具有合理设计的编辑的细胞群体的制作方法

具有合理设计的编辑的细胞群体1.相关申请的交叉引用2.这是2020年1月11日提交的ussn16/740,420和2020年1月11日提交的ussn16/740,421的国际pct申请。发明领域3.本公开内容涉及当使用核酸引导的编辑时增加细胞群体中经编辑的哺乳动物细胞百分比的方法和组合物，以及用于使用所公开的组合物进行这些方法的自动化多模块仪器。4.发明背景5.在以下讨论中，将出于背景和介绍的目的描述某些物品和方法。本文包含的任何内容不被解释为对现有技术的“承认”。本技术人明确地保留根据情况证明根据可适用的法定条文由本文引用的物品和方法不构成现有技术的权利。6.对活细胞的基因组进行精确的、靶向的改变的能力一直是生物医学研究和开发的长期目标。最近已经鉴定出允许操纵基因序列并从而操纵基因功能的各种核酸酶。核酸酶包括核酸引导的核酸酶，其使研究人员能够在活细胞中产生永久性编辑。当然，期望在细胞群体中获得尽可能高的编辑率；然而，在许多情况下，由核酸引导的核酸酶编辑产生的经编辑的细胞的百分比可能是个位数。7.因此，在核酸引导的核酸酶编辑领域中，对于用于提高编辑效率的改进的方法、组合物、模块和仪器存在需求。本公开内容解决此需求。8.发明概述9.提供本概述是为了以简化的形式介绍概念的选择，所述概念在下文的详述中进一步描述。该概述既不意图确定所要求保护的主题的关键或基本特征，也不意图用于限制所要求保护的主题的范围。所要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优势根据下面撰写的详述，包括附图中阐明的和所附的权利要求书中限定的那些方面将是明显的。10.在某些方面，本公开内容涉及增加细胞群体(例如，哺乳动物细胞群体)中核酸引导的编辑的效率的方法、组合物、模块和自动化多模块细胞处理仪器。因此，本文展示的方法包括使用非同源末端连接(nhej)修复、碱基编辑、微同源指导修复(mmej)和/或同源指导修复(hdr)来增加靶向编辑率的方法。11.在一些方面，本公开内容提供了用于改进核酸酶指导的细胞编辑的方法，所述方法使用富集手段来鉴定已经接收进行预期编辑操作所需的编辑组分的细胞。富集可以直接或使用替代物(例如，与编辑组分中的一种或更多种组分共引入的细胞表面手柄)进行。12.在特定方面，本公开内容提供了用于改进核酸酶指导的细胞编辑的方法，所述方法使用富集手段来鉴定已经接收进行预期编辑操作所需的编辑组分的细胞。13.在一些方面，富集处理和方法可以基于替代物的阳性信号与阴性信号。在其它方面，富集方法可以基于替代物的阈值水平，例如，富集手柄的高水平与富集手柄的低水平或不存在富集手柄的水平。14.在一些方面，本公开内容提供了用于改进核酸酶指导的编辑率的方法，所述方法通过富集已经接收hdr供体的哺乳动物细胞，例如，鉴定更有可能已经接收编辑机构(editingapparatus)以及编码富集手柄的设计的细胞。15.在特定方面，本公开内容提供了用于改进核酸酶指导的哺乳动物细胞编辑的方法，所述方法使用使用富集手段来鉴定已经接收hdr供体、引导核酸和/或核酸酶的哺乳动物细胞。这样的富集可以包括用于hdr供体、引导核酸和核酸酶的单一富集方法，或者用于这些元件中的一种或更多种的两个或更多个单独的富集事件。hdr供体和引导核酸可以被单独地或共价连接地引入，如例如uspn9,982,278中所公开的。16.在一些方面，本公开内容提供了增加细胞群体中靶区编辑效率的方法，该方法包括使两个或更多个细胞的群体与编辑机构(editingmachinery)接触，该编辑机构包括(a)包含编码靶向第一靶区的grna序列的核酸的一个或更多个编辑盒，其中grna共价附接到与所述第一靶区同源的区域，所述区域包含相对于所述靶区的预期序列变化，(b)包含编码靶向第二靶区的grna序列的核酸的一个或更多个编辑盒，其中grna共价附接到编码选择性标志物的区域，和(c)与所述grna序列相容的核酸酶，使细胞群体暴露于允许细胞在第一靶区和第二靶区编辑的条件；以及从群体中富集表达选择性标志物的细胞，其中选择性标志物用作用于确定细胞群体中富集的细胞中第一靶区的编辑的替代物；并且其中针对第一靶区的编辑，与群体中不表达选择性标志物的细胞相比，富集了表达选择性标志物的细胞。17.在一些方面，本公开内容提供了提高细胞群体编辑效率的方法，该方法包括使两个或更多个细胞的群体与编辑机构接触，该编辑机构包括(a)包含编码靶向第一靶区的grna序列的核酸的一个或更多个编辑盒，其中grna共价附接到与所述第一靶区同源的区域，所述区域包含相对于所述靶区的预期序列变化，(b)包含编码靶向第二靶区的grna序列的核酸的一个或更多个编辑盒，其中grna共价附接到编码选择性标志物的区域，和(c)编码与所述grna序列相容的核酸酶的核酸，使细胞群体暴露于允许细胞在第一靶区和第二靶区编辑的条件，以及从群体中富集表达选择性标志物的细胞，其中选择性标志物用作用于确定细胞群体中富集的细胞中第一靶区的编辑的替代物。18.在某些方面，细胞富集使用对表达选择性标志物的细胞的物理富集。这方面的实例包括荧光激活的细胞分选选择、磁激活的细胞分选选择、抗生素选择等。19.在某些方面，细胞富集使用基于选择性标志物的存在的计算富集(computationalenrichment)。20.在一些方面，靶向第一靶区的编辑盒还包含条形码。在特定方面，该方法还包括掺入位点特异性基因组条形码，该条形码使得能够追溯群体内的个体经编辑的细胞。21.在本发明的特定方面，使用融合蛋白来改进hdr，所述融合蛋白保留rna指导的核酸酶的某些特性(例如，结合特异性和裂解一条或更多条dna链的能力)，并且还利用其他酶促活性，例如，复制抑制、逆转录酶活性、转录增强活性等。可以使用公开的方法将这些核酸酶融合蛋白用于核酸酶指导的编辑，无论是否使用如本文公开的富集方法。hdr供体和引导核酸可以被单独地或共价连接地引入，如例如uspn9,982,278中所公开的。22.在本发明的特定方面，使用融合蛋白来改进hdr，所述融合蛋白保留rna指导的核酸酶的结合功能和切口酶活性，并且还利用其他酶促活性，例如，复制抑制、逆转录酶活性、转录增强活性等。可以使用公开的方法将这些切口酶融合蛋白用于rna指导的切口酶编辑，无论是否使用如本文公开的富集方法。hdr供体和引导核酸可以被单独地或共价连接地引入，如例如uspn9,982,278中所公开的。此外，切口酶可以用编码切口酶的dna单独地引入或与供体dna和引导dna共价连接地引入，或以蛋白形式单独地引入。23.在特定方面，编辑方法包括使用融合蛋白与核酸，该核酸具有共价附接到与靶区同源的区域的引导rna，所述区域包含天然靶序列的一个或更多个改变，以及优选地使用至少一种富集机制，物理富集机制或计算富集机制。这样的方法可以使用单个引导rna构建体，或者使用两种或更多种引导rna构建体来靶向不同的基因组位置。在一些方面，核酸包含多于一个共价附接到基因组内不同靶区的引导rna。24.在特定方面，编辑方法包括使用切口酶融合蛋白与核酸，该核酸具有共价附接到与靶区同源的区域的引导rna，所述区域包含天然靶序列的一个或更多个改变，以及使用至少一种富集机制，物理富集机制或计算富集机制。25.用于编辑方法的融合蛋白和富集的使用可以包括用于hdr供体、引导核酸和核酸酶的单一富集方法，或用于这些编辑机构元件中的一种或更多种的两个或更多个单独的富集事件。26.在特定方面，接收hdr供体的细胞可以使用初始富集步骤(例如，使用抗生素选择或荧光检测)，随后为使用接收和表达共引入的细胞表面抗原的细胞的富集的富集步骤来富集。27.在本公开内容的方法和仪器中可以使用许多富集手柄，包括但不限于连接到标签(例如，血凝素(ha)标签、flag标签、sbp标签等)的各种细胞表面分子。在某些方面，加标签的细胞表面标志物被修饰以改变其活性，包括但不限于δtetherin-ha、δtetherin-flag、δtetherin-sbp等。28.在一些方面，富集手柄可以结合亲和配体(例如，被工程化成包含ha标签、flag标签、sbp标签等)。在一些方面，富集手柄可以是异源细胞表面受体(通常不存在于待编辑的细胞类型中的细胞表面受体)或具有工程化的表位标签的自体细胞表面抗原。在特定方面，该方法使用编辑选择盒，例如，gfp到bfp编辑盒。29.本公开内容还包括具有富集模块的自动化多模块细胞编辑仪器，该富集模块执行富集方法，包括本文描述的富集方法，以增加细胞(例如，哺乳动物细胞)群体的总编辑效率。30.本公开内容的一种示例性自动化多模块细胞编辑仪器包括被配置成容纳全部或一些模块的壳体，被配置成接收细胞的容器，被配置成接收核酸的一个或更多个容器，被配置成将核酸和/或蛋白引入细胞的编辑机构引入模块，被配置成允许细胞在编辑机构引入之后恢复的恢复模块，用于富集已经接收编辑核酸和/或核酸酶的细胞的富集模块，被配置成允许引入的核酸编辑细胞中的核酸的编辑模块，以及被配置成基于使用者输入和/或预编程脚本的选择来操作自动化多模块细胞编辑仪器的处理器。31.本公开内容的一种示例性自动化多模块细胞编辑仪器包括被配置成容纳全部或一些模块的壳体，被配置成接收细胞和编辑核酸的容器，被配置成将核酸引入细胞的编辑机构引入模块，被配置成允许细胞在编辑机构引入之后恢复的恢复模块，用于富集已经接收编辑核酸和/或核酸酶的细胞的富集模块，被配置成允许引入的核酸编辑细胞中的核酸的编辑模块，以及被配置成基于使用者输入和/或预编程脚本的选择来操作自动化多模块细胞编辑仪器的处理器。32.本公开内容的一种示例性自动化多模块细胞编辑仪器包括被配置成容纳一些或全部模块的壳体，被配置成接收细胞的容器，被配置成接收用于编辑的核酸的至少一个容器，被配置成使细胞生长的生长模块，包括将编辑核酸引入细胞的流通式电穿孔器的编辑机构引入模块，用于富集已经接收编辑核酸和/或核酸酶的细胞的富集模块，被配置成允许编辑核酸编辑细胞中的核酸的编辑模块，以及被配置成基于使用者输入和/或预编程脚本的选择来操作自动化多模块细胞编辑仪器的处理器。33.本公开内容的一种示例性自动化多模块细胞编辑仪器包括被配置成容纳一些或全部模块的壳体，被配置成接收细胞和编辑核酸的容器，被配置成使细胞生长的生长模块，被配置成浓缩细胞并使细胞成为电感受态的过滤模块，包括将编辑核酸引入细胞的流通式电穿孔器的编辑机构引入模块，用于富集已经接收编辑核酸的细胞的富集模块，被配置成允许细胞在电穿孔后恢复并允许核酸编辑细胞的编辑模块，以及被配置成基于使用者输入来操作自动化多模块细胞编辑仪器的处理器。34.任选地，核酸和/或细胞被包含在试剂匣内，试剂匣被引入仪器的容器中。用于本公开内容的这样的匣在例如uspn10,376,889、uspn10,478,822和uspn10,406,525中描述，出于所有目的将这些通过引用并入本文。35.本文描述的方法使得使用者能够获得具有高得多的比例的具有精确的预期编辑的细胞和较少的未编辑和/或未精确编辑的细胞的细胞群体。本发明的方法可以在细胞群体内产生20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多的预期编辑。36.相应地，在一些方面，本公开内容提供了使用本文描述的本公开内容中的编辑方法创建的细胞文库。37.在一些方面，本公开内容提供了使用用于切口酶指导的基因组编辑的自动化编辑系统创建的细胞文库，其中该系统包括壳体，被配置成接收细胞和包含促进细胞中切口酶指导的基因组编辑事件的序列的一种或更多种合理设计的核酸的容器，用于将一种或更多种核酸引入细胞的转化单元，用于允许切口酶指导的基因组编辑事件在细胞中发生的编辑单元，富集模块，以及被配置成基于使用者输入来操作仪器的基于处理器的系统，其中由自动化系统创建的切口酶指导的基因组编辑事件产生包含具有合理设计的编辑的个体细胞的细胞文库。38.在一些方面，本公开内容提供了使用用于切口酶指导的基因组编辑的自动化编辑系统创建的细胞文库，其中该系统包括壳体，被配置成接收细胞的细胞容器，被配置成接收包含促进细胞中切口酶指导的基因组编辑事件的序列的一种或更多种合理设计的核酸的核酸容器，用于将一种或更多种核酸引入细胞的转化单元，用于允许切口酶指导的基因组编辑事件在细胞中发生的编辑单元，以及被配置成基于使用者输入来操作仪器的基于处理器的系统，其中由自动化系统创建的切口酶指导的基因组编辑事件产生包含具有合理设计的编辑的个体细胞的细胞文库。39.下面更详细地描述本发明的这些方面和其他特征和优势。40.详细描述41.除非明确声明或者特征或功能与另外的实施方案不兼容，否则结合本文描述的方法、装置或仪器的一种实施方案描述的所有功能意在适用于本文描述的方法、装置和仪器的另外的实施方案。例如，在结合一种实施方案明确描述给定特征或功能但没有结合替代实施方案明确提及该特征或功能的情况下，应当理解，除非该特征或功能与替代实施方案不兼容，否则该特征或功能可以结合替代实施方案来部署、利用或实现。42.除非另外指出，否则本文描述的技术的实践可以采用分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和遗传工程技术的常规技术和描述，这些都在本领域从业的人员的技术内。这样的常规技术和描述可以见于标准实验室手册，诸如green和sambrook,molecularcloning:alaboratorymanual.第4版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,(2014)；currentprotocolsinmolecularbiology,ausubel等人编著,(2017)；neumann等人,electroporationandelectrofusionincellbiology,plenumpress,newyork,1989；和chang等人,guidetoelectroporationandelectrofusion,academicpress,california(1992)，所有文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。核酸引导的核酸酶技术可以见于，例如，genomeeditingandengineeringfromtalensandcrisprstomolecularsurgery,appasani和church(2018)；以及crispr:methodsandprotocols,lindgren和charpentier,2015；这两篇文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。43.注意，除非上下文另外清楚指示，如本文和所附的权利要求书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“细胞”是指一个或更多个细胞，并且提及“该系统”包括提及本领域技术人员已知的等同步骤、方法和装置，等等。另外，应当理解，本文可以使用的术语诸如“左”、“右”、“顶”、“底”、“前”、“后”、“侧”、“高度”、“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“内部”、“外部”、“内”、“外”等仅描述参考点，并且不必然将本公开内容的实施方案限制为任何特定的方向或配置。此外，术语诸如“第一”、“第二”、“第三”等仅标识如本文公开的许多部分、部件、步骤、操作、功能和/或参考点中的一个，并且同样不必然将本公开内容的实施方案限制为任何特定的配置或方向。44.除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的相同含义。出于所有目的，包括但不限于描述和公开可以与本文描述的发明结合使用的设备、制剂和方法，本文提及的所有的出版物通过引用并入。45.在提供值的范围情况下，应理解，在该范围的上限值和下限值之间的每一个中间值和该规定的范围内的任何其他规定的值或中间值被涵盖在本发明内。这些较小的范围的上限值和下限值可以独立地被包括在较小的范围内，并且也被涵盖在本发明内，受限于规定的范围内的任何特定地排除的限值。在规定的范围包括限值中的一个或两个的情况下，排除那些所包括的限值中的任一个或两个的范围也被包括在本发明中。46.在以下的描述中，阐述了许多具体细节，以提供对本发明的更充分理解。然而，对本领域技术人员将明显的是，可以在没有一个或更多个这些具体细节的情况下实践本发明。在其他情况下，为了避免使本发明含混不清，未描述本领域技术人员熟知的特征和程序。本文使用的术语意在具有如由本领域普通技术人员理解的平白且普通的含义。47.如本文使用的术语“互补”是指核苷酸之间的watson-crick碱基配对，并且特别地是指彼此形成氢键的核苷酸，其中胸腺嘧啶或尿嘧啶残基通过两个氢键与腺嘌呤残基连接，并且胞嘧啶和鸟嘌呤残基通过三个氢键连接。