1.本发明涉及药物缓释微球的制备领域，尤其涉及一种药物缓释微球的制备 方法，具体地，涉及一种可有效缓解类风湿关节炎疾病的可注射重组人ⅱ型肿 瘤坏死因子受体抗体融合蛋白-聚乳酸羟基乙酸药物缓释微球的制备方法。
背景技术：2.类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，ra)是一种以慢性滑膜炎和关节结构破 坏为主要症状的全身炎症性疾病，发病关节多为对称性、进行性及侵蚀性的多 关节慢性肿痛。造成关节的慢性炎症和血管翳的形成，病变的滑膜侵蚀下层的 软骨和骨组织，最终造成关节结构破坏，功能障碍，甚至残疾。ra为多因素 疾病，其基本病理特征是淋巴细胞等炎性细胞浸润引起的滑膜炎和血管炎。细 胞因子在疾病的发生发展中起到关键作用，比较肯定的是细胞因子调控网络的 失衡参与了ra的病理过程。t、b细胞均可通过分泌大量的细胞因子作用于滑 膜细胞，刺激滑膜组织中的新生血管形成、滑膜细胞增殖、单核/巨噬细胞的侵 润，参与ra滑膜炎症。同时这些细胞因子又可通过复杂的细胞因子网络反过 来作用于免疫细胞，进一步使自身免疫反应扩大。除了免疫细胞外，滑膜组织 中的巨噬样滑膜细胞和成纤维样滑膜细胞也可产生如tnf-a、il-1、il-6、il-12 等多种细胞因子。在参与ra滑膜炎症众多的细胞因子中，tnf-a起着极其关 键的作用。它通过刺激滑膜成纤维细胞的增殖、诱导il-6、gm-csf、趋化因 子以及基质金属蛋白酶和前列腺素的产生等机制导致滑膜增殖、软骨侵蚀和全 身性的炎症反应。
3.注射用重组人ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhtnfr:fc)是由人 p75肿瘤坏死因子-α(tnf-α)受体与人igg1的fc段组成的一种融合蛋白。在 人体fc达稳态的时间为408
±
20h。其中fc段只包括有铰链区、ch2区、ch3 区，有较好的非免疫原性和耐受性。由于在结构上，含有2个可溶性的tnf
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α受体，所以它与细胞表面tnf-α受体相比，特异性结合tnf-α的作用更强， 从而阻断细胞表面tnf-α受体与tnf-α的相互作用，降低其生物活性。现有 的药物均需对患者进行短时间多次注射，如何解决现有的生物利用度低，以及 多次注射带来的患者依从性低的问题急需解决。
技术实现要素：4.本发明的发明人发现，聚乳酸-羟基乙酸聚合物(plga)是由乳酸和羟基乙 酸的单体随机聚合而成的一种可降解的功能高分子有机化合物。微球制剂具有 诸多优点，如可避免出现血药浓度峰谷现象、减小不良反应、提高药物的生物 利用度等。plga具有性能优良、成囊成膜性好、无毒、制备方便等优点可作 为多种药物缓释载体。plga微球具有保护药物免遭破坏，靶向药物到某些特 殊组织，延缓/控制药物释放，延长药物作用时间，降低药物毒性和刺激性等优 点。
5.聚多巴胺(pda)是一种贻贝仿生类材料，可由多巴胺(da)在弱碱性环 境下自聚而得，具有良好的粘附性、稳定性和生物相容性。pda的结构中含有 大量的邻苯二酚和一、二
级胺，使得其几乎可黏附于任何表面，并具有良好的 光学、电学性能，因此在医学和材料学中得到了广泛的研究。吸附在材料表面 的pda可以视作反应的“桥梁”，通过迈克尔加成或席夫碱反应，与含亲核基 团的试剂发生反应，从而在材料表面引入其他功能性基团，实现材料的表面改 性。同时，pda是黑色素的主要成分，分布于人体各个部位，因而具有良好的 生物相容性。
6.本发明的一个目的在于提高微球的药物负载率，且提高负载的稳定性，同 时消除微球的突释效应，从而避免对患者在短时间内进行多次注射，提高生物 利用度，从而避免出现由于多次注射带来的患者依从性低的问题。
7.本发明的一个进一步的目的在于提高纳米羟基磷灰石的生物相容性以及稳 定性。
8.特别地，本发明提供了一种药物缓释微球的制备方法，包括如下步骤：
9.提供无定形的纳米羟基磷灰石(nhap)；
10.将所述nhap分散于无机盐溶液中，作为内水相，将plga和 pdlla-peg-pdlla溶解在乙酸乙酯中作为油相，乳化制备成w/o乳液，再 对所述w/o乳液与聚乙烯醇溶液进行乳化，得到w/o/w乳液；
11.对所述w/o/w乳液进行搅拌抽真空，离心得到微球，并对所述微球进行 刻蚀、冷冻干燥，得到nhap-plga多孔微球；
12.将所述nhap-plga多孔微球与多巴胺溶解于缓冲液中，搅拌离心并冷冻 干燥得到pda修饰的nhap-plga多孔微球；
13.将所述pda修饰的nhap-plga多孔微球分散在磷酸盐缓冲液中，并施加 重组人ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白(rhtnfr:fc)溶液，冷冻干燥后 得到rhtnfr:fc-plga可注射药物缓释微球。
14.可选地，所述将所述nhap-plga多孔微球与多巴胺溶解于缓冲液中，搅 拌离心并冷冻干燥得到pda修饰的nhap-plga多孔微球的步骤中，所述 nhap-plga多孔微球与所述多巴胺的质量比为范围在5-10:1中任一值；
15.所述nhap-plga多孔微球、多巴胺和缓冲液的溶液中，所述nhap-plga 多孔微球的质量分数为范围在0.1-1％中任一值；
16.可选地，所述缓冲液为三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液，所述缓冲液 的ph值为范围在8-9中任一值。
