悉动物(左
室侧，来自于之前的社会交往阶段)和陌生动物(右室侧，新置换动物)的探索时间。判别标准是根据识别陌生动物所花费的时间百分比与识别玩具(或者识别熟悉动物)所花费的时间之间的差异来计算的。在测试阶段，对物体或者另一只动物的探测定义为动物的鼻子距离物体钢丝笼或另一只动物钢丝笼1厘米之内的任何探索行为，包括头部方向、攀爬、嗅探等。判别指数的计算方法为：判别指数＝(陌生动物识别时间/总识别时间
×
100)-(玩具或者熟悉动物识别时间/总识别时间
×
100)。
[0314]
每只小鼠测试结束后用纯净水将场景进行清洁以免影响后续小鼠实验结果。
[0315]
4实验结果
[0316]
数据采用grapapad prism软件进行双因素方差分析(two-way anova)，数据处理结果以 mean
±
sem表示，当p《0.05时认为有显著性水平差异，具有统计学意义。
[0317]
小鼠社交互动实验的结果统计如图6b所示。wt+veh；ko+veh；wt+bai；ko+bai； wt+bai/tmz；ko+bai/tmz组的判别指数依次为：32.68％；-32.59％；37.47％；67.12％；5.58％；
ꢀ‑
15.54％。
[0318]
实验结果表明：wt小鼠更倾向于与新的小鼠互动，而fmr1ko小鼠更倾向于与旧的小鼠互动，这说明fmr1ko小鼠的社交能力有缺陷，黄芩素给药后可以矫正这种缺陷。而tmz可以阻断黄芩素对fmr1ko小鼠的社交互动改善作用。由此得出结论，黄芩素可以通过调控神经发生矫正脆性x染色体综合征模型小鼠的社交互动障碍。
[0319]
由上述实验可知：黄芩素可以通过调控神经发生矫正脆性x染色体综合征模型小鼠的社交缺陷。
[0320]
本发明上述实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种黄芩素在制备治疗遗传性智力与认知功能障碍性疾病的药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述遗传性智力与认知功能障碍性疾病为孤独症、脆性x染色体综合征或与相关神经发育障碍性疾病认知功能障碍，优选为脆性x染色体综合征。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述药物由黄芩素和药学上可接受的载体组成。4.如权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述药物是通过胃肠道给药或/和非胃肠道给药途径给药。5.如权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述药物以口服制剂、注射剂或局部给药制剂形式存在。6.如权利要求5所述的应用，其特征是，所述口服制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂或溶液剂；所述注射剂包括注射液剂型或注射用冻干粉针剂型；局部给药制剂包括霜剂、软膏剂、喷雾剂、气雾剂或贴剂。7.如权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述黄芩素的纯度超过60％。

技术总结
本发明公开了一种黄芩素在制备治疗遗传性智力与认知功能障碍性疾病的药物中的应用。试验证明，黄芩素的抗遗传性智力与认知功能障碍的性能和功效显著，毒副作用小、是一种安全、高效、疗效稳定的治疗脆性X染色体综合征的药物，适于工业化生产，易于推广。本发明为治疗脆性X染色体综合征及由于体内X染色体在遗传过程中因发生变化、突变所导致的相关疾病提供了一种新的药物来源，提供了黄芩素的新的药用用途。途。


技术研发人员：李越 张师愚 陈晓鹏 田晓轩
受保护的技术使用者：天津中医药大学
技术研发日：2022.07.20
技术公布日：2022/11/1