通常，核酸包含被描述为与指定的第二核苷酸序列具有“互补性百分比”或“同源性百分比”的核苷酸序列。例如，核苷酸序列可以与指定的第二核苷酸序列具有80％、90％或100％的互补性，指示序列的10个核苷酸中的8个、10个核苷酸中的9个或10个核苷酸中的10个与指定的第二核苷酸序列互补。例如，核苷酸序列3’‑tcga-5’与核苷酸序列5’‑agct-3’是100％互补的；并且核苷酸序列3’‑tcga-5’与核苷酸序列5’‑ttagctgg-3’的区域是100％互补的。48.术语dna“控制序列”统指启动子序列、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制起点、内部核糖体进入位点、核定位序列、增强子等，它们共同地提供编码序列在接受者细胞中的复制、转录和翻译。只要选择的编码序列能够在适当的宿主细胞中被复制、转录和(对于一些组分)翻译，则并非所有这些类型的控制序列都需要存在。49.如本文使用的，术语“供体dna”或“供体核酸”是指被设计成通过使用核酸引导的核酸酶的同源重组将dna序列修饰(插入、缺失、取代)引入基因座(例如，靶基因组dna序列或细胞靶序列)的核酸。对于同源指导的修复，供体dna必须与基因组靶序列中的“切割位点”或待编辑位点侧翼的区具有足够的同源性。一条或更多条同源臂的长度将取决于，例如，所做修饰的类型和尺寸。在许多情况下，并且优选地，供体dna将与基因组靶基因座具有两个序列同源性区(例如，两个同源臂)。优选地，“插入物(insert)”区或“dna序列修饰”区(期望引入细胞中的基因组靶基因座的核酸修饰)将位于两个同源区之间。dna序列修饰可以改变一个特定位点或多个特定位点处的靶基因组dna序列的一个或更多个碱基。改变可以包括改变基因组靶序列的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、75个、100个、150个、200个、300个、400个或500个或更多个碱基对。缺失或插入可以是基因组靶序列的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、40个、50个、75个、100个、150个、200个、300个、400个或500个或更多个碱基对的缺失或插入。50.术语“引导核酸”或“引导rna”或“grna”是指包含以下的多核苷酸：1)能够与基因组靶基因座杂交的引导序列和2)能够与核酸引导的核酸酶相互作用或复合的支架序列。[0051]“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间的序列相似性，或者在本公开内容的上下文中，更常见地是指两个核酸分子之间的序列相似性。术语“同源区”或“同源臂”是指供体dna上与靶基因组dna序列具有一定程度同源性的区域。同源性可以通过比较每个序列中的位置来确定，所述每个序列可以出于比较的目的而被对齐。当比较的序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么分子在该位置处是同源的。序列之间的同源性程度随着序列共有的匹配或同源位置数而变化。[0052]如本文使用的术语“切口酶”是指在特定的识别核苷酸序列处切割双链dna的一条链的核酸酶。[0053]“可操作地连接”指其中如此描述的组分被配置以执行它们的通常功能的元件布置。因此，可操作地连接至编码序列的控制序列能够影响编码序列的转录，并且在一些情况下，能够影响编码序列的翻译。只要控制序列发挥指导编码序列的表达的作用，控制序列不必与编码序列邻接。因此，例如，不翻译但转录的间插序列可以存在于启动子序列和编码序列之间，且启动子序列仍可以被认为是“可操作地连接”至编码序列。事实上，这样的序列不必驻留于同一连续dna分子(即染色体)上，并且仍可以具有引起调控改变的相互作用。[0054]如本文使用的，术语“蛋白”和“多肽”可互换地使用。蛋白可以完全由氨基酸组成，也可以不完全由氨基酸组成。[0055]“启动子”或“启动子序列”是能够与rna聚合酶结合并启动多核苷酸或多肽编码序列(诸如信使rna、核糖体rna、小核rna(smallnuclearrna)或核仁小rna(smallnucleolarrna)、引导rna或由任何类别的任何rna聚合酶i、ii或iii转录的任何种类的rna)的转录的dna调控区。启动子可以是组成型或诱导型的。[0056]如本文使用的术语“选择性标志物(selectablemarker)”是指引入细胞中的、赋予适于人工选择的性状的基因。一般使用的选择性标志物是本领域普通技术人员熟知的。例如，选择性标志物可以使用耗尽细胞群体以富集编辑的手段，并包括氨苄青霉素/羧苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、诺尔丝菌素、n-乙酰基转移酶、红霉素、四环素、庆大霉素、博莱霉素、链霉素、嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟素和g418，或者可以采用其他选择性标志物。此外，选择性标志物包括赋予可以用于物理或计算的细胞富集的表型的物理标志物，例如，光学选择性标志物诸如荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白)和细胞表面手柄。[0057]如本文使用的术语“特异性结合”包括两种分子(例如，工程化肽抗原和结合靶)之间的具有由约10-7m、约10-8m、约10-9m、约10-10m、约10-11m、约10-12m、约10-13m、约10-14m或约10-15m的解离常数表示的结合亲和力的相互作用。[0058]术语“靶基因组dna序列”、“细胞靶序列”、“靶序列”或“基因组靶基因座”是指体外或体内，或者细胞或细胞群体的核酸(例如，基因组或附加体)中的期望使用核酸引导的核酸酶编辑系统对至少一个核苷酸进行改变的任何基因座。靶序列可以是基因组基因座或染色体外基因座。[0059]术语“变体”可以指与参考多肽或多核苷酸不同但保留基本特性的多肽或多核苷酸。多肽的典型变体的氨基酸序列与另一参考多肽有差异。通常，差异是有限的，使得参考多肽和变体的序列总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。变体和参考多肽的氨基酸序列可以相差一个或更多个修饰(例如，取代、添加和/或缺失)。多肽的变体可以是保守修饰的变体。取代或插入的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基(例如，非天然氨基酸)。多肽的变体可以是天然存在的，诸如等位基因变体，或者多肽的变体可以是已知不是天然存在的变体。[0060]“载体”是包含待递送至细胞和/或在细胞中表达的期望的一种序列或更多种序列的多种核酸中的任一种。载体通常由dna构成，但是rna载体也是可用的。载体包括但不限于质粒、f粘粒(fosmid)、噬菌粒、病毒基因组、合成染色体等。在本公开内容中，术语“编辑载体”包含核酸酶的编码序列、待转录的grna序列和供体dna序列。然而，在其他实施方案中，可以使用两种载体——包含核酸酶的编码序列的引擎载体、以及包含待转录的grna序列和供体dna序列的编辑载体。[0061]附图简述[0062]结合附图，根据以下对说明性实施方案的详细描述，将更充分地理解本发明的前述和其他特征及优点，在附图中：[0063]图1a-图1c描绘了藉以实践如本文教导的递归编辑方法的自动化多模块仪器及其部件。[0064]图2a描绘了用于本文描述的细胞生长模块的旋转生长瓶的一种实施方案。图2b图示了细胞生长模块中的旋转生长瓶的一种实施方案的透视图。图2c描绘了来自图2b的细胞生长模块的剖视图。图2d图示了与led、检测器和温度调节部件耦合的图2b的细胞生长模块。[0065]图3a是本文展示的tff装置中使用的切向流过滤的模型。图3b描绘了示例性tff装置的一种实施方案的下部构件(lowermember)的俯视图。图3c描绘了示例性tff装置的上部构件(uppermember)和下部构件以及膜的俯视图。图3d描绘了示例性tff装置的上部构件和下部构件以及膜的仰视图。图3e-图3k描绘了具有流体耦合的储库的tff模块的又另一实施方案的各个视图。图3l是结合图3e-图3k描述的tff模块的示例性气动架构图。[0066]图4a示出了示例性流通事电穿孔装置(此处，有共连接的六个这样的装置)。图4b是示例性流通式电穿孔装置的一种实施方案的俯视图。图4c描绘了图4c的电穿孔装置的截面的俯视图。图4d是图4c和图4d的电穿孔装置下部分的截面侧视图。[0067]图5a和图5b描绘了试剂匣的一种实施方案的结构和部件。[0068]图6是示例性自动化多模块细胞处理仪器的实施方案的简化框图。[0069]图7是示出用于进行本公开内容的编辑和选择方案的第一组示例性工作流程的图。[0070]图8是示出用于进行本公开内容的编辑和选择方案的第二组示例性工作流程的图。[0071]图9是示出用于进行本公开内容的create融合编辑方案的第一组示例性工作流程的图。[0072]图10是示出用于进行本公开内容的create融合方案的第二组示例性工作流程的图。[0073]图11是示出在多于一个细胞周期中使用具有逆转录酶活性的融合蛋白进行编辑的潜在机制的图。[0074]图12是图示用于gfp表达测定的质粒结构中的示例性元件的图。[0075]图13a和图13b是示出通过facs监测的核酸酶-gfp表达盒的递送的图。[0076]图14a和图14b是示出对nhej和hdr介导的编辑进行表型评估的gfp到bfp转换的图。[0077]图15是示出由gfp到bfp编辑盒表达的thy1.2报告物的差异表达水平的图。[0078]图16a-图16e是示出通过macs的富集过程对thy1.2高细胞水平的影响的系列图。[0079]图17是示出通过facs或macs的可比的具有较高编辑率(nhej和hdr)的细胞群体的富集的柱状图。[0080]图18是示出使用facs分选的细胞表现出的δtetherin-ha编辑盒富集的编辑的柱状图。[0081]图19a和19b是示出富集期间macs珠浓度如何影响通过富集分离的thy1.2高和thy1.2低表达细胞的相对比例的图和表。[0082]图20a和20b是示出富集期间macs珠浓度如何影响δtetherin-ha富集的细胞的相对比例的图和表。[0083]图21是示出使用不同量的thy1.2特异性macs珠富集的细胞的编辑率的柱状图。[0084]图22是示出对hap1中表达高水平的δtetherin-ha报告物的细胞进行富集后分析的柱状图。[0085]图23是示出使facs富集技术富集具有更高的dnmt3b基因处的敲入编辑率的细胞的柱状图。[0086]图24示出了cfe编辑构建体cfe2.1和cfe2.2的设计。[0087]图25示出了包含13bpty到sh编辑或与被切口的egfpdna序列互补的13bp的第二区域的各种grna的设计。[0088]图26是示出与直接核酸酶编辑相比，使用图25中的create融合编辑盒进行编辑的基本方案的图。[0089]图27a-图27d是示出使用各种方案编辑gfp到bfphek293t细胞的图。[0090]图28是示出用于create融合编辑结合facs选择的基本方案的图。[0091]图29是示出用mad7核酸酶进行编辑与用create融合编辑进行编辑得到的dsred_低细胞和dsred_高细胞的水平的图。[0092]图30是示出经编辑的细胞群体中dsred的差异表达水平的图。[0093]图31是示出使用facs分选的细胞的gfp到bfp时间进程的mad7或create融合编辑的dsred编辑的柱状图。[0094]图32是示出使用单个grna的create融合编辑的基本方案的图。[0095]图33a-图33c是示出使用慢病毒递送的create融合构建体cfe2.1和cfe2.2的编辑效率的柱状图。[0096]图34a和图34b是比较使用create融合构建体cfe2.2与mad7编辑的编辑效率的柱状图，二者都使用慢病毒递送。[0097]图35a和图35b是示出使用具有追溯或记录技术的create融合编辑系统的示例性策略的图。[0098]发明总述[0099]本公开内容涉及用于改进在细胞群体中精确编辑的方法和仪器。在编辑过程中可以使用多种细胞机制，包括非同源末端连接(nhej)修复、碱基编辑、微同源指导修复(mmej)和/或同源指导修复(hdr)。[0100]在特定方面，这些方法和仪器经由同源指导修复(hdr)改进编辑；因此，在特定方面，本公开内容提供了改进哺乳动物细胞中hdr的方法。在更特定的方面，本公开内容提供了改进人类细胞中hdr的方法。在某些特定方面，本公开内容提供了改进人类多能细胞例如诱导多能干细胞中hdr的方法。[0101]在某些方面，本公开内容提供了针对共引入的核酸的富集，用于富集已经接收核酸指导的编辑所必需的编辑组分的细胞，例如，对已经用包含编码供体核酸和/或引导核酸以及任选地核酸酶的核酸的质粒转染的细胞使用特异性选择。[0102]更具体地，对具有最高报告物表达量的细胞亚群的富集，以比未富集的群体或具有相对较低报告物表达水平的亚群更高的比率富集经历基因编辑的细胞群体。[0103]在特定方面，本公开内容涉及使用共引入编码编辑机构的核酸和细胞表面选择手柄来增加编辑效率的自动化方法。在特定方面，核酸的共引入发生在多模块自动化仪器中，如本文中更详细描述的。[0104]在某些方面，本公开内容提供了使用组合了rna指导的核酸酶和来自不同蛋白的酶促活性(例如，复制抑制、逆转录酶活性、转录增强活性等)的蛋白来改进同源指导修复(hdr)的方法。在优选的方面，这些核酸酶融合蛋白具有切口酶功能，并且因此在待编辑的dna的单链上产生切口，而不是产生双链断裂。[0105]编辑核酸酶融合蛋白可以与编辑核酸(诸如可见于例如美国专利第9,982,278号和相关专利中的那些编辑核酸)一起使用。这样的核酸编码包含与一个或更多个细胞中的核酸的靶区互补的区域的grna，该grna与编辑盒共价连接，该编辑盒包含与一个或更多个细胞中的靶区同源的区域，该区域相对于一个或更多个细胞中的靶区具有至少一个核苷酸的突变。这些核酸可以任选地包括前间区(protospacer)和/或条形码。编辑方法可以包括一组或更多组这些核酸，并在靶区中产生两个或更多个切口用于预期编辑。这样的方法的实例包括但不限于liu等人(nature,2019年12月；576(7785):149-157)中描述的那些。[0106]在某些优选实施方案中，该方法采用称为“create融合编辑”的新颖方法。“create融合编辑”是使用具有切口酶活性的核酸酶编辑酶与一种或更多种核酸一起促进编辑的新颖技术。在特定方面，create融合编辑方法利用编辑融合蛋白(例如，具有crispr靶向活性和逆转录酶活性的蛋白)和编码一种或更多种grna的核酸，该grna包含与核酸的靶区互补的区域。将一种或更多种grna与编辑盒共价连接，该编辑盒包含与靶区同源的区域，该区域相对于一个或更多个细胞中预期编辑的靶区具有至少一个核苷酸的突变。任选地，核酸还可以包含前间区邻近基序(pam)突变和/或指示靶区中的预期突变的条形码。对使用这样的create核酸的进一步描述可见于例如美国专利第9,982,278号中，出于所有目的，将该专利通过引用并入本文。[0107]使用单个grna来实现30％或更高的编辑率与liu等人(同上)中描述的双切口系统(他们教导所述双切口系统是在哺乳动物细胞中实现这样的编辑率所需的)相比有许多益处。例如，消除对第二个切口的需要允许多重化基因组编辑具有大得多的可扩展性，因为每个细胞只需要一种编辑构建体来靶向预期编辑的位点。这也增加了细胞基因组中可用于编辑的位点的数量，增强了待引入细胞群体的编辑载体文库的潜在设计和覆盖率。与双切口系统相比，使用本文描述的单个grna还将降低插入缺失(indel)的形成，并且例如，由于切口酶活性所产生的的特异性，预计将减少脱靶效应。[0108]在一些方面，核酸酶结合种子区域(nucleasebindingseedregion)中的编辑可以用于使位点具有核酸酶抗性，从而防止使用核酸酶(例如，包含切口活性的核酸酶融合蛋白)进行另外的切割。[0109]在特定方面，create融合方法可以利用具有切口酶活性的融合蛋白和单个grna来实现高效率编辑，其是liu等人(同上)中教导的技术两倍或更高。通过在靶区中创建单个切口，本公开内容的方法在不进行富集的情况下能够在哺乳动物细胞中实现超过20％的编辑效率，包括高达45％的精确编辑率。因此，本文公开的单切口系统能够实现先前描述的仅利用双切口系统的高编辑效率水平。[0110]用于进行create融合编辑的某些工作流程在图7和图8中概述。在某些优选实施方案中，这些工作流程使用自动化系统或仪器(例如，多模块仪器)进行，并在本公开内容中阐述。