17.可选地，所述将所述nhap-plga多孔微球与多巴胺溶解于缓冲液中，搅 拌离心并冷冻干燥得到pda修饰的nhap-plga多孔微球的步骤中，将所述 nhap-plga多孔微球与多巴胺溶解于缓冲液之后、且搅拌离心并冷冻干燥得 到pda修饰的nhap-plga多孔微球之前，还包括如下步骤：避光搅拌反应 12-16h，并进行水洗。
18.可选地，将所述pda修饰的nhap-plga多孔微球分散在磷酸盐缓冲液中 的步骤中，所述磷酸盐缓冲液的ph值为范围在7-8中任一值；
19.所述pda修饰的nhap-plga多孔微球和所述磷酸盐缓冲液的溶液中，所 述pda修饰的nhap-plga多孔微球的质量分数为范围在1-10％中任一值；
20.所述将所述pda修饰的nhap-plga多孔微球分散在磷酸盐缓冲液中，并 施加重组人ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白(rhtnfr:fc)溶液的步骤中， 所述rhtnfr:fc溶液
为含有rhtnfr:fc的磷酸盐缓冲液的溶液，所述 rhtnfr:fc溶液中，所述rhtnfr:fc的质量百分比为范围在0.05-0.5％中任一值；
21.可选地，所述rhtnfr:fc溶液中，所述磷酸盐缓冲液的ph值为7-8中任 一值；
22.可选地，所述将所述pda修饰的nhap-plga多孔微球分散在磷酸盐缓冲 液中，并施加重组人ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白(rhtnfr:fc)溶液， 冷冻干燥后得到rhtnfr:fc-plga可注射药物缓释微球的步骤中，在冷冻干燥 之前还包括如下步骤：在预设温度下避光搅拌反应预设时间，并进行水洗；
23.所述预设温度为范围在30-40℃中任一值，所述预设时间为范围在12-16h 中任一值。
24.可选地，所述对所述w/o/w乳液进行搅拌抽真空，离心得到微球，并对 所述微球进行刻蚀、冷冻干燥，得到nhap-plga多孔微球，包括如下步骤：
25.去除所述w/o/w乳液中的有机试剂，并进行水洗，得到微球颗粒；
26.将所述微球颗粒分散在超纯水中，搅拌12-16h，进行离心冷冻干燥操作， 得到固体粉末；
27.将所述固体粉末分散在碱性刻蚀液中进行刻蚀，并离心水洗，冷冻干燥后 得到所述nhap-plga多孔微球。
28.可选地，所述将所述nhap分散于无机盐溶液中，作为内水相，将plga 和pdlla-peg-pdlla溶解在乙酸乙酯中作为油相，乳化制备成w/o乳液， 再对所述w/o乳液与聚乙烯醇溶液进行乳化，得到w/o/w乳液的步骤中，所 述无机盐溶液中无机盐的质量比为范围在0.5-5％中任一值，所述内水相中所述 nhap的密度为10-50mg/ml中任一值；
29.可选地，所述油相中所述plga的质量比为范围在1-5％中任一值，所述 油相中所述pdlla-peg-pdlla的质量比为范围在1-5％中任一值。
30.可选地，制备w/o乳液的方法包括如下步骤：
31.配置质量百分比为范围在0.5-10％的聚乙烯醇水溶液；
32.对所述油相进行搅拌，并将所述内水相迅速加入所述油相中，得到所述 w/o乳液；
33.可选地，制备w/o乳液的方法中，所述内水相和所述油相的体积比为范围 在1:2-10中任一值。
34.可选地，制备w/o/w乳液的方法包括如下步骤：
35.对体积为所述油相的体积的5-30倍的聚乙烯醇水溶液进行搅拌；
36.将所述w/o乳液置入所述聚乙烯醇水溶液中，得到所述w/o/w乳液。
37.可选地，所述提供无定形的纳米羟基磷灰石(nhap)的步骤中，所述nhap 的制备方法包括如下步骤：
38.将聚天冬氨酸(pasp)溶液施加至钙的盐溶液中，螯合反应得到a溶液；
39.将聚丙烯酸(paa)溶液施加至十二水合磷酸氢二钠溶液中，螯合反应得 到b溶液；
40.将所述a溶液和所述b溶液分别置入超重力机内处理后进行离心水洗，得 到所述nhap。
41.可选地，所述a溶液中，所述pasp溶液与所述钙的盐溶液的体积比为范 围在1:5-25中任一值；
42.所述b溶液中，所述paa溶液和所述十二水合磷酸氢二钠溶液的体积比 为范围在
1:5-25中任一值。
43.根据本发明的方案，通过乳化制备w/o乳液，可以使得nhap有效分散在 溶解的油相的内部，再对w/o乳液与聚乙烯醇溶液进行乳化，可以使得w/o 乳液能够以液滴形式被分散在内水相中，再通过溶剂挥发析出成球。并且，通 过将nhap复合在plga微球中，能够在plga微球降解时有效地缓冲降解时 的酸性环境，从而降低对释放的蛋白药物的影响。同时，制备获得的微球具有 多孔结构，极大提高了表面积，通过多巴胺在微球表面的原位聚合，形成pda 层，显著提高了微球的药物负载率，并且由于其通过化学键结合蛋白类药物， 使得负载非常稳定，消除了微球的突释效应。
44.根据下文结合附图对本发明具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会 更加明了本发明的上述以及其他目的、优点和特征。
附图说明
45.后文将参照附图以示例性而非限制性的方式详细描述本发明的一些具体实 施例。附图中相同的附图标记标示了相同或类似的部件或部分。本领域技术人 员应该理解，这些附图未必是按比例绘制的。附图中：
46.图1示出了根据本发明一个实施例的药物缓释微球的制备方法的示意性流 程图；
47.图2示出了根据本发明一个实施例的无定形的纳米羟基磷灰石的制备方法 的示意性流程图；