[0111]不受特定机制的束缚，编辑机构可以被允许持续存在于几次细胞分裂。如图9中示出的，细胞群体中的这种编辑周期允许使用引入的create融合编辑机构编辑更高比例的细胞。[0112]核酸酶指导的基因组编辑总述[0113]本文描述的组合物和方法用于进行核酸酶指导的基因组编辑，以将期望的编辑引入哺乳动物细胞群体。在一些实施方案中，在单轮编辑中引入单个编辑。在一些实施方案中，在使用同时编辑的单轮编辑中引入多于一个编辑，例如，引入单个载体上的两个或更多个编辑。在一些实施方案中，进行递归细胞编辑，其中在连续的编辑轮中引入编辑。[0114]与适当的合成的引导核酸在细胞中复合的核酸引导的核酸酶可以在期望的位置处切割细胞的基因组。引导核酸有助于核酸引导的核酸酶识别和切割特定靶序列处的dna。通过操纵引导核酸的核苷酸序列，核酸引导的核酸酶可以被编程为靶向任何dna序列用于裂解，只要适当的前间区邻近基序(protospaceradjacentmotif,pam)在附近。在某些方面，核酸引导的核酸酶编辑系统可以使用组合起来发挥引导核酸的作用的两个独立的引导核酸分子，例如crisprrna(crrna)和反式激活crisprrna(tracrrna)。在其他方面并且优选地，引导核酸是单个引导核酸构建体，其包含以下二者：1)能够与基因组靶基因座杂交的引导序列，和2)能够与核酸引导的核酸酶相互作用或复合的支架序列。[0115]通常，引导核酸(例如，grna)可以与相容的核酸引导的核酸酶复合，并且然后可以与靶序列杂交，从而将核酸酶指导至靶序列。引导核酸可以是dna或rna；可选地，引导核酸可以包含dna和rna二者。在一些实施方案中，引导核酸可以包含修饰的或非天然存在的核苷酸。在引导核酸包括rna的情况下，grna可以由多核苷酸分子诸如质粒、线性构建体上的dna序列编码，或者编码序列可以并且优选地确实位于编辑盒内。关于编辑盒的另外信息，参见例如，uspn10,240,167；uspn10,266,849；uspn9,982,278；uspn10,351,877；uspn10,364,442；和uspn10,435,715；以及2019年2月14日提交的ussn16/275,465，出于所有目的将所有这些通过引用并入本文。[0116]引导核酸包含引导序列，其中引导序列是与靶序列具有足够互补性(即，同源性)以与靶序列杂交并且指导复合的核酸引导的核酸酶与靶序列的序列特异性结合的多核苷酸序列。引导序列和对应的靶序列之间的互补性程度在使用合适的比对算法进行最佳比对时是约或多于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。最佳比对可以通过使用用于比对序列的任何合适的算法来确定。在一些实施方案中，引导序列的长度是约或多于约10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、75个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，引导序列的长度为少于约75个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个核苷酸。优选地，引导序列是10-30个或15-20个核苷酸长，或者长度是15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸。[0117]通常，为了在靶序列中产生编辑，grna/核酸酶复合体与如由引导rna确定的靶序列结合，并且核酸酶识别与靶序列邻近的前间区邻近基序(pam)序列。靶序列可以是对哺乳动物细胞而言为内源或外源的任何多核苷酸，或体外的任何多核苷酸。例如，靶序列可以是驻留于哺乳动物细胞的细胞核中的多核苷酸。靶序列可以是编码基因产物(例如，蛋白)的序列或非编码序列(例如，调控多核苷酸、内含子、pam、控制序列或“垃圾”dna(“junk”dna))。[0118]引导核酸可以是并且优选是编码靶向细胞靶序列的供体核酸的编辑盒的一部分。可选地，引导核酸可以不是编辑盒的一部分，而是可以被编码在编辑载体骨架上。例如，可以首先将编码引导核酸的序列组装或插入载体骨架中，随后将供体核酸插入例如编辑盒中。在其他情况下，可以首先将例如编辑盒中的供体核酸插入或组装到载体骨架中，随后插入编码引导核酸的序列。优选地，编码引导核酸和供体核酸的序列一起位于合理设计的编辑盒中，并经由缺口修复同时插入或组装到线性质粒或载体骨架中以创建编辑载体。在一些方面，编辑盒的pcr扩增子可以用于编辑。[0119]靶序列与前间区突变(pam)相关联，前间区突变(pam)是由grna/核酸酶复合体识别的短核苷酸序列。用于不同的核酸引导的核酸酶的精确优选的pam序列和长度要求不同；然而，pam通常是与靶序列邻近或接近的2-7个碱基对序列，并且取决于核酸酶，可以在靶序列的5'或3'。核酸引导的核酸酶的pam相互作用结构域的工程化可以允许改变pam特异性、改进靶位点识别保真度、降低靶位点识别保真度或增加核酸引导的核酸酶的多功能性。[0120]在某些实施方案中，细胞靶序列的基因组编辑既将期望的dna改变引入细胞靶序列，例如细胞的基因组dna，又去除细胞靶序列中的前间区突变(pam)区，使细胞靶序列中的前间区突变(pam)区突变或失活。使细胞靶序列处的pam失活排除了对该细胞靶序列处细胞基因组的另外的编辑，例如，在后续的编辑轮中随后暴露于与合成的引导核酸复合的核酸引导的核酸酶时。因此，具有期望的细胞靶序列编辑和改变的pam的细胞可以通过使用与合成的引导核酸复合的核酸引导的核酸酶来选择，所述合成的引导核酸与细胞靶序列互补。没有经历第一编辑事件的细胞会被切割，引起双链dna断裂，并且因此会无法继续存活。包含期望的细胞靶序列编辑和pam改变的细胞不会被切割，因为这些经编辑的细胞不再包含必需的pam位点，并且会继续生长和繁殖。[0121]至于核酸引导的核酸酶编辑系统的核酸酶组分，编码核酸引导的核酸酶的多核苷酸序列可以被密码子优化以在特定的哺乳动物细胞类型诸如干细胞中表达。待采用的核酸引导的核酸酶的选择取决于许多因素，诸如在靶序列中待进行何种类型的编辑，以及适当的pam是否位于期望的靶序列附近。本文描述的方法中使用的核酸酶包括但不限于cas9、cas12/cpfi、mad2或mad7或其他mad酶(madzyme)。与引导核酸一样，核酸酶由载体上的dna序列编码，并且任选地处于诱导型启动子的控制下。在一些实施方案中，启动子可以与控制引导核酸转录的启动子独立但相同；也就是说，单独的启动子驱动核酸酶和引导核酸序列的转录，但是这两个启动子可以是相同类型的启动子。可选地，控制核酸酶表达的启动子可以与控制引导核酸转录的启动子不同；即，例如，核酸酶可以处于例如ptef启动子的控制下，并且引导核酸可以处于例如pcyc1启动子的控制下。[0122]核酸引导的核酸酶系统的另一组分是包含与细胞靶序列的同源性的供体核酸。供体核酸与引导核酸在同一载体上并且甚至在同一编辑盒中，并且优选地(但不必须)在与编辑grna相同的启动子(即，驱动编辑grna和供体核酸二者转录的单一启动子)控制下。供体核酸被设计成用作与细胞靶序列同源重组的模板，该细胞靶序列被作为grna/核酸酶复合体的一部分的核酸引导的核酸酶切口或裂解。供体核酸多核苷酸可以具有任何合适的长度，诸如约或多于约20个、25个、50个、75个、100个、150个、200个、500个或1000个核苷酸的长度，并且如果与如2019年7月1日提交的ussn62/869,240中描述的双重grna架构组合，则长度为最多为2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb和最多20kb。在某些优选的方面，供体核酸可以以20-300个核苷酸之间，更优选地50-250个核苷酸之间的寡核苷酸提供。供体核酸包含与细胞靶序列的一部分互补的区域(例如同源臂)。当最佳比对时，供体核酸与细胞靶序列重叠(互补)例如约20个、25个、30个、35个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或更多个核苷酸。在许多实施方案中，供体核酸包含位于供体核酸和细胞靶序列之间的突变或差异的侧翼的两个同源臂(与细胞靶序列互补的区域)。供体核酸包含与细胞靶序列相比的至少一个突变或改变，诸如与细胞靶序列相比的插入、缺失、修饰或其任何组合。[0123]如关于grna描述的，供体核酸可以作为插入到编辑质粒骨架中的合理设计的编辑盒的一部分提供，其中当编辑盒被插入到编辑质粒骨架中时，编辑质粒骨架可以包含启动子以驱动编辑grna和供体dna的转录。此外，插入到编辑载体中的合理设计的编辑盒中可以有多于一种，例如两种、三种、四种或更多种编辑grna/供体核酸；可选地，单个合理设计的编辑盒可以包含两个至若干个编辑grna/供体dna对，其中每个编辑grna处于单独的不同启动子、单独的相似启动子的控制下，或者其中所有grna/供体核酸对处于单个启动子的控制下。在一些实施方案中，驱动编辑grna和供体核酸(或驱动多于一个编辑grna/供体核酸对)转录的启动子任选地是诱导型启动子。[0124]除了供体核酸之外，编辑盒可以包含一个或更多个引物位点。引物位点可以用于通过使用寡核苷酸引物扩增编辑盒；例如，如果引物位点位于编辑盒的一个或更多个其他组分的侧翼。此外，编辑盒可以包含条形码。条形码是对应于供体dna序列的独特dna序列，使得条形码可以鉴定对对应细胞靶序列进行的编辑。条形码通常包含四个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，编辑盒包含编辑grna和供体核酸的集合或文库，其代表例如编辑grna和供体核酸的全基因文库或全基因组文库。编辑盒的文库被克隆到载体骨架中，其中，例如，每个不同的供体核酸与不同的条形码相关联。此外，在优选的实施方案中，编码核酸引导的核酸酶系统的组分的编辑载体或质粒还编码包含一个或更多个核定位序列(nls)(诸如约或多于约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个nls)的核酸引导的核酸酶，所述nls特别地作为核酸酶序列的元件。在一些实施方案中，工程化核酸酶包含氨基末端处或其附近的nls、羧基末端处或其附近的nls，或组合。[0125]具有稳定整合的gfp基因的基因组拷贝的细胞可以通过流式细胞术、荧光细胞成像来实现对不同类别的基因组编辑(nhej、hdr、无编辑)的表型检测，或者通过对基因组整合的gfp基因测序来实现基因型检测。gfp基因中缺少编辑或切割事件的完全修复导致细胞保持gfp阳性。通过非同源末端连接(nhej)途径修复的切割事件常常导致核苷酸插入或缺失事件(indel)。这些indel编辑常常导致编码序列的移码突变，这造成gfp基因表达和荧光的损失。使用gfp到bfp的hdr供体作为修复模板，通过同源指导修复(hdr)途径修复的切割事件导致细胞荧光谱从gfp荧光谱到bfp荧光谱的转换。[0126]编辑盒[0127]所使用的编辑盒是介导将核酸酶靶向特定dna序列的grna的表达的质粒。编辑盒质粒还可以具有为接近核酸酶靶向切割位点的靶向插入、缺失或核苷酸交换提供模板的dna序列(例如，hdr供体)。在一种实例中，编辑盒质粒表达靶向稳定整合的gfp基因的基因组拷贝的grna，并提供介导核苷酸交换的hdr供体，所述核苷酸交换将gfp的氨基酸编码序列转换为bfp的氨基酸编码序列。[0128]rna引导的核酸酶(例如，cas9、cpf1、mad7)可以通过编码核酸酶的表达质粒、编码核酸酶的mrna、重组核酸酶蛋白的方式或通过产生表达核酸酶的稳定细胞系被递送到细胞。在该特定实例中，mad7核酸酶通过编码核酸酶的表达质粒的方式递送。[0129]编辑盒质粒和核酸酶可以通过常规的哺乳动物细胞转染技术递送到靶细胞。[0130]进行核酸引导的核酸酶编辑的自动化细胞编辑仪器和模块[0131]自动化细胞编辑仪器[0132]图1a描绘了例如进行包括如本文描述的分体式(split)蛋白报告物系统的示例性工作流程之一的示例性自动化多模块细胞处理仪器100。例如，仪器100可以并且优选地被设计为用于在实验室环境中使用的独立台式仪器。仪器100可以包括可重复使用部件和一次性部件的混合物，用于在细胞中进行自动化基因组裂解和/或编辑时进行各种集成的过程而无人工干预。图示了机架(gantry)102，机架102提供了自动化机械运动系统(致动器)(未示出)，该自动化机械运动系统(致动器)向例如自动化(即，机器人)液体操作系统158提供xyz轴运动控制，该自动化液体操作系统158包括例如空气置换移液器132，这允许多个模块之间的细胞处理而无人工干预。在一些自动化多模块细胞处理仪器中，空气置换移液器132由机架102移动，并且各种模块和试剂匣保持静止；然而，在其他实施方案中，液体操作系统158可以保持静止而各种模块和试剂匣移动。自动化多模块细胞处理仪器100中还包括试剂匣110，试剂匣110包括储库112和编辑机构引入模块130(例如，结合图4a-图4d详细描述的流通式电穿孔装置)，以及洗涤储库106、细胞输入储库151和细胞输出储库153。洗涤储库106可以被配置成容纳大的管，例如洗涤溶液，或者在整个迭代过程中通常使用的溶液。尽管在图1a中，两个试剂匣110包括洗涤储库106，但是洗涤储库也可以被包括在洗涤匣中，其中试剂匣和洗涤匣是单独的匣。在这样的情况下，除了插入其中的消耗品(包含在各种插入件中的试剂或其他组分)之外，试剂匣110和洗涤匣104可以是相同的。注意，示例性试剂匣在图5a和图5b中图示。[0133]在一些实施方式中，试剂匣110是用于在自动化多模块细胞处理/编辑仪器100中使用的包含试剂和细胞的一次性套件。例如，在启动细胞处理前，使用者可以在自动化多模块细胞编辑仪器100的机箱(chassis)内打开和定位每个包含各种期望的插入件和试剂的试剂匣110。此外，每个试剂匣110可以插入机箱中的容器(receptacle)中，该容器具有适合于容纳在其中的试剂的不同温度区。[0134]图1a中还图示了机器人液体操作系统158，包括机架102和空气置换移液器132。在一些实例中，机器人操作系统158可以包括自动化液体操作系统，诸如由mannedorf,switzerland的tecangroupltd.、reno,nv的hamiltoncompany(参见，例如，wo2018015544a1)或fortcollins,co.的beckmancoulter,inc.(参见，例如，us20160018427a1)制造的那些。移液器吸头可以在移液转移吸头供应装置(未示出)中提供，用于与空气置换移液器132一起使用。[0135]在一些实施方式中，试剂匣110的插入件或部件标记有机器可读标记(未示出)，诸如条形码，用于由机器人操作系统158识别。例如，机器人液体操作系统158可以扫描每个试剂匣110内的一个或更多个插入件以确认内容物。在其他实施方式中，机器可读标记可以标记在每个试剂匣110上，并且自动化多模块细胞编辑仪器100的处理系统(未示出，但参见图1b的元件137)可以基于机器可读标记鉴定储存材料地图。在图1a中图示的实施方案中，细胞生长模块包括细胞生长瓶118(下文结合图2a-图2d进行了更详细地描述)。另外看到的是tff模块122(下文结合图3a-图3l进行了详细描述)。另外看到的是富集模块140。还应注意三个散热器155的放置。[0136]图1b是图1a中描绘的示例性多模块细胞处理仪器100的内容物的简化展示。例如，基于匣的源材料(诸如在试剂匣110中)可以被定位于仪器100的平台(deck)上的指定区域中，以供空气置换移液器132获取(access)。多模块细胞处理仪器100的平台可以包括保护槽，使得从仪器100的任何模块溢出(spilling)、滴落或溢流(overflowing)的污染物容纳在保护槽的边缘(lip)内。还看到试剂匣110，其显示为设置有热组件111，热组件111可以创建适合不同区域的温度区。注意，试剂匣之一还包括流通式电穿孔装置130(ftep)，由ftep接口(例如歧管臂)和致动器131供应。还看到具有与热组件125相邻的tff模块122，其中tff模块由tff接口(例如歧管臂)和致动器133供应。热组件125、135和145包含热电装置，诸如peltier装置，以及散热器、风扇和冷却器。旋转生长瓶118、120在生长模块134内，其中生长模块由两个热组件135供应。在140处看到富集模块，其中富集模块由选择接口(例如，歧管臂)和致动器147供应。在该视图中还看到触摸屏显示器101、显示器致动器103、照明105(多模块细胞处理仪器100两侧各一个)和照相机139(多模块细胞处理仪器100两侧各一个照明装置)。最后，元件137包括电子器件，诸如电路控制板、高压放大器、电源和电源输入；以及气动器件(pneumatics)，诸如泵、阀和传感器。[0137]图1c图示了用作自动化多模块细胞编辑仪器100的桌面版本的多模块细胞处理仪器100的前透视图(门开着)。例如，机箱190可以具有约24-48英寸的宽度、约24-48英寸的高度和约24-48英寸的深度。机箱190可以并且优选地被设计成容纳自动化细胞处理中使用的所有模块和一次性供应装置，并且在没有人工干预的情况下执行所需的所有过程；即，机箱190被配置成提供集成的、独立的自动化多模块细胞处理仪器。如图1c中图示的，机箱190包括触摸屏显示器101、冷却格栅164，冷却格栅164允许空气经由内部风扇(未示出)流动。触摸屏显示器向使用者提供关于自动化多模块细胞编辑仪器100的处理状态的信息，并接受来自使用者的输入用于进行细胞处理。在该实施方案中，机箱190由可调节的支脚170a、170b、170c和170d提升(支脚170a-170c在该图1c中示出)。例如，可调节的支脚170a-170d允许在机箱290下方的另外的气流。[0138]在一些实施方式中，机箱190内部是结合图1a和图1b描述的大部分或所有部件，包括沿着机架设置的机器人液体操作系统，包括流通式电穿孔装置的试剂匣110，细胞生长模块134中的旋转生长瓶118、120，切向流过滤模块122，富集模块140以及用于各种模块的接口和致动器。此外，机箱190容纳控制电路、液体操作管、气泵控制器、阀、传感器、热组件(例如，加热和冷却单元)和其他控制机构。关于多模块细胞编辑仪器的实例，参见2019年4月9日颁发的uspn10,253,316；2019年6月25日颁发的uspn10,329,559；2019年6月18日颁发的uspn10,323,242；2019年9月24日颁发的uspn10,421,959；2019年11月5日颁发的uspn10,465,185；以及2019年5月14日提交的ussn16/412,195；2019年9月14日提交的ussn16/571,091；和2019年10月29日提交的ussn16/666,964，出于所有目的将所有这些通过引用以其整体并入本文。[0139]旋转细胞生长模块[0140]图2a示出了用于与本文描述的细胞生长装置一起使用的旋转生长瓶200的一种实施方案，该细胞生长装置被配置成使各种细胞类型，包括微生物和哺乳动物细胞系以及原代或产生的干细胞(例如，诱导多能干细胞、造血干细胞、胚胎干细胞等)生长。旋转生长瓶是光学透明的容器，具有用于接收液体培养基和细胞的开口端204、限定用于使细胞生长的主容器的中心瓶区206、限定至少一个光路210的锥形至收缩区(tapered-to-constrictedregion)218、封闭端216和驱动接合机构212。旋转生长瓶具有中心纵轴220，瓶围绕该中心纵轴220旋转，并且光路210通常垂直于瓶的纵轴。第一光路210被定位于锥形至收缩区218的下收缩部分。任选地，旋转生长瓶200的一些实施方案在锥形至收缩区218的锥形区中具有第二光路208。该实施方案中的两个光路都被定位于旋转生长瓶中不断地填充有细胞培养物(细胞+生长培养基)并且不受生长瓶旋转速度影响的区。第一光路210比第二光路208短，允许在瓶中细胞培养物的od值处于高水平时(例如，在细胞生长过程的较后期)od值的灵敏测量，而第二光路208允许在瓶中细胞培养物的od值处于低水平时(例如，在细胞生长过程的较早期)od值的灵敏测量。还示出了边缘202，边缘202允许旋转生长瓶位于生长模块(未示出)中并且还允许使用者容易操作。[0141]在旋转生长瓶的一些配置中，旋转生长瓶具有设置在旋转生长瓶内、从旋转生长瓶的内壁朝向中心瓶区的中心延伸的两个或更多个“桨”或内部特征。在一些方面，桨或特征的宽度随着旋转生长瓶的尺寸或体积而变化，并且范围可以为旋转生长瓶直径的1/20至刚好大于1/3、或旋转生长瓶直径的1/15至1/4、或旋转生长瓶直径的1/10到1/5。在一些方面，桨的长度随着旋转生长瓶的尺寸或体积而变化，并且范围可以为旋转生长瓶主体长度的4/5至1/4、或旋转生长瓶主体长度的3/4至1/3、或旋转生长瓶主体长度的1/2至1/3。在其他方面，可以有在水平或垂直布置的旋转生长瓶的主体的内表面上设置的凸起特征同心行；并且在其他方面，可以在旋转生长瓶的主体的内表面上设置凸起特征螺旋配置。在替代方面，凸起特征同心行或螺旋配置可以被设置在旋转生长瓶的柱(post)或中心结构上。尽管以上描述了具有两个桨，但是旋转生长瓶可以包括3个、4个、5个、6个或更多桨，以及多达20个桨。桨数取决于例如旋转生长瓶的尺寸或体积。桨可以对称地布置为从瓶的内壁延伸到瓶的内部的单个桨，或者桨可以对称地布置成以一组2个、3个、4个或更多个桨的组(例如，一对桨与另一对桨相对)从瓶的内壁延伸到瓶的内部。在另一种实施方案中，桨可以从旋转生长瓶的中部向外朝向旋转生长瓶的壁延伸，例如从旋转生长瓶内部的柱或其他支持结构延伸。[0142]驱动接合机构212与马达(未示出)接合以使瓶旋转。在一些实施方案中，马达驱动驱动接合机构212，使得旋转生长瓶仅在一个方向上旋转，并且在其他实施方案中，旋转生长瓶在第一方向上旋转第一时间量或周期性，在第二方向(即，相对方向)上旋转第二时间量或周期性，并且该过程可以重复，使得旋转生长瓶(和细胞培养物内容物)经历振荡运动。第一时间量和第二时间量可以相同或可以不同。时间量可以是1秒、2秒、3秒、4秒、5秒或更多秒，或者可以是1分钟、2分钟、3分钟、4分钟或更多分钟。在另一种实施方案中，旋转生长瓶可以在细胞生长的早期阶段以第一周期性(例如，每60秒)振荡，并且旋转生长瓶可以然后在细胞生长的后期阶段以与第一周期性不同的第二周期性(例如，每一秒)振荡。[0143]旋转生长瓶200可以为特定细胞类型的生长专门定制。例如，可以专门监测或控制o2和/或co2，并且可以设计旋转生长瓶并修改od测量，以与用于贴壁细胞生长的特定载体底物(substrate)的使用兼容。[0144]旋转生长瓶200可以是可重复使用的，或者优选地，旋转生长瓶是可消耗的。在一些实施方案中，旋转生长瓶是可消耗的，并预先填充有生长培养基地提供至使用者，其中瓶在开口端204处用箔密封件密封。以这样的方式包装的填充培养基的旋转生长瓶可以是用于与独立细胞生长装置或与作为自动化多模块细胞处理仪器一部分的细胞生长模块一起使用的套件的一部分。为了将细胞引入到瓶中，使用者仅需要移液出期望体积的细胞，并且使用移液吸头刺穿瓶的箔密封件。开口端204可以任选地包括延伸边缘202，以与细胞生长装置(未示出)重叠并接合。在自动化系统中，旋转生长瓶200可以用条形码或其他标识手段加标签，该条形码或其他标识手段可以被作为自动化系统的一部分的扫描仪或照相机(未示出)读取。[0145]旋转生长瓶200的体积和细胞培养物(包括生长培养基)的体积可以有很大变化，但是旋转生长瓶200的体积必须足够大，以使生长瓶中的细胞培养物在瓶旋转时获得适当通气。在实践中，旋转生长瓶200的体积范围可以为1-250ml、2-100ml、5-80ml、10-50ml或12-35ml。同样，细胞培养物(细胞+生长培养基)的体积应适当，以允许旋转生长瓶中适当通气。因此，细胞培养物的体积应是生长瓶体积的约10％-85％或生长瓶体积的20％-60％。例如，对于35ml的生长瓶，细胞培养物的体积会是约4ml至约27ml或7ml至约21ml。[0146]旋转生长瓶200优选由生物相容的光学透明材料制成，或者包括一条或更多条光路的瓶的至少一部分是透明的。此外，制造旋转生长瓶的材料应能够冷却至约4℃或更低，以及加热至约55℃或更高，以适应基于温度的细胞测定和在低温的长期储存二者。此外，用于制造瓶的材料必须能够承受高达55℃的温度，而在旋转时不会变形。合适的材料包括玻璃、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)、聚砜、聚氨酯，以及这些和其他聚合物的共聚物。优选的材料包括聚丙烯、聚碳酸酯或聚苯乙烯。在一些实施方案中，旋转生长瓶通过例如注射成型或挤压低成本地制造。[0147]图2b-图2d示出了包括旋转生长瓶200的细胞生长模块250的实施方案。图2b是细胞生长装置250的一种实施方案的透视图。图2c描绘了来自图2b的细胞生长装置250的剖视图。在两幅图中，看到旋转生长瓶200被定位于主壳体226内，其中旋转生长瓶200的延伸边缘202在主壳体226上方延伸。另外，两幅图中都示出了端壳体222、下壳体232和凸缘224。凸缘224用于将细胞生长装置附接至加热/冷却装置或其他结构(未示出)。图2c描绘了另外的细节。在图2c中，上轴承242和下轴承230被示出定位于主壳体226中。上轴承242和下轴承230支持旋转生长瓶200的垂直装载。下壳体232容纳驱动马达236。图2c的细胞生长装置包括两条光路：第一光路234和第二光路230。光路234对应于定位于旋转生长瓶的锥形至收缩部分的收缩部分中的光路210，并且光路230对应于旋转生长瓶的锥形至收缩部分的锥形部分中的光路208。光路210和光路208未在图2c中示出，但是可见于例如图2a中。除了光路234和230之外，还存在照亮光路的发射板228，以及在光穿过旋转生长瓶中的细胞培养液后检测光的检测器板246。[0148]在一些实施方案中，用于使旋转生长瓶200旋转的马达236是具有内置驱动控制器的无刷dc型驱动马达，所述内置驱动控制器可以被设置为保持0rpm和约3000rpm之间的恒定每分钟转数(rpm)。可选地，可以使用其他马达类型，诸如步进(stepper)、伺服(servo)、刷式dc等。任选地，马达206还可以具有允许旋转方向反转的方向控制以及感测和报告实际rpm的转速计。马达由处理器(未示出)根据例如被编程到处理器中的标准方案和/或使用者输入进行控制，并且马达可以被配置成改变rpm以引起细胞培养物的轴向进动，从而增强混合，例如以防止细胞团聚、增加通气和优化细胞呼吸。[0149]细胞生长装置250的主壳体226、端壳体222和下壳体232可以由任何合适的稳健材料制成，包括铝、不锈钢和其他导热材料，包括塑料。这些结构或其部分可以通过各种技术，例如金属制造、注射成型、产生熔合的结构层等产生。尽管在一些实施方案中设想旋转生长瓶是可重复使用的，但是优选地是可消耗的，细胞生长装置250的其他部件优选地是可重复使用的，并且可以发挥作为独立台式装置或如此处作为多模块细胞处理系统中的模块的功能。[0150]细胞生长系统的处理器(未示出)可以被编程为具有待用作生长细胞培养物的“空白”或对照的信息。“空白”或对照是仅包含细胞生长培养基的容器，产生100％的透射率和0od，而细胞样品会将光线偏转并且会具有较低的透射率百分比和较高的od。随着细胞在培养基中生长并且变得更稠密，透射率会降低并且od会增加。细胞生长系统的处理器可以被编程为使用与哺乳动物细胞培养中通常使用的生长培养基相称的空白的波长值。可选地，第二分光光度计和容器可以包括在细胞生长系统中，其中第二分光光度计用于以指定的间隔读取空白。[0151]图2d图示了作为组件的一部分的细胞生长装置，包括与光源290、检测器292和热部件294耦合的图2b的细胞生长装置。将旋转生长瓶200插入细胞生长装置中。光源290和检测器292的部件(例如，诸如，具有覆盖5-log的增益控制的光电二极管)与细胞生长装置的主壳体耦合。图示了容纳使旋转生长瓶旋转的马达的下壳体232，以及将细胞生长装置固定至组件的凸缘224之一。还图示了peltier装置或热电冷却器294。在该实施方案中，热控制通过经由下壳体232的基部上的凸缘204将细胞生长装置200附接至热装置294并与热装置294电一体化来实现。热电冷却器能够将热量“泵”至接合处(junction)的任一侧，根据电流的方向冷却表面或加热表面。在一种实施方案中，使用热敏电阻测量主壳体的温度，并且然后通过标准的电子比例积分微分(pid)控制器回路，将旋转生长瓶200控制在约+/-0.5℃。[0152]在某些实施方案中，安装在后部的电源输入模块包含安全性保险丝和通断开关(on-offswitch)，该通断开关当接通电源时，为内部ac和dc供电器(未示出)供电，启动处理器。使用600nm发光二极管(led)(未示出)以编程的时间间隔完成光密度(od)的测量，该发光二极管(led)已经通过光学器件(optic)成列布置(columnated)到包含感兴趣的细胞的旋转生长瓶的下收缩部分中。光继续通过收集光学器件到达检测系统，该检测系统由(数字)增益控制硅光电二极管组成。通常，光密度通常显示为光衰减器的功率传输因子(powertransmissionfactor)的以10为底数的对数的绝对值：od＝-log10(断电/通电)。由于od是光学衰减的度量，即吸收、散射和反射的总和，细胞生长装置od测量记录了总的功率传输，因此随着细胞生长和群体变得稠密，od(信号损失)也会增加。od系统针对od标准进行预校准，这些值存储在可由测量程序访问的板载存储器中。[0153]在使用时，通过刺穿箔密封件，将细胞接种(细胞可以从例如自动化液体操作系统或由使用者移出)到旋转生长瓶的预填充生长培养基中。细胞生长装置的编程软件设置用于生长的控制温度，通常为30℃，然后缓慢启动旋转生长瓶的旋转。细胞/生长培养基混合物由于离心力缓慢垂直向上移动至壁，允许旋转生长瓶将混合物的大表面面积暴露于正常的氧气环境。生长监测系统以预设或预编程的时间间隔采取连续读取od或od测量。这些测量值存储在内部存储器中，并且如果需要，软件将测量值对比时间绘图，以展示生长曲线。如果需要增强混合，例如为了优化生长条件，可以改变瓶旋转的速度以引起液体的轴向进动，和/或可以以编程的间隔进行完全的方向改变。可以对生长监控编程，以在预先确定的od时自动终止生长阶段，并且然后将混合物快速冷却至较低温度，以抑制进一步生长。[0154]细胞生长装置250的一个应用是不断地测量生长细胞培养物的光密度。所描述的细胞生长装置的一个优点是光密度可以连续测量(动力学监测)或以特定时间间隔测量；例如每5秒、10秒、15秒、20秒、30秒、45秒或60秒，或者每1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或10分钟。虽然已经在测量生长细胞培养物的光密度(od)的上下文中描述了细胞生长装置，然而鉴于本说明书的教导，本领域技术人员应理解，除了细胞培养物od之外或者代替细胞培养物od，可以测量其他细胞生长参数。例如，使用可见光、uv或近红外光(nir)的光谱学允许监测细胞培养物中营养物和/或废弃物的浓度。另外，可以使用光谱测量来同时定量多种化学物质。不对称的化学物质可以通过鉴定nir中的特征性吸收特征来定量。相比之下，对称的化学物质可以容易地使用拉曼光谱学定量。许多关键代谢物，诸如葡萄糖、谷氨酰胺、氨和乳酸，具有不同的ir中的光谱特征，使得它们可以被容易地定量。样品吸收的光的量和频率可以与样品中存在的化学物质的类型和浓度相关。这些测量类型中的每一种都提供特定的优点。ft-nir提供最大的光穿透深度，并且可以用于较厚的样品。ft-mid-ir(mir)提供了可更容易地辨别为对某些分析物有特异性的信息，因为这些波长更接近基本ir吸收。当由水引起的干扰被最小化时，ft-拉曼是有利的。其他光谱特性可以经由例如介电阻抗谱学、可见荧光、荧光偏振或发光来测量。另外，细胞生长装置可以包括用于测量例如溶解氧、二氧化碳、ph、电导率等的另外的传感器。[0155]细胞浓缩模块[0156]图3a-图3k描绘了细胞浓缩/缓冲液交换盒和利用切向流过滤并被配置用于所有细胞类型(包括永生化细胞系、原代细胞和/或干细胞)的模块的一种实施方案的变化形式。本文描述的细胞浓缩装置的一种实施方案使用切向流过滤(tff)进行操作，切向流过滤(tff)也称为错流过滤(crossflowfiltration)，其中大部分进料切向流过过滤器表面，从而与进料流入过滤器的死端过滤(dead-endfiltration)相比，降低滤饼(渗余物)的形成。还利用相对于主进料的二次流动来产生剪切力，以防止滤饼形成和膜结垢，从而使颗粒回收最大化，如下文描述的。[0157]本文描述的tff装置被设计成考虑两个主要的设计因素。首先，tff装置的几何形状导致在大的表面积上过滤细胞培养物，以使处理时间最小化。第二，tff装置的设计被配置成使过滤器结垢最小化。图3a是切向流过滤的一般模型。tff装置使用也称为错流过滤的切向流过滤进行操作。图3a示出了具有膜394上流动的细胞的系统390，其中培养基或缓冲液中的细胞392的进料流平行于膜394。tff不同于死端过滤，在死端过滤中，进料流和压降二者均垂直于膜或过滤器。[0158]图3b描绘了提供切向流过滤的tff装置/模块的一种实施方案的下部构件的俯视图。如在图3b的tff装置的实施方案中可以看到的，tff装置300包括通道结构316，该通道结构316包括细胞培养物流经的流动通道302b。