48.图3示出了根据本发明一个实施例的制备w/o乳液的方法的示意性流程 图；
49.图4示出了根据本发明一个实施例的制备w/o/w乳液的方法的示意性流 程图；
50.图5示出了根据本发明一个实施例的对w/o/w乳液进行搅拌抽真空，离 心得到微球，并对所述微球进行刻蚀、冷冻干燥，得到nhap-plga多孔微球 的方法的示意性流程图；
51.图6示出了根据本发明一个实施例的纳米羟基磷灰石的傅里叶红外光谱 图；
52.图7示出了根据本发明一个实施例的纳米羟基磷灰石的xrd图；
53.图8示出了根据本发明一个实施例的纳米羟基磷灰石的透射电子显微镜 图；
54.图9示出了对w/o/w乳液进行冷冻干燥得到的微球的扫描电子显微镜图；
55.图10示出了根据本发明一个实施例的nhap-plga多孔微球的扫描电子显 微镜图；
56.图11示出了根据本发明一个实施例的pda修饰的nhap-plga多孔微球 的扫描电子显微镜图；
57.图12示出了多巴胺、nhap-plga多孔微球以及pda修饰的nhap-plga 多孔微球的傅里叶红外光谱图；
58.图13示出了根据本发明一个实施例的nhap-plga多孔微球以及对比例中 未复合nhap的plga微球在70℃加速降解后溶液的ph变化曲线图；
59.图14示出了在15天内未修饰多巴胺的可注射药物缓释微球以及本发明一 个实施例的rhtnfr:fc-plga可注射药物缓释微球的释药累积曲线对比图；
60.图15示出了图14中前12小时的曲线图；
61.图16示出了rhtnfr:fc原药和rhtnfr:fc-plga缓释微球的大鼠药代动 力学结果对比曲线图；
62.图17示出了根据本发明一个实施例的将rhtnfr:fc-plga可注射药物缓 释微球用
于治疗胶原诱导的类风湿关节炎(cia)大鼠，将大鼠主要器官切片 染色后的图片；
63.图18示出了经过注射rhtnfr:fc-plga微球后，大鼠血清中tnf-α的水 平；
64.图19示出了经过注射rhtnfr:fc-plga微球后，大鼠血清中il-6的水平；
65.图20示出了经过注射rhtnfr:fc-plga微球后，大鼠血清中il-1β水平；
66.图21示出了经过注射rhtnfr:fc-plga微球后，大鼠滑膜组织匀浆液中 tnf-α的水平；
67.图22示出了经过注射rhtnfr:fc-plga微球后，大鼠滑膜组织匀浆液中 il-6的水平；
68.图23示出了经过注射rhtnfr:fc-plga微球后，大鼠滑膜组织匀浆液中 il-1β水平。
具体实施方式
69.以下通过特定的具体实例说明本技术的实施方式，本领域技术人员可由本 说明书所揭露的内容轻易地了解本技术的其他优点与功效。显然，所描述的实 施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。本技术还可以通过另 外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不 同观点与应用，在没有背离本技术的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是， 在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。基于本技术 中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有 其他实施例，都属于本技术保护的范围。
70.图1示出了根据本发明一个实施例的药物缓释微球的制备方法的示意性流 程图。如图1所示，该制备方法包括：
71.步骤s100，提供无定形的纳米羟基磷灰石(nhap)；
72.步骤s200，将nhap分散于无机盐溶液中，作为内水相，将plga和 pdlla-peg-pdlla溶解在乙酸乙酯中作为油相，乳化制备成w/o乳液，再 对w/o乳液与聚乙烯醇溶液进行乳化，得到w/o/w乳液；
73.步骤s300，对w/o/w乳液进行搅拌抽真空，离心得到微球，并对所述微 球进行刻蚀、冷冻干燥，得到nhap-plga多孔微球；
74.步骤s400，将nhap-plga多孔微球与多巴胺溶解于缓冲液中，搅拌离心 并冷冻干燥得到pda修饰的nhap-plga多孔微球；
75.步骤s500，将pda修饰的nhap-plga多孔微球分散在磷酸盐缓冲液中， 并施加重组人ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白(rhtnfr:fc)溶液，冷冻 干燥后得到rhtnfr:fc-plga可注射药物缓释微球。
76.根据本发明的方案，通过乳化制备w/o乳液，可以使得nhap有效分散在 溶解的油相的内部，再对w/o乳液与聚乙烯醇溶液进行乳化，可以使得w/o 乳液能够以液滴形式被分散在内水相中，再通过溶剂挥发析出成球。并且，通 过将nhap复合在plga微球中，能够在plga微球降解时有效地缓冲降解时 的酸性环境，从而降低对释放的蛋白药物的影响。同时，制备获得的微球具有 多孔结构，极大提高了表面积，通过多巴胺在微球表面的原位聚合，形成pda 层，显著提高了微球的药物负载率，并且由于其通过化学键结合蛋白类药物， 使得负载非常稳定，消除了微球的突释效应。
77.图2示出了根据本发明一个实施例的无定形的纳米羟基磷灰石的制备方法 的示意性流程图。如图2所示，该制备方法包括：
78.步骤s110，将聚天冬氨酸(pasp)溶液施加至钙的盐溶液中，螯合反应 得到a溶液；
79.步骤s120，将聚丙烯酸(paa)溶液施加至十二水合磷酸氢二钠溶液中， 螯合反应得到b溶液；