通道结构316包括由膜(未示出)进行水平分叉的单个流动通道302b，缓冲液或培养基可以流过该膜，但是细胞不能流过该膜。该特定实施方案包括波状蛇形几何形状314(即，流动通道302中的小“摆动(wiggle)”)和蛇形“z字形(zig-zag)”图案，其中流动通道302与装置从装置左侧的一端交叉到装置右侧的另一端。蛇形图案允许在相对于装置尺寸和总通道体积的高表面面积上过滤，而波状作用产生二次惯性流，以实现有效的膜再生，防止膜结垢。虽然此处例示了波状几何形状和蛇形图案，但是也可以使用其他的通道形状，条件是该通道可以被膜分叉，并且条件是该通道配置提供在交替方向上通过tff模块的流动。除了流动通道302b，可以看到作为通道结构316的一部分的端口(portal)304和306，以及凹陷308。端口304在膜(未示出)的一侧收集通过通道的细胞(“渗余物”)，并且端口306在膜(未示出)的相对侧收集通过通道的培养基(“滤液”或“渗透物”)。在该实施方案中，凹陷308容纳允许tff装置的部件彼此固定的螺栓或其他紧固件(未示出)。[0159]通道结构316的长度310和宽度312可以根据待生长的细胞培养物的体积和待浓缩的细胞培养物的光密度而变化。通道结构316的长度310通常为1mm至300mm，或50mm至250mm，或60mm至200mm，或70mm至150mm，或80mm至100mm。通道结构316的宽度通常为1mm至120mm，或20mm至100mm，或30mm至80mm，或40mm至70mm，或50mm至60mm。流动通道102的截面形状可以是圆形、椭圆形、卵形、方形、矩形、梯形或不规则的。如果是方形、矩形或另一种具有大体上直边的形状，则截面可以是约10μm至1000μm宽，或200μm至800μm宽，或300μm至700μm宽，或400μm至600μm宽；和约10μm至1000μm高，或200μm至800μm高，或300μm至700μm高，或400μm至600μm高。如果流动通道302的截面大体上是圆形、卵形或椭圆形的，则通道的半径可以是按水力半径约50μm至1000μm，或者按水力半径5μm至800μm，或者按水力半径200μm至700μm，或者按水力半径300μm至600μm宽，或者按水力半径约200μm至500μm。[0160]当观察图3b的tff装置/模块的俯视图时，注意存在两个渗余物端口304和两个滤液端口306，其中在装置300的两端(例如，窄边)处各存在一个类型的端口。在其他实施方案中，渗余物端口和滤液端口可以在同一构件(例如，上部构件或下部构件)的同一表面上，或者它们可以布置在组件的侧表面上。与其他连续操作的tff装置不同，本文描述的tff装置/模块使用交替的方法来浓缩细胞。用于使用tff装置/模块的细胞浓缩的总体工作流程涉及使细胞培养物或细胞样品切向流过通道结构。将流动通道分叉的膜将细胞保留在膜的一侧，并且允许不需要的培养基或缓冲液流动跨过膜进入装置的滤液侧(例如，下部构件320)。在该过程中，培养基或缓冲液中的固定体积的细胞被驱动通过装置，直至细胞样品被收集到一个渗余物端口304中，并且已经通过膜的培养基/缓冲液通过一个或两个滤液端口306收集。所有类型的原核细胞和真核细胞(黏附细胞和非黏附细胞二者)均可以在tff装置中生长。黏附细胞可以在悬浮在流过tff装置的培养基中的珠或其他细胞支架上生长。[0161]在细胞浓缩过程中，使细胞样品通过tff装置并在一个渗余物端口304中收集细胞，同时在一个滤液端口306中收集培养基，这被认为是细胞样品的“一次通过”。渗余物储库之间的转移“翻转”了培养物。对于给定的通过，分别收集细胞和培养基的渗余物端口和滤液端口驻留于tff装置/模块300的同一端，流体连接被布置成使得渗余物和滤液侧存在两个不同的流动层，但是如果渗余物端口304驻留于装置/模块300的上部构件上(即，细胞被驱动通过膜上方的通道，并且滤液(培养基)通过膜下方的通道部分)，则滤液端口306会驻留于装置/模块100的下部构件上，并且反之亦然(即，如果细胞样品被驱动通过膜下方的通道，则滤液(培养基)通过膜上方的通道部分)。在图3c-图3d中可以更清楚地看到这种配置，其中渗余物从渗余物端口304流出360，并且滤液从滤液端口306流出370。[0162]在生长浓缩过程的“通过”结束时，细胞样品通过渗余物端口304并进入渗余物储库(未示出)而被收集。为了启动另一次“通过”，细胞样品再次通过tff装置，这次的流动方向与第一次通过相反。细胞样品通过渗余物端口304并进入渗余物储库(未示出)而被收集，该渗余物储库位于装置/模块与渗余物端口304相对的一端上，渗余物端口304在第一次通过期间用于收集细胞。同样地，在第二次通过时通过膜的培养基/缓冲液通过滤液端口306或通过两个端口收集，所述滤液端口306位于装置/模块与滤液端口306相对的一端上，所述滤液端口306在第一次通过期间用于收集滤液。重复使渗余物(浓缩的细胞样品)通过装置/模块的这种交替过程，直至细胞已经浓缩至期望的体积，并且两个滤液端口均可以在通过期间打开以减少操作时间。此外，缓冲液交换可以通过以下实现：将期望的缓冲液(或新鲜培养基)添加至渗余物储库中的细胞样品，然后启动另一次“通过”，并且重复该过程，直至旧的培养基或缓冲液被稀释并过滤掉并且细胞驻留在新鲜培养基或缓冲液中。注意，缓冲液交换和细胞浓缩可以(并且通常确实)同时发生。[0163]图3c描绘了示例性tff模块的上部构件(322)和下部构件(320)的俯视图。同样，看到的是端口304和端口306。如上文说明的，凹陷(诸如在图3b中看到的凹陷308)提供在操作期间经由例如螺栓或其他类似紧固件将tff装置/膜的部件(上部构件322、下部构件320和膜324)彼此固定的手段。然而，在替代实施方案中，粘合剂诸如压敏粘合剂，或超声波焊接，或溶剂粘接(solventbonding)，可以用于将上部构件322、下部构件320和膜324耦合在一起。事实上，鉴于本公开内容的指导，本领域普通技术人员可以找到用于耦合tff装置的部件的其他配置，诸如，例如夹具(clamp)；设置在上部构件和下部构件上的配合配件；粘合剂、焊接、溶剂粘接和配合配件的组合；以及其他这样的紧固件和耦合件(coupling)。[0164]注意，在tff装置/模块的每一“端”(例如，窄边)存在一个渗余物端口和一个滤液端口。装置/模块左侧的渗余物端口和滤液端口会分别收集同一次通过的细胞(在360处的流动路径)和培养基(在370处的流动路径)。同样，装置/模块右侧的渗余物端口和滤液端口会分别收集同一次通过的细胞(在360处的流动路径)和培养基(在370处的流动路径)。在该实施方案中，渗余物从tff装置的顶表面上的端口304收集，并且滤液从装置底表面上的端口306收集。将细胞维持在膜324上方的tff流动通道中，而滤液(培养基)流过膜324并且然后流过端口306；因此，顶端口/渗余物端口和底端口/滤液端口的配置是实用的。然而，应认识到，可以实施渗余物端口和滤液端口的其他配置，诸如使渗余物端口和滤液端口二者均定位在tff装置的侧面(与顶表面和底表面相对)。在图3c中，可以看到在tff装置300的下部构件320上的通道结构302b。然而，在其他实施方案中，渗余物端口和滤液端口可以驻留于tff装置的同一端上。[0165]在图3c中还看到膜或过滤器324。适用于tff装置/模块的过滤器或膜是耐溶剂的、在过滤期间无污染并且能够保留感兴趣细胞的类型和尺寸的那些。例如，孔径可以最低为0.2μm，然而对于其他细胞类型，孔径可以最高为5μm。事实上，可用于tff装置/模块的孔径包括具有0.20μm、0.21μm、0.22μm、0.23μm、0.24μm、0.25μm、0.26μm、0.27μm、0.28μm、0.29μm、0.30μm、0.31μm、0.32μm、0.33μm、0.34μm、0.35μm、0.36μm、0.37μm、0.38μm、0.39μm、0.40μm、0.41μm、0.42μm、0.43μm、0.44μm、0.45μm、0.46μm、0.47μm、0.48μm、0.49μm、0.50μm和更大尺寸的过滤器。过滤器可以由任何合适的非反应性材料制成，包括纤维素混合酯(硝酸纤维素和乙酸纤维素)(cme)、聚碳酸酯(pc)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚醚砜(pes)、聚四氟乙烯(ptfe)、尼龙、玻璃纤维，或如在激光或电化学蚀刻的情况下的金属基材。图3c和图3d中示出的tff装置没有示出过滤器324可以安置或固定的上部构件312和下部构件320中的座(例如，上部构件312和下部构件320各自中的过滤器的一半厚度的座)；然而，在一些实施方案中设想了这样的座。[0166]图3d描绘了图3c中示出的示例性tff模块的上部构件和下部构件的仰视图。图3d描绘了示例性tff模块的上部构件(322)和下部构件(320)的仰视图。同样，看到端口304和端口306。同样注意，在装置/模块的每一端存在一个渗余物端口和一个滤液端口。装置/模块左侧的渗余物端口和滤液端口会分别收集同一次通过的细胞(在360处的流动路径)和培养基(在370处的流动路径)。同样，装置/模块右侧的渗余物端口和滤液端口会分别收集同一次通过的细胞(在360处的流动路径)和培养基(在370处的流动路径)。在图3d中，可以看到在tff装置300的上部构件322上的通道结构302a。因此，观察图3c和图3d，注意在上部构件和下部构件二者中均存在通道结构302(302a和302b)，在通道结构的上部分和下部分之间存在膜324。上部构件322和下部构件320的通道结构302(分别为302a和302b)配合产生流动通道，膜324水平定位于流动通道的上部构件和下部构件之间，从而使流动通道分叉。[0167]培养基交换(在细胞生长期间)或缓冲液交换(在细胞浓缩或使细胞成为感受态期间)在tff装置/模块上通过以下进行：将新鲜培养基添加至生长细胞，或将期望的缓冲液添加至浓缩至期望的体积的细胞；例如，在细胞被浓缩至少20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍或更多倍后。通过向渗余物储库添加或从滤液侧通过膜将期望的交换培养基或交换缓冲液添加至细胞，并且重复将细胞通过tff装置300的过程，直至细胞在交换培养基或缓冲液中生长至期望的光密度或浓缩至期望的体积。该过程可以重复任何数目的期望次数，以达到期望的缓冲液交换水平和期望的细胞体积。交换缓冲液可以包含例如甘油或山梨醇，从而除了使细胞样品的总体积降低之外，还使细胞胜任转化。[0168]可以由可以在其中磨铣通道(和通道分支)的包括以下的任何稳健材料制成：不锈钢、硅、玻璃、铝或塑料，所述塑料包括环烯烃共聚物(coc)、环烯烃聚合物(cop)、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、丙烯腈丁二烯、聚碳酸酯、聚醚醚酮(peek)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)、聚砜和聚氨酯，以及这些和其他聚合物的共聚物。如果tff装置/模块是一次性的，优选地它由塑料制成。在一些实施方案中，用于制造tff装置/模块的材料是导热的，使得细胞培养物可以被加热或冷却至期望的温度。在某些实施方案中，tff装置使用上文提及的适于这种大规模生产技术的材料通过以下形成：精密机械加工、激光加工、放电加工(用于金属装置)；湿法或干法蚀刻(用于硅装置)；干法或湿法蚀刻、粉末或喷砂、光结构化(photostructuring)(用于玻璃装置)；或热成型、注射成型、热压花、或激光加工(用于塑料装置)。[0169]图3e-图3k描绘了切向流过滤(tff)装置/模块的替代实施方案。图3e描绘了上部(渗余物)构件3022(在左侧)、膜或过滤器3024(中部)和下部(渗透物/滤液)构件3020(在右侧)的配置。在图3e-3中示出的配置中，渗余物构件3022不再是“上部”，并且渗透物/滤液构件3020不再是“下部”，因为渗余物构件3022和渗透物/滤液构件3020是如图3j和图3k中看到的侧对侧耦合的。在图3e中，渗余物构件3022包括切向流动通道3002，切向流动通道3002具有蛇形构造，该蛇形构造从渗余物构件3022的一个下角(具体地，在渗余物端口3028处)开始横穿并向上然后向下并横穿渗余物构件3022，终止于渗余物构件3022的另一个下角的第二渗余物端口3028处。在渗余物构件3022上还看到能量导向器3091，能量导向器3091围绕膜或过滤器3024安置的区域。在该实施方案中，能量导向器3091与渗透物/滤液构件3020上的能量导向器部件配合，并经由其用于促进渗余物构件3022与渗透物/滤液构件3020的超声波焊接或结合。还看到膜或过滤器3024具有渗余物端口3028的通孔，该通孔被配置成安置在渗余物构件3022和渗透物/滤液构件3020之间的能量导向器3091的周长内。除了能量导向器3091之外，渗透物/滤液构件3020还包括用于每个底角处的渗余物端口3028的通孔(其与渗余物构件3022中的膜3024的底角处的渗余物端口3028和渗余物端口3028的通孔配合)，以及位于渗透物/滤液构件3020的顶部和中心的切向流动通道3002和单个渗透物/滤液端口3026。该实施方案中的切向流动通道3002结构具有蛇形构造和波状几何形状，尽管也可以使用其他几何形状。在一些方面，切向流动通道的长度为10mm至1000mm、60mm至200mm或80mm至100mm。在一些方面，通道结构的宽度为10mm至120mm、40mm至70mm或50mm至60mm。在一些方面，切向流动通道1202的截面为矩形。在一些方面，切向流动通道1202的截面为5μm至1000μm宽和5μm至1000μm高，300μm至700μm宽和300μm至700μm高，或400μm至600μm宽和400μm至600μm高。在其他方面，切向流动通道1202的截面为圆形、椭圆形、梯形或卵形，并且水力半径为100μm至1000μm、水力半径为300μm至700μm或水力半径为400μm至600μm。[0170]图3f是储库组件3050的侧面透视图。在图3f的实施方案中，渗余物构件与储库组件分离。储库组件3050包括在单个渗透物储库3054的任一侧上的渗余物储库3052。在细胞浓缩和/或生长期间，当细胞通过细胞浓缩/生长装置或模块转移并进入渗余物储库时，渗余物储库3052用于容纳细胞和培养基。渗透液/滤液储库3054用于在细胞浓缩期间收集从细胞培养物中去除的滤液，或在细胞生长期间收集旧的缓冲液或培养基。在图3e-图3l中描绘的实施方案中，将缓冲液或培养基从与装置模块分离的试剂储库供应至渗透物/滤液构件。在图3f中另外看到容纳气动端口(看不到)的凹槽3032、渗透物/滤液端口3026和渗余物端口通孔3028。渗余物储库与渗余物端口3028流体耦合，渗余物端口3028继而与设置在渗余物构件(未示出)中的切向流动通道的一部分流体耦合。渗透物/滤液储库与渗透/滤液端口3026流体耦合，渗透物/滤液端口3026继而与设置在渗透物/滤液部件(未示出)中的切向流动通道的一部分流体耦合，其中切向流动通道的部分被膜(未示出)分叉。在包括本实施方案的实施方案中，可以生长和/或过滤多达120ml的细胞培养物，或者可以生长和/或浓缩多达100ml、90ml、80ml、70ml、60ml、50ml、40ml、30ml或20ml的细胞培养物。[0171]图3g描绘了图3f中示出的储库组件3050的俯视图，图3h描绘了图3f中示出的用于储库组件3050的盖3044，并且图3i描绘了在操作中设置在图3f中示出的储库组件3050的盖3044上的密封垫3045。图3g是储库组件3050的俯视图，示出了两个渗余物储库3052，在渗透物储库3054的一侧各一个。还看到与气动端口(未示出)配合的凹槽3032，和驻留在渗余物储库3052的底部的流体通道3034，流体通道3034经由渗透物/滤液构件3024和膜3024(也未示出)中的渗余物端口的通孔将渗余物储库3052与渗余物端口3028(未示出)流体地耦合。图3h描绘了被配置成设置在储库组件3050顶部的盖3044。盖3044在渗余物储库3052和渗透物/滤液储库3054的顶部具有圆形开孔。同样，在渗余物储库3052的底部可以看到流体通道3034，其中流体通道3034将渗余物储库3052与渗余物端口3028(未示出)流体地耦合。还示出了用于每个渗余物储库3052和渗透物/滤液储库3054的三个气动端口3030。图3i描绘了被配置成设置在储库组件3050的盖3044上的密封垫3045。看到的是用于每个渗余物储库3052和用于渗透物/滤液储库3054的三个流体传输端口3042。同样，示出了用于每个渗余物储库3052和用于渗透物/滤液储库3054的三个气动端口3030。