80.步骤s130，将a溶液和b溶液分别置入超重力机内处理后进行离心水洗， 得到nhap。
81.该步骤s110中，该pasp溶液与所述钙的盐溶液的体积比为1:5、1:10、 1:15、1:20或1:25，也可以是范围在1:5-25中任一其他值。该pasp溶液例如 可以是将pasp分散在tris缓冲液中配置的溶液，其中该tris缓冲液的ph值 例如可以为7、7.3、7.6、7.8或8，也可以为7-8中任一值，该tris缓冲液的浓 度例如可以为0.5mm、0.8mm、1mm、1.2mm或1.5mm，也可以是0.5-1.5mm 中任一其他值。该pasp溶液的密度例如可以为10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml、 60mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml，也可以是10-10mg/ml中任一其他 值。
82.该钙的盐溶液例如可以为氯化钙(cacl2)、ca(oh)2或cahpo4·
2h2o。该 钙的盐溶液例如可以是将钙盐溶解在tris缓冲液中配置的溶液，其中该tris缓 冲液的ph值例如可以为7、7.3、7.6、7.8或8，也可以为7-8中任一值，该tris 缓冲液的浓度例如可以为0.5mm、0.8mm、1mm、1.2mm或1.5mm，也可以 是0.5-1.5mm中任一其他值。该钙的盐溶液的浓度例如可以为0.05mol/l、 0.1mol/l、0.15mol/l或0.2mol/l，也可以为0.05-0.2mol/l中任一其他值。
83.该步骤s110中，螯合反应的时间例如可以为5min、10min、20min、30min、 40min、50min或60min，也可以为5-60min中任一时间值。
84.该步骤s120中，该paa溶液和十二水合磷酸氢二钠溶液的体积比为1:5、 1:10、1:15、1:20或1:25，也可以是范围在1:5-25中任一其他值。该paa溶液 例如可以为将paa溶解在hepes缓冲盐溶液中配置的溶液，其中该hepes 缓冲盐溶液ph值例如可以为6.5、6.8、7、7.1、7.3或7.5，也可以为6.5-7.5 中任一值，该hepes缓冲盐溶液的浓度例如可以为45mm、48mm、50mm、 52mm或55mm，也可以是45-55mm中任一其他值。该paa溶液的密度例如 可以为10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml或30mg/ml，也可以是10-30mg/ml 中任一其他值。
85.该十二水合磷酸氢二钠溶液例如可以是将十二水合磷酸氢二钠溶解在 hepes缓冲盐溶液中配置的溶液，其中该hepes缓冲盐溶液ph值例如可以 为6.5、6.8、7、7.1、7.3或7.5，也可以为6.5-7.5中任一值，该hepes缓冲盐 溶液的浓度例如可以为45mm、48mm、50mm、52mm或55mm，也可以是 45-55mm中任一其他值。该十二水合磷酸氢二钠溶液的浓度例如可以为 0.05mol/l、0.1mol/l、0.15mol/l或0.2mol/l，也可以为0.05-0.2mol/l中任一其他 值。
86.该步骤s120中，螯合反应的时间例如可以为5min、10min、20min、30min、 40min、50min或60min，也可以为5-60min中任一时间值。
87.该步骤s130具体为将a溶液和b溶液分别置于超重力机的进料口，进料 流速比设置为其体积比，使得两溶液同时处理完，超重力机转速设置为 1000-2500r中任一值，在出料口得到溶液，然后离心水洗，分散于超纯水中4℃ 保存。
88.根据本发明实施例的方案，通过改性生成nhap，能够使得其生物相容性 好、稳定
且为无定形。并且通过采用将所述a溶液和所述b溶液分别置入超重 力机内处理的超重力法，可以快速且生成纳米级别的颗粒。
89.该步骤s200是利用双乳液法制备获得w/o/w乳液。该无机盐溶液中无机 盐的质量比为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％或5％，也可以是范围在 0.5-5％中任一其他值。该无机盐溶液例如可以为氯化钠溶液、碳酸氢铵溶液或 聚乙烯亚胺溶液。该内水相中nhap的密度例如为10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、 40mg/ml或50mg/ml，也可以为10-50mg/ml中任一其他值。该油相中plga的 质量比例如可以为1％、2％、3％、4％或5％，也可以为范围在1-5％中任一其 他值。该油相中pdlla-peg-pdlla的质量比例如可以为1％、2％、3％、4％ 或5％，也可以为范围在1-5％中任一其他值。
90.图3示出了根据本发明一个实施例的制备w/o乳液的方法的示意性流程 图，如图3所示，该w/o乳液的制备方法包括：
91.步骤s210，配置质量百分比为范围在0.5-10％的聚乙烯醇水溶液；
92.步骤s220，对油相进行搅拌，并将内水相迅速加入油相中，得到w/o乳 液。
93.该步骤s210中，聚乙烯醇水溶液的质量百分比例如可以为0.5％、1％、2％、 4％、6％、8％、9％或10％，也可以为0.5-10％中任一其他值。该步骤s220中， 将油相置入均质机中进行搅拌，在均质机中的转速例如可以为3000r、5000r、 8000r、10000r或12000r，也可以是3000-12000r中任一其他值。内水相和油相 的体积比例如可以为1:2、1:4、1:6、1:8、1:9或1:10，也可以为范围在1:2-10 中任一其他值。
94.图4示出了根据本发明一个实施例的制备w/o/w乳液的方法的示意性流 程图，如图4所示，该制备方法包括：
95.步骤s230，对体积为油相的体积的5-30倍的聚乙烯醇水溶液进行搅拌；
96.步骤s240，将w/o乳液置入聚乙烯醇水溶液中，得到w/o/w乳液。
97.该步骤s230中，聚乙烯醇水溶液的体积为油相的体积的5倍、10倍、15 倍、20倍、25倍或30倍，也可以为5-30倍中任一其他值。搅拌是在均质机中 进行搅拌的，且搅拌转速例如可以为10000r、12000r、15000r、18000r、20000r 或25000r，也可以是10000-25000r中任一其他值。
98.该步骤s200中，通过均质机乳化将nhap分散于plga微球中，在plga 微球降解时能够有效地缓冲降解的酸性环境。
99.图5示出了根据本发明一个实施例的对w/o/w乳液进行搅拌抽真空，离 心得到微球，并对所述微球进行刻蚀、冷冻干燥，得到nhap-plga多孔微球 的方法的示意性流程图。如图5所示，该方法包括：
100.步骤s310，去除w/o/w乳液中的有机试剂，并进行水洗，得到微球颗粒；
101.步骤s320，将微球颗粒分散在超纯水中，搅拌12-16h，进行离心冷冻干燥 操作，得到固体粉末；
102.步骤s330，将固体粉末分散在碱性刻蚀液中进行刻蚀，并离心水洗，冷冻 干燥后得到nhap-plga多孔微球。
103.该步骤s310中，可以利用以下方法去除w/o/w乳液中的有机试剂：将 w/o/w乳液迅速倒入开启搅拌桨的三颈烧瓶中，在300-600r的搅拌转速下搅 拌20-40min，之后边抽真空边搅拌1-4h，以除去有机试剂。水洗的方式例如可 以为：将烧瓶内的溶液在离心转速8500r
下离心水洗5-30min，并重复多遍水洗 过程。
104.该步骤s320中超纯水的体积为三颈烧瓶内溶液体积的1/10-1/2。搅拌时间 例如可以为12h、14h、15h或16h，也可以为12-16h中任一其他值。
105.该步骤s330中，碱性刻蚀液例如可以为氢氧化钠刻蚀液、氢氧化钾刻蚀 液、碳酸钠刻蚀液或碳酸氢钠刻蚀液。该碱性刻蚀液的浓度例如可以为 0.05mol/l、0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l、0.4mol/l或0.5mol/l，也可以为0.05-0.5 mol/l中任一其他值。固体粉末在固体粉末分散在碱性刻蚀液中形成的溶液中所 占的质量百分比例如可以为0.1％、0.5％或1％，也可以为0.1-1％中任一其他值。 刻蚀的时间例如可以为4min、6min、8min或10min，也可以为4-10min中任一 其他值。
106.该步骤s400中，nhap-plga多孔微球与多巴胺的质量比例如可以为5:1、 6:1、7:1、8:1、9:1或10:1，也可以为范围在5-10:1中任一其他值。该步骤中的 缓冲液为三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液，缓冲液的ph值例如可以为8、 8.5、8.8或9，也可以为范围在8-9中任一其他值。nhap-plga多孔微球、多 巴胺和缓冲液的溶液中，nhap-plga多孔微球的质量分数为0.1％、0.5％、0.8％ 或1％，也可以为0.1-1％中任一其他值。
107.在步骤s400中，将nhap-plga多孔微球与多巴胺溶解于缓冲液之后、且 搅拌离心并冷冻干燥得到pda修饰的nhap-plga多孔微球之前，还包括如下 步骤：避光搅拌反应12-16h，并进行水洗。避光搅拌反应的时间例如可以为12h、 13h、15h或16h，也可以为12-16h中任一其他值。水洗的方法为离心水洗，可 以水洗多遍。
108.在步骤s500中，磷酸盐缓冲液的ph值例如可以为7、7.2、7.5、7.8或8， 也可以为范围在7-8中任一其他值。pda修饰的nhap-plga多孔微球和磷酸 盐缓冲液的溶液中，pda修饰的nhap-plga多孔微球的质量分数例如可以为 1％、3％、5％、7％、9％或10％，也可以为范围在1-10％中任一其他值。rhtnfr:fc 溶液为含有rhtnfr:fc的磷酸盐缓冲液的溶液，rhtnfr:fc溶液中，rhtnfr:fc 的质量百分比例如可以为0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％，也可以为 范围在0.05-0.5％中任一其他值。rhtnfr:fc溶液中，磷酸盐缓冲液的ph值例 如可以为7、7.2、7.5、7.8或8，也可以为范围在7-8中任一其他值。
109.在该步骤s500中，在冷冻干燥之前还包括如下步骤：在预设温度下避光 搅拌反应预设时间，并进行水洗。该预设温度例如可以为30℃、34℃、38℃或 40℃，也可以为范围在30-40℃中任一其他值。该预设时间例如可以为12h、14h、 15h或16h，也可以为范围在12-16h中任一其他值。
110.图6示出了根据本发明一个实施例的纳米羟基磷灰石的傅里叶红外光谱 图。如图6所示，3500cm-1
和1600cm-1
是oh-的特征吸收峰，600cm-1
和1100 cm-1
是po
43-的特征吸收峰，说明成功合成羟基磷灰石。图7示出了根据本发明 一个实施例的纳米羟基磷灰石的xrd图。由图7可知，在25
°