[0172]图3j描绘了组装的tff模块3000的实施方案。注意，在tff模块的这一实施方案中，渗余物构件3022不再是“上部”，并且渗透物/滤液构件3020不再是“下部”，因为渗余物构件3022和渗透物/滤液构件3020与夹在渗余物构件3022和渗透物/滤液构件3020之间的膜3024侧对侧耦合。此外，渗余物构件3022、膜构件3024和渗透物/滤液构件3020与储库组件3050侧对侧耦合。看到两个渗余物端口3028(其将渗余物构件3022中的切向流动通道3002耦合到两个渗余物储库(未示出))，以及一个渗透物/滤液端口3026，其将渗透物/滤液构件3020中的切向流动通道3002耦合到渗透物/滤液储库(未示出)。还看到切向流动通道3002，其由渗余物构件3022和渗透物/滤液构件3020配合形成，并且膜3024夹在切向流动通道3002之间并使切向流动通道3002分叉。还看到能量导向器3091，在该图3j中，能量导向器3091用于超声焊接或耦合围绕膜3024的渗余物构件3022和渗透物/过滤构件3020。在储库组件3050的顶部可以看到盖3044，并且密封垫3045设置在盖3044上。密封垫3045分别与流体传输端口3042和气动端口3030接合并提供与它们的流体密封和气动连接。[0173]图3k在左图描绘了图3j中示出的tff模块3000的分解视图。看到以下部件：储库组件3050、待设置在储库组件3050上的盖3044、待设置在盖3044上的密封垫3045、渗余物构件3022、膜或过滤器3024、以及渗透物/滤液构件3020。还看到渗透物/滤液端口3026，其与渗透物/滤液储库3054上的渗透物/滤液端口3026配合，以及两个渗余物端口3028，其与渗余物储库3052(其中在该图3k中只能清楚地看到一个渗余物储库3052)上的渗余物端口3028配合。还看到用于膜3024和渗透物/滤液构件3020中的渗余物端口3028的通孔。图3k在左边描绘了示出长度、高度和宽度尺寸的组装的tff模块3000。组装的tff装置3000通常高度为50mm至175mm，或高度为75mm至150mm，或高度为90mm至120mm；长度为50mm至175mm，或长度为75mm至150mm，或长度为90mm至120mm；并且深度为30mm至90mm，或深度为40mm至75mm，或深度为约50mm至60mm。示例性tff装置高度为110mm，长度为120mm，并且深度为55mm。[0174]与本文描述的其他实施方案相似，图3e-图3k中描绘的tff装置或模块可以不断地测量细胞培养物生长，并且在一些方面，经由tff装置的一个或两个渗余物储库和/或流动通道中的细胞培养物的光密度(od)测量细胞培养物生长。光密度可以连续测量(动力学监测)或以特定的时间间隔(例如，每5秒、10秒、15秒、20秒、30秒、45秒或60秒，或每1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或10分钟等)测量。此外，tff模块可以调整生长参数(温度、通气)以使细胞在期望的时间处于期望的光密度。[0175]图3l是适用于图3e-图3k中描绘的tff模块的示例性气动框图。泵连接到提供正压(p)或负压(v)的两个电磁阀(sv5和sv6)。两个电磁阀sv5和sv6将泵耦合到歧管，并且两个电磁阀sv1和sv2连接到出储库(rr1和rr2)。储备中还有两个电磁阀(sv3和sv4)。存在比例阀(pv2和pv2)、流量计(fm1和fm2)和位于各个电磁阀sv1和sv2之间的压力传感器(压力传感器1和2)，将泵连接到系统并将电磁阀sv1和sv2连接到储库。压力传感器和比例阀在反馈回路中协同工作，以维持所需的压力。[0176]作为以上描述的tff模块的替代物，可以采用包括中空过滤器的细胞浓缩模块。适用于在本发明中使用的过滤器的实例包括膜过滤器、陶瓷过滤器和金属过滤器。过滤器可以以任何形状使用；过滤器例如可以是圆柱形的或者基本上是平坦的。优选地，使用的过滤器是膜过滤器，优选中空纤维过滤器。术语“中空纤维”意指管式膜。管的内径为至少0.1mm，更优选地至少0.5mm，最优选地至少0.75mm，并且管的内径优选地为至多10mm，更优选地至多6mm，最优选地至多1mm。包含中空纤维的过滤器模块可从多家公司，包括g.e.lifesciences(marlborough,ma)和innovaprep(drexel,mo)商购获得。可以在本方法和系统中使用、修改使用或改造使用的中空纤维过滤系统的具体实例包括但不限于uspn9,738,918；uspn9,593,359；uspn9,574,977；uspn9,534,989；uspn9,446,354；uspn9,295,824；uspn8,956,880；uspn8,758,623；uspn8,726,744；uspn8,677,839；uspn8,677,840；uspn8,584,536；uspn8,584,535；和uspn8,110,112。[0177]编辑机构引入模块[0178]除了用于细胞生长和细胞浓缩的模块之外，图4a-图4e描绘了用于将编辑机构引入细胞的模块的一种实施方案的变化形式。可以根据细胞类型和待引入的机构(例如，核酸或蛋白)的性质来定制引入方法。[0179]在一些方面，该模块被配置成转化哺乳动物细胞。在一些方面，可以通过常规的哺乳动物细胞转染技术将编辑盒质粒和核酸酶递送到靶细胞。实例包括脂质介导的转染、磷酸钙介导的转染、电穿孔、阳离子肽、阳离子聚合物或核转染。蛋白，诸如rna指导的核酸酶，也可以通过各种机制被递送到细胞中。例如，可以使用穿梭载体(诸如uspn9,982,267和uspn9,738,687中描述的那些，出于所有目的将这些通过引用并入本文)将rna指导的核酸酶引入哺乳动物细胞。[0180]在某些实施方案中，使用转化来引入编辑所必需的一些或全部机构。图4a是六个共同连接的流通式电穿孔装置450的透视图。图4a描绘了布置在单个基底456上的六个流通式电穿孔单元450。六个流通式电穿孔单元450各自具有限定细胞样品入口的孔452和限定细胞样品出口的孔454。在六个流通式电穿孔单元450制成后，它们可以彼此分开(例如，“断裂(snappedapart)”)并且一次使用一个，或者可选地，在实施方案中，两个或更多个流通式电穿孔单元450可以不分开地并行使用。[0181]流通式电穿孔装置实现具有低毒性的高效细胞电穿孔。本公开内容的流通式电穿孔装置允许与机器人液体操作仪器特别容易地集成，该机器人液体操作仪器通常用于自动化系统，诸如空气置换移液器。这样的自动化仪器包括但不限于来自tecan(mannedorf,switzerland)、hamilton(reno,nv)、beckmancoulter(fortcollins,co)等的现货供应的自动化液体操作系统。[0182]通常来说，与小型电穿孔装置相比，微流电穿孔(使用小于约10ml和低至1μl的细胞悬液体积)允许对转染或转化过程更精确的控制，并且允许与其他细胞处理工具灵活地集成。因此，微流电穿孔为例如单细胞转化、处理和分析；多单元电穿孔装置配置；以及集成的、自动的、多模块的细胞处理和分析提供了独特的优点。[0183]在本公开内容的流通式电穿孔装置的特定实施方案中，转化的毒性水平产生电穿孔后大于10％的存活细胞，优选地转化后大于15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或甚至95％的存活细胞，这取决于细胞类型和引入细胞的核酸。[0184]结合图4a-图4d描述的流通式电穿孔装置包括具有电穿孔室的壳体、第一电极和第二电极，第一电极和第二电极被配置成与电脉冲发生器接合，电接触通过电脉冲发生器与电穿孔装置的电极接合。在某些实施方案中，电穿孔装置是可高压灭菌的和/或一次性的，并且可以与试剂一起包装在试剂匣中。电穿孔装置可以被配置成对1μl至2ml、10μl至1ml、25μl至750μl，或50μl至500μl之间的细胞样品体积进行电穿孔。[0185]在一种示例性实施方案中，图4b描绘了流通式电穿孔装置450的俯视图，该流通式电穿孔装置450具有用于引入细胞和待电穿孔到细胞(“细胞样品”)中的外源试剂的入口402和用于电穿孔后的细胞样品的出口404。电极408通过装置中的电极通道(未示出)引入。图4c示出了来自流通式电穿孔装置450的顶部的剖视图，其中入口402、出口404和电极408相对于流动通道406中的收缩部定位。图4d中的流通式电穿孔装置450的底部的侧面剖视图图示了该实施方案中的电极408被定位于电极通道410中并且垂直于流动通道406，使得细胞样品从入口通道412通过流动通道406流到出口通道414，并且在该过程中，细胞样品流入电极通道410中以与电极408接触。在这方面，入口通道、出口通道和电极通道都源自装置的顶部平面侧；然而，图4b-图4d中描绘的流通式电穿孔结构仅是可用于本文描述的试剂匣的一种架构。另外的电极架构在例如2018年9月24日提交的ussn16/147,120；2018年9月30日提交的ussn16/147,865和2018年9月30日提交的ussn16/147,871中描述。[0186]试剂匣[0187]图5a描绘了可以在自动化多模块细胞处理仪器中使用的示例性组合的试剂匣和电穿孔装置500(“匣”)。匣500包括主体502，和试剂容器或储库504。另外，匣500包括用于将核酸和/或蛋白引入细胞的装置，例如，电穿孔装置506(其示例性实施方案结合图4a-图4d详细描述)。匣500可以是一次性的，或者可以被配置成可重复使用。优选地，匣500是一次性的。匣500可以由任何合适的材料制成，包括不锈钢、铝或塑料，所述塑料包括聚氯乙烯、环烯烃共聚物(coc)、聚乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、丙烯腈丁二烯、聚碳酸酯、聚醚醚酮(peek)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)、聚砜和聚氨酯，以及这些和其他聚合物的共聚物。如果匣是一次性的，则优选地其由塑料制成。优选地，用于制造匣的材料是导热的，因为在某些实施方案中，匣500接触加热或冷却试剂容器或储库504中的试剂的热装置(未示出)。在一些实施方案中，热装置是peltier装置或热电冷却器。试剂容器或储库504可以是如图5a中示出的其中插入单独的试剂管的容器，其中插入一个或更多个多个共同连接的管的容器，或者试剂容器可以在没有插入的管的情况下容纳试剂，试剂直接分配到容器或储库中。另外，试剂匣中的容器可以被配置用于管、共同连接的管和试剂的直接填充的任何组合。[0188]在一种实施方案中，试剂匣500的试剂容器或储库504被配置成容纳各种尺寸的管，包括例如250ml管、25ml管、10ml管、5ml管和eppendorf管或微量离心管。在又另一种实施方案中，所有容器可以被配置成容纳相同尺寸的管，例如5ml管，并且储库插入件可以用于容纳试剂储库中的较小的管。在又另一种实施方案中，特别是在试剂匣是一次性的实施方案中，试剂储库在没有插入的管的情况下容纳试剂。在该一次性实施方案中，试剂匣可以是套件的一部分，其中试剂匣预先填充有试剂，并且容器或储库用例如箔、热封丙烯酸树脂等密封，并呈现给消费者，然后试剂匣可以在自动化多模块细胞处理仪器中使用。包含在试剂匣中的试剂将根据工作流程而变化；也就是说，试剂将根据细胞在自动化多模块细胞处理仪器中所经历的过程而变化。[0189]图5b描绘了包含在图5a的试剂匣中的试剂的示例性矩阵配置140；其中该矩阵实施方案是4×4试剂矩阵。通过矩阵配置，使用者(或编程的处理器)可以为给定的过程定位合适的试剂。也就是说，试剂，诸如细胞样品、酶、缓冲液、核酸载体、表达盒、反应组分(诸如例如，mgcl2、dntp、等温核酸组装试剂、缺口修复试剂等)、洗涤溶液、乙醇和用于核酸纯化和分离的磁珠等，位于矩阵540中已知的位置。例如，试剂位于位置a1(510)、位置a2(511)、位置a3(512)、位置a4(513)、位置b1(514)、位置b2(515)等，在本实施方案中，直至位置d4(525)。图5a被标记以示出几个储库504对应于矩阵540的位置：参见容器510、513、521和525。尽管图5a的试剂匣500和图5b的矩阵配置540示出了4×4矩阵，但试剂匣和电穿孔装置的矩阵可以是任何配置，例如2×2、2×3、2×4、2×5、2×6、3×3、3×5、4×6、6×7，或包括非对称配置的任何其他配置，或取决于预期工作流程所需试剂的两个或更多个不同的矩阵。注意，在图4a中，矩阵配置是5×3+1矩阵。[0190]在图5a中示出的试剂匣500的优选实施方案中，试剂匣包括可由处理器(未示出)读取的脚本(未示出)，用于经由液体操作装置(未示出)分配试剂，并控制包含在试剂匣500内的电穿孔装置。此外，作为自动化多模块细胞处理仪器中的一个部件的试剂匣500可以包括指定由自动化多模块细胞处理仪器执行的两个、三个、四个、五个、十个或更多个过程或者甚至指定由自动化多模块细胞处理仪器执行的所有过程的脚本。在某些实施方案中，试剂匣是一次性的，并且预包装有定制为执行特定细胞处理方案(例如，基因组编辑或蛋白产生)的试剂。因为试剂匣内容物不同，而自动化多模块细胞处理仪器的部件可以不变，所以与特定试剂匣相关联的脚本与所使用的试剂和所执行的细胞处理相匹配。因此，例如，试剂匣可以预包装有用于基因组编辑的试剂和指定用于在自动化多模块细胞处理仪器(诸如结合图1a-图1d描述的)中执行基因组编辑的处理步骤的脚本。例如，试剂匣可以包括用于以下的脚本：从储库a2(511)移液电感受态的细胞，将细胞转移到电穿孔装置506，从储库c3(520)移液含有编辑载体的核酸溶液，将核酸溶液转移到电穿孔装置，启动电穿孔过程一段指定时间，然后将被穿孔的细胞移动到试剂匣中的储库d4(525)，或者移动到另一个模块诸如在图1a的自动化多模块细胞处理仪器中的旋转生长瓶(图1a中的118或120)。在另一种实例中，试剂匣可以包括用于以下的脚本：将包含载体的核酸溶液从储库c3(520)、储库c4(521)中包含编辑寡核苷酸盒的核酸溶液和等温核酸组装反应混合物从a1(510)移液转移到等温核酸组装/脱盐储库(图4a中的414)。脚本还可以指定由自动化多模块细胞处理仪器中的其他模块执行的过程步骤。例如，脚本可以指定，将等温核酸组装/脱盐模块加热到50℃30分钟，以产生组装的等温核酸产物；和经由基于磁珠的核酸纯化(所述核酸纯化涉及一系列移液转移)对组装的等温核酸产物进行脱盐，以及将储库b2(515)中的磁珠、储库b3(516)中的乙醇洗液和储库c1(518)中的水混合到等温核酸组装/脱盐储库(图1a中的114)。[0191]富集模块[0192]本公开内容还包括具有富集模块的自动化多模块细胞编辑仪器，该富集模块执行富集方法，包括本文描述的富集方法，以增加细胞(例如，哺乳动物细胞)群体中的总编辑效率。[0193]如阅读本公开内容后对本领域技术人员将明显的，富集模块可以被设计成适应特定的富集方法，并且优选地(但不要求)被连接到多模块仪器的其余模块，例如，经由自动化液体操作系统或其他细胞转移装置。[0194]在某些实施方案中，富集模块可以是在仪器外使用的模块，其中所得的富集的细胞群体被引入回集成仪器，或者可选地被引入到完成编辑和恢复周期的辅助仪器。在这样的情况下，富集模块独立于自动化多模块仪器作用，但包括在总体工作流程中。因此，工作流程可能需要协调负责工作流程的不同部分的两个或更多个处理器。[0195]在一些实施方案中，富集模块与自动化多模块仪器流体连通，并与液体操作系统集成并由单个处理器控制。[0196]在一些模块中，富集是富集含有引入的选择性标志物的细胞的正富集模块。在一些方面，富集是基于缺少选择性标志物或由于所使用的特定富集方法而不存在特征而消耗细胞的负选择，例如，抗生素选择。[0197]在本公开内容的一些方面，选择过程可以计算地进行，并且选择性标志物的表达可以被监测和用于未来的数据分析，以确定细胞群体的编辑率。[0198]可以用于本公开内容的方法的某些选择方法提供荧光或生物发光选择作为正确编辑的细胞的读取。可以经由诸如荧光激活细胞分选(facs)和磁激活细胞分选(macs)的方法从未编辑或不正确编辑的细胞中分选正确编辑的细胞，并且用于进行这样的选择的模块可以并入自动化多模块细胞处理仪器(参见例如，图1a的140)。使用facs或macs，可以基于因存在用于引入选择方法和靶区的预期编辑的编辑机构引起的已经表达的表达标志物，将活细胞的异质性混合物分选为不同的群体。[0199]facs可以基于细胞内部染色或细胞内蛋白表达来分离细胞，并允许基于大小、粒度和荧光来纯化个体细胞。悬浮液中的细胞以液滴流的形式通过，其中每个液滴包含感兴趣的单细胞。液滴在激光前通过。光学检测系统基于预定的光学参数(例如，荧光或生物发光参数)检测感兴趣的细胞。仪器将电荷施加到包含感兴趣的细胞的液滴，并且静电偏转系统促进将带电液滴收集到适当的管或孔中。分选参数可根据纯度和收率的要求进行调整。[0200]macstm(miltenyibiotec)是用于根据各种细胞群体的表面抗原分离它们的方法。该选择方法依赖于细胞表面标志物的共引入，所述细胞表面标志物不以其他方式存在于待编辑的细胞表面上。[0201]自动化多模块哺乳动物细胞处理仪器的使用[0202]图6图示了多模块细胞处理仪器的一种实施方案。该实施方案描绘了对哺乳动物细胞群体进行递归基因编辑的示例性系统。细胞处理仪器600可以包括壳体、用于储存待转化或转染的细胞的储库604、和细胞生长模块和/或浓缩模块(包括例如旋转生长瓶)608。将待转化的细胞从储库转移至细胞生长模块进行培养，直至细胞达到靶od。在细胞达到靶od后，生长模块可以冷却或冷冻细胞，用于继续进行细胞浓缩的后续处理，其中对细胞进行缓冲液交换并使其成为电感受态，并且细胞的体积可以大幅减少。当细胞被浓缩到适当的体积后，将细胞转移到编辑机构引入模块610，诸如上文描述的流通式电穿孔装置。除了用于储存细胞的储库604之外，多模块细胞处理仪器还包括用于储存预组装有编辑寡核苷酸盒的编辑载体的储库606。将预组装的核酸载体转移至编辑机构引入模块610，其已经包含生长至靶od的细胞培养物。另外，该仪器可以包括用于储存包含核酸引导的核酸酶的编码序列的引擎载体的储库602。引擎载体可以被转移到编辑机构引入模块610，并且在编辑载体被转化的同时被转化，或者引擎载体可以在编辑载体被转化到细胞中之前或之后被转化到细胞中。在编辑机构引入模块610中，核酸例如被电穿孔到细胞中。电穿孔后，将细胞转移到任选的恢复模块(未示出)中，在恢复模块中细胞在转化后短暂恢复。[0203]在任选的恢复之后，细胞可以被转移到储存模块(也未示出)，在存储模块中细胞可以被存储在例如4℃用于后续处理。此外，可以任选地在编辑机构引入模块和编辑模块之间的单独模块中进行选择，或者可以在编辑模块中进行选择。在这种情况下，选择是指选择已经用包含选择性标志物的载体正确转化的细胞，从而确保细胞可能已经接收用于核酸引导的核酸酶编辑和用于报告正确编辑二者的载体。在选择之后，可以任选地稀释细胞并将其转移到编辑模块612。然后提供条件使得发生编辑。例如，如果一种或更多种编辑组分(例如，核酸引导的核酸酶、grna或供体dna中的一种或更多种)在诱导型启动子的控制下，则提供激活该一种或更多种诱导型启动子的条件。发生编辑后，在富集模块614(在那里细胞被选择)中选择细胞，例如，使用facs或macstm进行分选。在富集模块中，将表达选择性标志物的细胞与不表达该表达标志物的细胞分离，并且任选准备用于另一轮编辑。多模块细胞处理仪器由处理器616控制，处理器616被配置成基于使用者输入(如由一个或更多个脚本指导，或作为使用者输入或脚本的组合)来操作仪器。处理器616可以控制仪器600的各个模块的定时、持续时间、温度和操作以及试剂从试剂匣的分配。处理器可以用使用者可以从中选择的标准方案参数来编程，使用者可以手动指定一个或更多个参数，或者与试剂匣相关的一个或更多个脚本可以指定一个或更多个操作和/或反应参数。此外，处理器可以通知使用者(例如，经由智能电话或其他装置的应用程序)细胞已经达到靶od，使其成为感受态或被浓缩，和/或向使用者更新多模块系统中的各个模块中的细胞的进展。[0204]鉴于本公开内容，对于本领域普通技术人员来说明显的是，所描述的过程可以是递归和多重化的；即，细胞可以经历结合图6描述的工作流程，然后所得到的编辑的培养物可以经历另一轮(或若干轮或许多轮)使用不同编辑载体的另外的编辑(例如递归编辑)。例如，来自第一轮编辑的细胞可以被稀释，并且由编辑载体a编辑的编辑细胞的等分试样可以与编辑载体b组合，由编辑载体a编辑的编辑细胞的等分试样可以与编辑载体c组合，由编辑载体a编辑的编辑细胞的等分试样可以与编辑载体d组合，等等，用于第二轮编辑。在第二轮后，可以使双重编辑的细胞中的每一种的等分试样经历第三轮编辑，其中，例如，将ab编辑的、ac编辑的、ad编辑的细胞各自的等分试样与另外的编辑载体(诸如编辑载体x、y和z)组合。即，双重编辑的细胞ab可以与载体x、y和z组合并且由载体x、y和z编辑，以产生三重编辑的编辑细胞abx、aby和abz；双重编辑的细胞ac可以与载体x、y和z组合并且由载体x、y和z编辑，以产生三重编辑的细胞acx、acy和acz；并且双重编辑细胞ad可以与载体x、y和z组合并且由载体x、y和z编辑，以产生三重编辑的细胞adx、ady和adz，等等。在该过程中，可以执行编辑的许多排列和组合，产生非常多样的细胞群体和细胞文库。在任何递归过程中，“处治(cure)”先前的引擎载体和编辑载体(或者单个载体系统中的单个引擎+编辑载体)都是有利的。“处治”是其中将在先前一轮编辑中使用的一个或更多个载体从转化的细胞消除的过程。[0205]处治可以通过以下完成：例如使用处治质粒裂解一种或更多种载体从而使编辑载体和/或引擎载体(或单个的、合二为一的引擎/编辑载体)无功能；经由细胞生长稀释细胞群体中的一种或更多种载体(即细胞经历的生长周期越多，保留编辑载体或引擎载体的子细胞就越少)，或者通过例如利用编辑载体或引擎载体(或合二为一的引擎+编辑载体)上的热敏感复制起点。用于处治的条件将取决于用于处治的机制；即，在这个实例中，处治质粒如何裂解编辑和/或引擎载体。[0206]用于较高编辑效率的编辑和选择工作流程[0207]核酸指导的核酸酶编辑方法与选择程序(计算的或物理的，如本文进一步描述的)的组合与没有这样的选择方法的编辑方法相比导致编辑效率的显著增加。[0208]在图7和图8中示出的第一组工作流程中，编辑工作流程由以下组成：使用核酸酶(例如，rna指导的核酸酶，诸如cas-9、cpf-1、mad7等)和一个或更多个选择事件来增加细胞中的编辑率，包括增加哺乳动物细胞中的编辑率。[0209]图7示出了其中将编辑机构和rna指导的核酸酶的编码序列以两个单独载体递送到细胞的示例性工作流程。该工作流程包括设计靶向待编辑的基因组的区域的grna，该grna共价附接到包含一个或更多个预期编辑的同源臂702。在特定方面，编辑包括使靶位点抗进一步核酸酶裂解的编辑，例如，pam位点和/或间隔区中的突变。将这些grna-ha构建体引入编辑载体704，该编辑载体704包含用于表达核酸的启动子，并且任选地包含追溯特定编辑的条形码或其他机制。任选地，用于驱动编辑机构的启动子是诱导型的。[0210]将rna指导的核酸酶(例如，cas-9、cpf-1、mad7)的编码序列引入第二组载体708以创建引擎载体。引擎载体具有处于与编辑载体独立的启动子下的核酸酶的编码序列。引擎载体的独立的启动子可以与用于编辑载体的启动子相同或不同，并且任选地是诱导型的。[0211]将引擎载体和编辑载体引入细胞710，例如，使用在阅读本公开内容后对本领域技术人员将是明显的转化、转染或其他机制。然后为细胞提供用于编辑细胞的条件712，并允许进行编辑。[0212]在编辑之后，使用诸如本文描述的那些技术，进行细胞选择714，以获得针对编辑富集的细胞。这样的技术可以使用计算选择手段来进一步分析编辑的细胞群体，以及使用负选择和/或正选择的物理选择，诸如选择性标志物(例如，可用作用于推定的编辑细胞的物理富集的手柄的细胞表面标志物)的选择。[0213]步骤710-714(或者在一些情况下，如果细胞群体中存在足够的编辑和/或引擎载体而不需要再次添加，则步骤712-714)可以任选地被重复716，以增加细胞群体的编辑效率。[0214]图8示出了使用单个载体系统将编辑核酸和核酸酶的编码序列引入待编辑的细胞群体的示例性工作流程。该工作流程包括设计靶向待编辑的基因组的区域的grna，该grna共价附接到包含一个或更多个预期编辑的同源臂802。在特定方面，编辑包括使靶位点抗进一步核酸酶裂解的编辑，例如，pam位点和/或间隔区中的突变。[0215]将这些grna-ha的构建体和核酸酶(例如，rna指导的核酸酶)的编码序列引入到同一载体中804，以创建包含用于表达核酸和核酸酶的一个或更多个启动子的单个载体。单个载体任选地包含追溯特定编辑的条形码或其他机制。该载体可以包含用于表达grna-ha构建体和核酸酶的编码序列二者的单个启动子，或者grna-ha构建体和核酸酶的编码序列可以在同一载体中受不同启动子的控制。任选地，用于驱动编辑机构和/或核酸酶的编码的一个或更多个启动子是诱导型的。[0216]将载体引入细胞810，例如，使用在阅读本公开内容后对本领域技术人员将是明显的转化、转染或其他机制。然后为细胞提供用于编辑细胞的条件812，并允许进行编辑。[0217]在编辑之后，使用诸如本文描述的那些技术，进行细胞选择814，以获得针对编辑富集的细胞。这样的技术可以使用计算选择手段来进一步分析编辑的细胞群体，以及使用负选择和/或正选择的物理选择，诸如选择性标志物(例如，可用作用于推定的编辑细胞的物理富集的手柄的细胞表面标志物)的选择。[0218]步骤810-814(或者在一些情况下，如果细胞群体中存在足够的编辑和/或引擎载体而不需要再次添加，则步骤812-814)可以任选地被重复816，以增加细胞群体的编辑效率。[0219]图9示出了其中将编辑机构和rna指导的核酸酶的编码序列以两个单独载体递送到细胞的示例性工作流程。该工作流程包括设计靶向待编辑的基因组的区域的grna，该grna共价附接到包含一个或更多个预期编辑的同源臂902。在特定方面，编辑包括使靶位点抗进一步核酸酶裂解的编辑，例如，pam位点和/或间隔区中的突变。将这些grna-ha构建体引入编辑载体904，该编辑载体904包含用于表达核酸的启动子，并且任选地包含追溯特定编辑的条形码或其他机制。任选地，用于驱动编辑机构的启动子是诱导型的。[0220]将rna指导的核酸酶(例如，cas-9、cpf-1、mad7)和具有期望的功能的酶区域(例如，逆转录酶活性)的融合载体的编码序列引入第二组载体908以创建引擎载体。引擎载体具有处于与编辑载体独立的启动子下的核酸酶的编码序列。引擎载体的单独启动子可以与用于编辑载体的启动子相同或不同，并且任选地是诱导型的。[0221]将引擎载体和编辑载体引入细胞910，例如，使用在阅读本公开内容后对本领域技术人员将是明显的转化、转染或其他机制。然后为细胞提供用于编辑细胞的条件912，并允许进行编辑。[0222]在编辑之后，使用诸如本文描述的那些技术，进行细胞选择914，以获得针对编辑富集的细胞。这样的技术可以使用计算选择手段来进一步分析编辑的细胞群体，以及使用负选择和/或正选择的物理选择，诸如选择性标志物(例如，可用作用于推定的编辑细胞的物理富集的手柄的细胞表面标志物)的选择。[0223]步骤910-914(或者在一些情况下，如果细胞群体中存在足够的编辑和/或引擎载体而不需要再次添加，则步骤912-914)可以任选地被重复916，以增加细胞群体的编辑效率。[0224]图10示出了使用单个载体系统将编辑核酸和核酸酶的编码序列引入待编辑的细胞群体的示例性工作流程。该工作流程包括设计靶向待编辑的基因组的区域的grna，该grna共价附接到包含一个或更多个预期编辑的同源臂1002。在特定方面，编辑包括使靶位点抗进一步核酸酶裂解的编辑，例如，pam位点和/或间隔区中的突变。[0225]将这些grna-ha构建体和rna指导的核酸酶(例如，cas-9、cpf-1、mad7)与具有期望的功能的酶区域(例如，逆转录酶活性)的融合载体的编码序列引入到同一载体中1004，以创建包含用于表达核酸和融合蛋白的一个或更多个启动子的单个载体。单个载体任选地包含追溯特定编辑的条形码或其他机制。该载体可以包含用于表达grna-ha构建体和融合蛋白的编码序列二者的单个启动子，或者grna-ha构建体和融合蛋白的编码序列可以在同一载体中受不同启动子的控制。任选地，用于驱动编辑机构和/或融合蛋白的编码的一个或更多个启动子是诱导型的。[0226]将载体引入细胞1010，例如，使用在阅读本公开内容后对本领域技术人员将是明显的转化、转染或其他机制。然后为细胞提供用于编辑细胞的条件1012，并允许进行编辑。[0227]在编辑之后，使用诸如本文描述的那些技术，进行细胞选择1014，以获得针对编辑富集的细胞。这样的技术可以使用计算选择手段来进一步分析编辑的细胞群体，以及使用负选择和/或正选择的物理选择，诸如选择性标志物(例如，可用作用于推定的编辑细胞的物理富集的手柄的细胞表面标志物)的选择。[0228]步骤1010-1014(或者在一些情况下，如果细胞群体中存在足够的编辑和/或引擎载体而不需要再次添加，则步骤1012-1014)可以任选地被重复1016，以增加细胞群体的编辑效率。[0229]使用自动化编辑方法、模块、仪器和系统创建的细胞文库[0230]在一方面，本公开内容提供了编辑方法、模块、仪器和自动化多模块细胞编辑仪器，用于使用各种基于切口酶的编辑策略(包括create融合)创建改变各种细胞类型中感兴趣的rna和/或蛋白的表达、水平和/或活性的细胞文库，如本文中更详细描述的。因此，本公开内容意图涵盖通过本公开内容的自动化编辑方法、自动化多模块细胞编辑仪器创建的经编辑的细胞文库。这些细胞文库可以具有不同的靶向编辑，包括但不限于各种生物体的细胞中的基因敲除、基因敲入、插入、缺失、单核苷酸编辑、短串联重复序列编辑、移码、三联体密码子扩展等。这些编辑可以涉及基因组的编码区或非编码区，并且优选地是合理设计的。[0231]在一些方面，本公开内容提供了用于创建改变dna相关过程的细胞文库的自动化编辑方法、自动化多模块细胞编辑仪器。例如，细胞文库可以包括具有dna结合位点中的编辑的个体细胞，所述编辑干扰调控选定基因表达的调控元件的dna结合。此外，细胞文库可以包括基因组dna中影响细胞过程(诸如异染色质形成、转换类别重组和vdj重组)的编辑。[0232]在特定方面，对细胞群体内的个体细胞使用多重化的、切口酶指导的编辑来创建细胞文库，其中细胞群体内多于一个细胞是在单轮编辑中编辑的，即，细胞文库的细胞内多于一个改变是在单个自动化操作中编辑的。可以在单个多重化自动化操作中创建的文库可以包括多达500个具有预期编辑的细胞，该预期编辑可以是细胞中的相同的引入编辑或不同细胞中的两个或更多个离散编辑。文库还可以包括以下中的一个或更多个预期编辑(相同或不同)：1000个经编辑的细胞、2000个经编辑的细胞、5000个经编辑的细胞、10,000个经编辑的细胞、50,000个经编辑的细胞、100,000个经编辑的细胞、200,000个经编辑的细胞、300,000个经编辑的细胞、400,000个经编辑的细胞、500,000个经编辑的细胞、600,000个经编辑的细胞、700,000个经编辑的细胞、800,000个经编辑的细胞、900,000个经编辑的细胞、1,000,000个经编辑的细胞、2,000,000个经编辑的细胞、3,000,000个经编辑的细胞、4,000,000个经编辑的细胞、5,000,000个经编辑的细胞、6,000,000个经编辑的细胞、7,000,000个经编辑的细胞、8,000,000个经编辑的细胞、9,000,000个经编辑的细胞、10,000,000个经编辑的细胞或更多个经编辑的细胞。[0233]在其他特定方面，对细胞群体内的个体细胞使用切口酶指导的递归编辑来创建细胞文库，其中在两轮或更多轮编辑中将编辑添加到个体细胞。使用递归编辑导致靶向文库中个体细胞的基因组中的两个或更多个位点的两个或更多个编辑的合并。可以在单个多重化自动化操作中创建的文库可以包括多达500个具有预期编辑的细胞，该预期编辑可以是细胞中的相同的引入编辑或不同细胞中的两个或更多个离散编辑。文库还可以包括以下中的一个或更多个预期编辑(相同或不同)：1000个经编辑的细胞、2000个经编辑的细胞、5000个经编辑的细胞、10,000个经编辑的细胞、50,000个经编辑的细胞、100,000个经编辑的细胞、200,000个经编辑的细胞、300,000个经编辑的细胞、400,000个经编辑的细胞、500,000个经编辑的细胞、600,000个经编辑的细胞、700,000个经编辑的细胞、800,000个经编辑的细胞、900,000个经编辑的细胞、1,000,000个经编辑的细胞、2,000,000个经编辑的细胞、3,000,000个经编辑的细胞、4,000,000个经编辑的细胞、5,000,000个经编辑的细胞、6,000,000个经编辑的细胞、7,000,000个经编辑的细胞、8,000,000个经编辑的细胞、9,000,000个经编辑的细胞、10,000,000个经编辑的细胞或更多个经编辑的细胞。[0234]可以基于本说明书进行修改以利用自动化系统的非自动化编辑策略的实例可见于例如liu等人(同上)中。[0235]在特定方面，递归编辑可用于首先创建细胞表型，并且然后后续轮编辑用于逆转表型和/或促进其他细胞特性。