左右为大包峰， 表明nhap为无定形。图8示出了根据本发明一个实施例的纳米羟基磷灰石的 透射电子显微镜图。由图8可知，纳米羟基磷灰石的粒径为10nm左右的球形 颗粒。
111.图9示出了对w/o/w乳液进行冷冻干燥得到的微球的扫描电子显微镜图。 图10示出了根据本发明一个实施例的nhap-plga多孔微球的扫描电子显微镜 图。图11示出了根据本发明一个实施例的pda修饰的nhap-plga多孔微球 的扫描电子显微镜图。由图9至图11可知，经过氢氧化钠表面刻蚀后，微球表 面形成多孔结构，然后表面原位聚合修饰pda后，表
面变得粗糙，这是由于多 巴胺聚合不均匀造成局部存在颗粒感。
112.图12示出了多巴胺、nhap-plga多孔微球以及pda修饰的nhap-plga 多孔微球的傅里叶红外光谱图，图中1表示多巴胺，2表示nhap-plga多孔 微球，3表示pda修饰的nhap-plga多孔微球。图中对比看出在3300cm-1
和1550cm-1
经过多巴胺修饰后的nhap-plga微球出现了新的峰，这与多巴胺 的o-h峰和n-h峰对应，表明nhap-plga成功修饰上了pda。
113.图13示出了根据本发明一个实施例的nhap-plga多孔微球以及对比例中 未复合nhap的plga微球在70℃加速降解后溶液的ph变化曲线图。由图13 可知，可以看出在第3、5、7天时，nhap-plga组ph显著高于plga组， 证明了nhap的有效缓冲作用。
114.图14示出了在15天内未修饰多巴胺的可注射药物缓释微球以及本发明一 个实施例的rhtnfr:fc-plga可注射药物缓释微球的释药累积曲线对比图。图 15示出了图14中前12小时的曲线图。由图14和图15可知，修饰pda后微 球的突释效应消除，并且其缓释效果更优。
115.图16示出了rhtnfr:fc原药和rhtnfr:fc-plga缓释微球的大鼠药代动 力学结果对比曲线图。由图16可知，plga微球负载rhtnfr:fc后能消除原 药的突释效应以及保持了长效缓释的效果。
116.图17示出了根据本发明一个实施例的将rhtnfr:fc-plga可注射药物缓 释微球用于治疗胶原诱导的类风湿关节炎(cia)大鼠，将大鼠主要器官切片 染色后的图片。图17中，sham组表示健康大鼠，cia组表示不给予药物治疗 的类风湿关节炎大鼠，rhtnfr:fc组表示给予原药rhtnfr:fc治疗的类风湿关 节炎大鼠，rhtnfr:fc-plga组表示给予rhtnfr:fc-plga治疗的类风湿关节 炎大鼠，比例尺＝100μm。由图18可以看出给药组的主要器官无异常，表明 rhtnfr:fc-plga缓释微球的生物安全性。
117.图18示出了经过注射rhtnfr:fc-plga微球后，大鼠血清中tnf-α的水 平。图19示出了经过注射rhtnfr:fc-plga微球后，大鼠血清中il-6的水平。 图20示出了经过注射rhtnfr:fc-plga微球后，大鼠血清中il-1β水平。图 21示出了经过注射rhtnfr:fc-plga微球后，大鼠滑膜组织匀浆液中tnf-α 的水平。图22示出了经过注射rhtnfr:fc-plga微球后，大鼠滑膜组织匀浆 液中il-6的水平。图23示出了经过注射rhtnfr:fc-plga微球后，大鼠滑膜 组织匀浆液中il-1β水平。由图18至图23可知，经过rhtnfr:fc-plga治疗 后，大鼠的tnf-α、il-6和il-1β水平均低于rhtnfr:fc组，表明将rhtnfr:fc 经过我们制备的微球负载后，治疗效果得到了显著提升。
118.实验中获得多巴胺的作用，进行了nhap-plga多孔微球以及步骤s400 得到的pda修饰的nhap-plga多孔微球(标记为nhap-plga-pda)的载药 量以及包封率的对比实验。以下表1为nhap-plga多孔微球以及 nhap-plga-pda微球的载药量以及包封率，其中每种微球进行了三次载药试 验，从而每个微球得到三个载药量以及包封率。
119.plga和0.5gpdlla-peg-pdlla溶于20ml乙酸乙酯中得到油相；配置1％pva水溶液， 得到另一水相；将油相于均质机下搅拌，达到7500r后取体积为5ml水相迅速 加入油相中，2min后，停止搅拌，得到油包水乳液；然后迅速将200ml 1％pva 水溶液置于均质机下，达到15000r后，将前面的油包水乳液倒入1％pva水溶 液中，一段时间后得到水包油包水乳液，将其迅速倒入三颈烧瓶中400r，搅拌 20min，然后边抽真空边搅拌1h，除去有机试剂；将烧瓶内的溶液以8500r 10min 离心水洗三遍后，分散于50ml超纯水中，搅拌12h，离心后冷冻干燥；称取 200mg干燥微球分散于40ml 0.2m氢氧化钠溶液中,在搅拌台上500r搅拌5min， 并以8500r 5min离心水洗三遍，冷冻干燥得到plga多孔微球。
131.rhtnfr:fc-plga可注射药物缓释微球的制备包括如下步骤：将100mgplga多孔微球与20mg多巴胺溶解于20ml ph＝8.5，tris-hcl溶液中，避光搅 拌反应12h，然后8500r 20min离心水洗三遍，冷冻干燥；称取3mg干燥微球 分散于500μl ph＝7.8 1
×
pbs溶液中，并将含有1mg rhtnfr:fc的500μlph＝7.8 1
×
pbs溶液加入其中，37℃，避光，1000r搅拌反应12h，然后10000r 5min离心水洗三遍，将离心得到的微球冷冻干燥，得到rhtnfr:fc-plga多孔 微球。
132.实施例四：
133.该实施例四与实施例一的区别在于，nhap的制备、nhap-plga多孔微球 的制备不同。该实施例四中，nhap的制备包括如下步骤：将1.110g氯化钙溶 解在100ml ph＝7.6，1mm tris溶液中，含0.15g pasp溶液溶解在10ml ph＝7.6， 1mm tris溶液中，2.149g十二水合磷酸氢二钠溶解100ml ph＝7.1，50mmhepes盐溶液中，0.3g paa溶解在20ml ph＝7.1，50mm hepes盐溶液中；将 pasp溶液缓慢滴加到氯化钙溶液中，螯合30分钟，体积比为1：10，得到溶 液a；将paa溶液缓慢滴加到十二水合磷酸氢二钠溶液中，螯合30分钟，体 积比为1：5，得到溶液b；将a和b溶液分别置于超重力机的进料口，进料 流速比为11：12，调整转速2500r/min，在出料口得到溶液，然后8500r 10min 离心水洗三遍，分散于超纯水中4℃保存。
134.nhap-plga多孔微球的制备包括如下步骤：将nhap分散于0.9％氯化 钠溶液中，nhap含量为50mg/ml，得到水相；将0.5g plga和0.5gpdlla-peg-pdlla溶于20ml乙酸乙酯中得到油相；配置1％pva水溶液， 得到另一水相；将油相于均质机下搅拌，达到7500r后将水相迅速加入油相中， 2min后，停止搅拌，得到油包水乳液；然后迅速将200ml 1％pva水溶液置于 均质机下，达到15000r后，将前面的油包水乳液倒入1％pva水溶液中，一段 时间后得到水包油包水乳液，将其迅速倒入三颈烧瓶中400r，搅拌30min，然 后边抽真空边搅拌4h，除去有机试剂；将烧瓶内的溶液以8500r 10min离心水 洗三遍后，分散于50ml超纯水中，搅拌12h，离心后冷冻干燥；称取200mg 干燥微球分散于40ml 0.2m氢氧化钠溶液中,在搅拌台上500r搅拌10min，并以 8500r 10min离心水洗三遍，冷冻干燥得到plga多孔微球。
135.实施例五：
136.该实施例五与实施例一的区别在于，nhap的制备不同。该实施例五中， nhap的制备包括如下步骤：将2.220g氯化钙溶解在200ml ph＝7.6,1mm tris 溶液中，含0.15g pasp溶液溶解在20ml ph＝7.6,1mm tris溶液中，7.163g十 二水合磷酸氢二钠溶解200ml ph＝7.1，50mm hepes盐溶液中，1g paa溶解 在40ml ph＝7.1，50mm hepes盐溶液中；将pasp溶液缓慢滴加到氯化钙溶 液中，螯合60分钟，体积比为1：10，得到溶液a；将paa溶液缓慢滴加
到 十二水合磷酸氢二钠溶液中，螯合60分钟，体积比为1：5，得到溶液b；将a 和b溶液分别置于超重力机的进料口，进料流速比为11：12，调整转速 2000r/min，在出料口得到溶液，然后8500r 10min离心水洗三遍，分散于超纯 水中4℃保存。
137.至此，本领域技术人员应认识到，虽然本文已详尽示出和描述了本发明的 多个示例性实施例，但是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，仍可根据本 发明公开的内容直接确定或推导出符合本发明常用理的许多其他变型或修改。 因此，本发明的范围应被理解和认定为覆盖了所有这些其他变型或修改。
技术特征：1.一种药物缓释微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：提供无定形的纳米羟基磷灰石(nhap)；将所述nhap分散于无机盐溶液中，作为内水相，将plga和pdlla-peg-pdlla溶解在乙酸乙酯中作为油相，乳化制备成w/o乳液，再对所述w/o乳液与聚乙烯醇溶液进行乳化，得到w/o/w乳液；对所述w/o/w乳液进行搅拌抽真空，离心得到微球，并对所述微球进行刻蚀、冷冻干燥，得到nhap-plga多孔微球；将所述nhap-plga多孔微球与多巴胺溶解于缓冲液中，搅拌离心并冷冻干燥得到pda修饰的nhap-plga多孔微球；将所述pda修饰的nhap-plga多孔微球分散在磷酸盐缓冲液中，并施加重组人ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白(rhtnfr:fc)溶液，冷冻干燥后得到rhtnfr:fc-plga可注射药物缓释微球。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将所述nhap-plga多孔微球与多巴胺溶解于缓冲液中，搅拌离心并冷冻干燥得到pda修饰的nhap-plga多孔微球的步骤中，所述nhap-plga多孔微球与所述多巴胺的质量比为范围在5-10:1中任一值；所述nhap-plga多孔微球、多巴胺和缓冲液的溶液中，所述nhap-plga多孔微球的质量分数为范围在0.1-1％中任一值；可选地，所述缓冲液为三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液，所述缓冲液的ph值为范围在8-9中任一值。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将所述nhap-plga多孔微球与多巴胺溶解于缓冲液中，搅拌离心并冷冻干燥得到pda修饰的nhap-plga多孔微球的步骤中，将所述nhap-plga多孔微球与多巴胺溶解于缓冲液之后、且搅拌离心并冷冻干燥得到pda修饰的nhap-plga多孔微球之前，还包括如下步骤：避光搅拌反应12-16h，并进行水洗。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所述pda修饰的nhap-plga多孔微球分散在磷酸盐缓冲液中的步骤中，所述磷酸盐缓冲液的ph值为范围在7-8中任一值；所述pda修饰的nhap-plga多孔微球和所述磷酸盐缓冲液的溶液中，所述pda修饰的nhap-plga多孔微球的质量分数为范围在1-10％中任一值；所述将所述pda修饰的nhap-plga多孔微球分散在磷酸盐缓冲液中，并施加重组人ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白(rhtnfr:fc)溶液的步骤中，所述rhtnfr:fc溶液为含有rhtnfr:fc的磷酸盐缓冲液的溶液，所述rhtnfr:fc溶液中，所述rhtnfr:fc的质量百分比为范围在0.05-0.5％中任一值；可选地，所述rhtnfr:fc溶液中，所述磷酸盐缓冲液的ph值为7-8中任一值；可选地，所述将所述pda修饰的nhap-plga多孔微球分散在磷酸盐缓冲液中，并施加重组人ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白(rhtnfr:fc)溶液，冷冻干燥后得到rhtnfr:fc-plga可注射药物缓释微球的步骤中，在冷冻干燥之前还包括如下步骤：在预设温度下避光搅拌反应预设时间，并进行水洗；所述预设温度为范围在30-40℃中任一值，所述预设时间为范围在12-16h中任一值。5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述对所述w/o/w乳液进行搅拌抽真空，离心得到微球，并对所述微球进行刻蚀、冷冻干燥，得到nhap-plga多孔微
球，包括如下步骤：去除所述w/o/w乳液中的有机试剂，并进行水洗，得到微球颗粒；将所述微球颗粒分散在超纯水中，搅拌12-16h，进行离心冷冻干燥操作，得到固体粉末；将所述固体粉末分散在碱性刻蚀液中进行刻蚀，并离心水洗，冷冻干燥后得到所述nhap-plga多孔微球。6.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述将所述nhap分散于无机盐溶液中，作为内水相，将plga和pdlla-peg-pdlla溶解在乙酸乙酯中作为油相，乳化制备成w/o乳液，再对所述w/o乳液与聚乙烯醇溶液进行乳化，得到w/o/w乳液的步骤中，所述无机盐溶液中无机盐的质量比为范围在0.5-5％中任一值，所述内水相中所述nhap的密度为10-50mg/ml中任一值；可选地，所述油相中所述plga的质量比为范围在1-5％中任一值，所述油相中所述pdlla-peg-pdlla的质量比为范围在1-5％中任一值。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，制备w/o乳液的方法包括如下步骤：配置质量百分比为范围在0.5-10％的聚乙烯醇水溶液；对所述油相进行搅拌，并将所述内水相迅速加入所述油相中，得到所述w/o乳液；可选地，制备w/o乳液的方法中，所述内水相和所述油相的体积比为范围在1:2-10中任一值。8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，制备w/o/w乳液的方法包括如下步骤：对体积为所述油相的体积的5-30倍的聚乙烯醇水溶液进行搅拌；将所述w/o乳液置入所述聚乙烯醇水溶液中，得到所述w/o/w乳液。9.根据权利要求1-4和7-8中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述提供无定形的纳米羟基磷灰石(nhap)的步骤中，所述nhap的制备方法包括如下步骤：将聚天冬氨酸(pasp)溶液施加至钙的盐溶液中，螯合反应得到a溶液；将聚丙烯酸(paa)溶液施加至十二水合磷酸氢二钠溶液中，螯合反应得到b溶液；将所述a溶液和所述b溶液分别置入超重力机内处理后进行离心水洗，得到所述nhap。10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述a溶液中，所述pasp溶液与所述钙的盐溶液的体积比为范围在1:5-25中任一值；所述b溶液中，所述paa溶液和所述十二水合磷酸氢二钠溶液的体积比为范围在1:5-25中任一值。
技术总结本发明提供了一种药物缓释微球的制备方法。该制备方法包括如下步骤：提供无定形的纳米羟基磷灰石；将nHAP分散于无机盐溶液中，作为内水相，将PLGA和PDLLA-PEG-PDLLA溶解在乙酸乙酯中作为油相，乳化制备成W/O乳液，再对所述W/O乳液与聚乙烯醇溶液进行乳化，得到W/O/W乳液；对所述W/O/W乳液进行刻蚀、冷冻干燥，得到nHAP-PLGA多孔微球；将所述nHAP-PLGA多孔微球与多巴胺溶解于缓冲液中，冷冻干燥得到PDA修饰的nHAP-PLGA多孔微球；将所述PDA修饰的nHAP-PLGA多孔微球分散在磷酸盐缓冲液中，并施加重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白(rhTNFR:Fc)溶液，冷冻干燥后得到rhTNFR:Fc-PLGA可注射药物缓释微球。本发明的方案显著提高了微球的药物负载率，且负载非常稳定，消除了微球的突释效应。消除了微球的突释效应。消除了微球的突释效应。
技术研发人员：张建军 杨康 李晓明
受保护的技术使用者：北京化工大学
技术研发日：2022.05.25
技术公布日：2022/11/1