[0236]在一些方面，细胞文库包括用于在细胞中创建非天然氨基酸的编辑。[0237]在特定方面，本公开内容提供了使用所公开的编辑方法、本公开内容的自动化多模块细胞编辑仪器创建的在一种或更多种调控元件中具有编辑的经编辑的细胞文库。术语“调控元件”是指在特定环境和/或背景中能够影响可操作连接的编码序列的转录和/或翻译的核酸分子。该术语意图包括促进或调控转录以及rna稳定性的所有元件，包括启动子、rna聚合酶与转录因子基本相互作用所需的核心元件、上游元件、增强子和响应元件(参见例如，lewin,“genesv”(oxforduniversitypress,oxford)第847-873页)。原核生物中的示例性调控元件包括但不限于启动子、操纵子序列和核糖体结合位点。在真核细胞中使用的调控元件可以包括但不限于启动子、增强子、绝缘子(insulator)、剪接信号和多腺苷酸化信号。[0238]优选地，经编辑的细胞文库包括基于特定细胞类型中的蛋白结构、表达和/或活性的预测而设计的合理设计的编辑。例如，合理的设计可以基于使用特定核酸酶和基因调控的基因组编辑的全系统生物物理模型，以预测包括核酸酶表达和/或结合、生长条件和其他实验条件的不同编辑参数如何共同控制核酸酶编辑的动力学。参见例如，farasat和salis,ploscomputbiol.,29:12(1):e1004724(2016)。[0239]在一方面，本公开内容提供了使用本公开内容的切口酶方法(包括使用所公开的仪器的自动化方法)创建的具有各种合理设计的调控序列的经编辑的细胞的文库的创建。例如，经编辑的细胞文库可以包括使用一组组成型和/或诱导型启动子、增强子序列、操纵子序列和/或核糖体结合位点创建的原核细胞群体。在另一个实例中，经编辑的细胞文库可以包括使用一组用于表达感兴趣蛋白的组成型和/或诱导型启动子、增强子序列、操纵子序列和/或不同的kozak序列创建的真核序列。[0240]在一些方面，本公开内容提供了包括具有合理设计的编辑的细胞的细胞文库，所述合理设计的编辑包括遍及生物体基因组的感兴趣序列中的一个或更多个类型的编辑。在特定方面，本公开内容提供了包括具有合理设计的编辑的细胞的细胞文库，所述合理设计的编辑包括遍及基因组子集的感兴趣序列中的一个或更多个类型的编辑。例如，细胞文库可以包括具有合理设计的编辑的细胞，所述合理设计的编辑包括遍及外显子组(例如，基因组的每个或大多数开放阅读框)的感兴趣序列中的一个或更多个类型的编辑。例如，细胞文库可以包括具有合理设计的编辑的细胞，所述合理设计的编辑包括遍及激酶组的感兴趣序列中的一个或更多个类型的编辑。在又另一种实例中，细胞文库可以包括具有合理设计的编辑的细胞，所述合理设计的编辑包括遍及分泌组的感兴趣序列中的一个或更多个类型的编辑。在又其他方面，细胞文库可以包括具有合理设计的编辑的细胞，所述合理设计的编辑被创建以分析外显子组内编码的蛋白的各种亚型，并且细胞文库可以被设计成控制一种或更多种特定亚型的表达，例如用于转录组分析。[0241]重要地，在某些方面，细胞文库可以包括使用随机化序列(例如，随机化启动子序列)的编辑以减少文库内个体细胞中一种或更多种蛋白表达之间的相似性。另外，细胞文库中的启动子可以是组成型的、诱导型的或二者，以实现强的和/或可滴定的表达。[0242]在其他方面，本公开内容提供了基于切口酶的编辑方法、采用自动化编辑方法的模块、仪器和系统和/或自动化多模块细胞编辑仪器，用于创建包括鉴定选定基因靶的最佳表达的编辑的细胞文库。例如，通过代谢工程化产生生物化学物质通常需要途径酶的表达，并且最佳的产生产率并不总是通过细胞中的靶途径酶的最高量实现的，而是通过微调单独的酶和相关调控蛋白和/或途径的表达水平来实现的。类似地，有时为了最佳产率可以经实验调节异源蛋白的表达水平。[0243]转录影响基因表达水平的最明显的方式是通过polii启动的速率，这可以由启动子或增强子强度和反式激活因子的组合来调节(kadonaga等人,cell,116(2):247-57(2004))。在真核生物中，延长率(elongationrate)也可以通过影响选择性剪接来决定基因表达模式(cramer等人,pnasusa,94(21):11456-60(1997)。基因终止失败可以通过降低启动子对polii的可及性而损害下游基因的表达(greger等人,2000pnasusa,97(15):8415-20(2000))。该过程被称为转录干扰，在低等真核生物中特别有意义，因为它们通常具有紧密间隔的基因。在一些实施方案中，本公开内容提供了用于优化细胞基因转录的方法。基因转录是数种不同的生物现象(包括转录起始(rnap募集和转录复合物形成)、延长(链合成/延伸)和转录终止(rnap脱离和终止))的结果。[0244]定点诱变[0245]可以使用基于切口酶的编辑方法、模块、仪器和系统，采用定点诱变(即，其中蛋白的氨基酸序列或其他基因组特征可以通过有意和精确地使蛋白或基因组特征突变而改变)来创建细胞文库。这些细胞系可以对各种目的(例如，用于确定细胞内的蛋白功能，鉴定细胞内的酶活性位点，以及设计新颖的蛋白)有用。例如，定点诱变可以以多重化方式使用，以将蛋白序列中的单个氨基酸换成具有不同化学特性的另一个氨基酸。这允许人们确定细胞群体内的个体细胞中的合理设计的或随机产生的突变基因的效果。参见例如，berg等人biochemistry,第六版，(newyork:w.h.freemanandcompany)(2007)。[0246]在另一种实例中，可以对细胞文库内的个体细胞进行编辑以取代结合位点中的氨基酸，诸如取代用于蛋白复合物内相互作用的蛋白结合位点中的一个或更多个氨基酸，或者取代可以容纳辅因子或配体的酶口袋中的一个或更多个氨基酸。这类编辑允许创建对蛋白的特定操纵以测量一个或更多个蛋白的某些特性，包括与蛋白复合体内的其他辅因子、配体等的相互作用。[0247]在又另一种实例中，可以使用位点特异性诱变对细胞文库内的个体细胞进行各种编辑类型，以用于研究表达数量性状基因座(eqtl)。eqtl是解释基因表达表型的遗传方差的一部分的基因座。本发明的文库对评价eqtl并将eqtl与实际疾病状态相联系将是有用的。[0248]在特定方面，可以使用基于蛋白的已知或预测的结构的合理设计来创建被引入到本公开内容的细胞文库中的编辑。参见例如,chronopouloueg和labrou,currprotocproteinsci.；第26章:单元26.6(2011)。这样的定点诱变可以为文库内的个体细胞提供一个或更多个定点编辑，并且优选地在细胞群体内的两个或更多个定点编辑(例如，组合编辑)。[0249]在其他方面，使用定点密码子突变“扫描”基因的编码区中的所有密码子或基本上所有密码子来创建本公开内容的细胞文库。以这种方式，可以基于基因的一个或更多个密码子中的特定多态性来检查特定密码子的单个编辑的功能损失或功能增益。这些文库可以是用于确定哪些遗传变化是沉默的或者是细胞或细胞群体中的特定表型的原因的强大工具。密码子的编辑可以是随机产生的，或者可以是基于待分析的基因中的已知的多态性和/或已鉴定的突变而合理设计的。此外，对细胞中的单个途径中的两个或更多个基因使用这些技术，可以确定潜在的蛋白:蛋白相互作用或在细胞功能或途径中的冗余。[0250]例如，丙氨酸扫描可以用于确定特定残基对给定蛋白的稳定性或功能的贡献。参见例如，lefèvre等人,nucleicacidsresearch,第25(2)卷:447–448(1997)。丙氨酸常常由于它的不庞大的(non-bulky)、化学上惰性的甲基官能团而在这种密码子扫描技术中被使用，甲基官能团可以模拟许多其他氨基酸拥有的二级结构偏好。密码子扫描还可以用于确定特定残基的侧链是否在细胞功能和/或活性中发挥显著作用。有时，如果需要保持突变残基的尺寸，则可以在创建密码子扫描细胞文库时使用其他氨基酸，诸如，缬氨酸或亮氨酸。[0251]在其他特定方面，可以使用本公开内容的基于切口酶的编辑方法、采用自动化编辑方法的模块、仪器和系统、和/或自动化多模块细胞编辑仪器来创建细胞文库，以确定蛋白(诸如酶或激素)的活性位点，并阐明细胞文库中这些蛋白中的一种或更多种的作用机制。与分子建模研究相关的定点诱变可以用于发现酶的活性位点结构以及因此发现酶的作用机制。对这些细胞文库的分析可以提供对以下的理解：蛋白的活性位点处的特定氨基酸残基，在蛋白复合物的亚基之间的接触中，对各种遗传背景中的细胞内运输和蛋白稳定性/半衰期发挥的作用。[0252]饱和诱变[0253]在一些方面，使用基于切口酶的编辑方法、采用自动化编辑方法的模块、仪器和系统、和/或自动化多模块细胞编辑仪器创建的细胞文库是饱和诱变文库，其中单个密码子或一组密码子被随机化以在特定基因或感兴趣的基因的位置处产生所有可能的氨基酸。这些细胞文库可以对产生变体(例如，用于定向演化)特别有用。参见例如，chica等人,currentopinioninbiotechnology16(4):378-384(2005)；和shivange,currentopinioninchemicalbiology,13(1):19-25。[0254]在一些方面，包含不同简并密码子的编辑可以用于编码文库中的个体细胞中的氨基酸组。因为一些氨基酸与其他氨基酸相比由更多的密码子编码，所以氨基酸的确切比率不能相等。在某些方面，使用更受限制的简并密码子。‘nnk’和‘nns’具有编码所有20种氨基酸的优点，但在3％的时间还编码终止密码子。替代密码子，诸如‘ndt’、‘dbk’完全避免了终止密码子，并编码仍然涵盖所有主要的生物物理类型(阴离子的、阳离子的、脂肪族疏水的、芳香族疏水的、亲水的、小的)的最小一组氨基酸。[0255]在特定方面，在饱和诱变编辑过程中使用非冗余饱和诱变，其中使用特定生物体最常用的密码子。[0256]启动子交换和梯(ladder)[0257]用于分析和/或优化一个或更多个感兴趣的基因的表达的一种机制是通过创建“启动子交换”细胞文库，其中细胞包含具有连接到一个或更多个感兴趣的基因的特定启动子的遗传编辑。因此，使用基于切口酶的编辑方法、采用自动化编辑方法的模块、仪器和系统、和/或自动化多模块细胞编辑仪器创建的细胞文库可以是启动子交换细胞文库，其可以用于例如增加或降低感兴趣的基因的表达，以优化代谢或遗传途径。在一些方面，启动子交换细胞文库可以用于鉴定影响细胞活力(vitality)或存活力(viability)的基因(例如，编码影响细胞生长速率或总体健康的蛋白的基因)的表达增加或减少。在一些方面，启动子交换细胞文库可以用于创建具有启动子之间的依赖性和逻辑以创建合成基因网络的细胞。在一些方面，启动子交换可以用于控制自然界中的同质和异质(复杂组织)群体二者的细胞之间的细胞与细胞的通信。[0258]细胞文库可以利用任何给定数量的启动子和任何给定数量的靶基因，这些启动子基于表达强度范围的表现被分组在一起。启动子序列梯在至少一种条件下改变至少一个基因座的表达。然后使用本公开内容的自动化编辑方法、自动化多模块细胞编辑仪器将该梯系统地应用于生物体中的一组基因。[0259]在特定方面，使用基于切口酶的编辑方法形成的细胞文库包括代表给定启动子被可操作地连接到其他方面遗传背景相同的一个或更多个感兴趣靶基因的个体细胞。可以被修改以利用自动化系统的非自动化编辑策略的实例可见于例如美国专利第9,988,624号中。[0260]在特定方面，通过编辑待被可操作地连接到一组预先选定的启动子的一组靶基因来创建启动子交换细胞文库，所述一组预先选定的启动子用作用于表达感兴趣的基因的“启动子梯”。例如，编辑细胞使得一个或更多个感兴趣的单独基因被编辑，以与启动子梯中的不同启动子可操作地连接。当内源性启动子不存在、其序列未知、或者它先前已经以某种方式被改变时，启动子梯中的个体启动子可以插入到感兴趣的基因的前面。这些产生的细胞文库具有梯中的个体启动子被可操作地连接到其他方面遗传背景相同的一个或更多个靶基因的个体细胞。启动子通常被选择来产生不同基因座间的可变表达，并且可以包括诱导型启动子、组成型启动子或二者。[0261]使用启动子梯编辑的一组靶基因可以包括基因组或基因组选定子集的所有或大多数开放阅读框(orf)，例如，激酶组或分泌组的orf。在一些方面，靶基因可以包括基因的各种亚型的编码区，并且细胞文库可以被设计成表达一种或更多种特定亚型，例如，用于使用各种启动子的转录组分析。[0262]该组靶基因也可以是已知或疑似参与特定细胞途径(例如调控途径或信号传导途径)的基因。该组靶基因可以是通过与先前展示的有益编辑(先前的启动子交换或先前的snp交换)相关、通过基于在先前产生的编辑之间的上位相互作用的算法选择、基于关于对靶有益的orf的假设的其他选择标准或通过随机选择而与功能相关的orf。在特定的实施方案中，靶基因可以包括非蛋白编码基因，包括非编码rna。[0263]其他功能性遗传元件(包括绝缘子元件和其它基因组组织元件)的编辑也可以用于系统地改变一组靶基因的表达水平，并且可以使用本公开内容的方法、自动化多模块细胞编辑仪器来引入。在一方面，单独地或者与选定的启动子或启动子梯组合地使用增强子序列的梯来编辑细胞群体，以创建具有在这些增强子元件中的各种编辑的细胞文库。在另一方面，单独地或者与选定的启动子或启动子梯组合地使用核糖体结合序列的梯来编辑细胞群体，以创建具有在这些核糖体结合序列中的各种编辑的细胞文库。[0264]在另一方面，编辑细胞群体以允许将各种mrna和/或蛋白稳定化或去稳定化序列附接到转录物或蛋白的5'末端或3'末端或任何其他位置。[0265]在某些方面，可以使用本公开内容的自动化编辑方法、模块、仪器和系统编辑先前建立的细胞系的细胞群体，以创建细胞文库来改进细胞的功能、健康和/或存活力。例如，许多目前用于大规模生产的工业株是在许多年(有时是数十年)的时间段里迭代使用随机诱变方法开发的。不想要的中性突变和有害突变伴随着有益改变被引入株中，并且随着时间的推移，这导致株在总体稳健性和关键性状(诸如生长速率)方面存在缺陷。在另一种实例中，哺乳动物细胞系通过一段时间的细胞传代持续突变，并且同样地，这些细胞系可能变得不稳定且获得不期望的性状。本公开内容的自动化编辑方法、自动化多模块细胞编辑仪器可以使用编辑策略(诸如snp和/或str交换、插入缺失创建或其他技术)来去除或改变不期望的基因组序列和/或引入新的基因组序列，以解决缺陷同时保留细胞的期望特性。[0266]当使用递归编辑时，经编辑的细胞文库中的个体细胞中的编辑可以掺入对基因组中的异位点(ectopicsite)(例如，cart基因座)中的“着陆垫(landingpad)”的包含，以优化表达、稳定性和/或控制。[0267]在一些实施方案中，在一种或更多种标准(例如，产生感兴趣的化学物质或产物)下培养和分析所产生的具有包含一个或更多个编辑(引入或去除)的个体细胞的每个文库。然后，将具有特定标准的细胞与细胞中的一个或更多个特定编辑相关联或相关。以这种方式，可以确定给定编辑对任何数量的感兴趣的遗传性状或表型性状的影响。鉴定与特定标准或增强的功能/稳健性相关联的多于一个编辑可以产生具有高度期望的特征的细胞。[0268]敲除文库或敲入文库[0269]在某些方面，使用基于切口酶的编辑方法、采用自动化编辑方法的模块、仪器和系统、和/或自动化多模块细胞编辑仪器创建的细胞文库可以是各种感兴趣的基因的“敲除”(ko)或“敲入”(ki)编辑。因此，本公开内容意图涵盖通过基于切口酶的编辑方法、采用自动化编辑方法的模块、仪器和系统、和/或自动化多模块细胞编辑仪器创建的经编辑的细胞文库，该经编辑的细胞文库具有一个或更多个去除或减少选定的感兴趣基因的表达的突变，以研究这些编辑对细胞文库内的个体细胞中基因功能的影响。[0270]可以使用靶向基因ko(例如，经由插入/缺失)或ki(例如，经由同源指导修复)创建细胞文库。例如，双链断裂常常经由非同源末端连接dna修复途径进行修复。已知该修复倾向于出错，并且因此可能引入破坏基因功能的插入和缺失。优选地，编辑被合理设计成特异性地影响感兴趣的基因，并且可以创建具有一个或更多个感兴趣的基因座的ko或ki的个体细胞。可以使用本公开内容的自动化递归编辑来创建具有两个或更多感兴趣基因座的ko或ki的细胞。[0271]在特定方面，对细胞群体内的细胞使用同时多重化编辑来创建ko或ki细胞文库，并且细胞群体内多于一个细胞是在单轮编辑中编辑的，即，细胞文库的细胞内多于一个改变是在单个自动化操作中编辑的。在其他特定方面，对细胞群体内的个体细胞使用递归编辑来创建细胞文库，并导致基因组中两个或更多各位点的多于一个编辑合并到个体细胞中。[0272]snp交换或短串联重复序列交换[0273]在一方面，使用基于切口酶的编辑方法、采用自动化编辑方法的模块、仪器和系统、和/或自动化多模块细胞编辑仪器创建的细胞文库，可以被产生用于系统地将单核苷酸多态性(“snp”)引入或取代到个体细胞的基因组中，以创建“snp交换”细胞文库。在一些实施方案中，本公开内容的snp交换方法包括添加有益的snp以及去除有害和/或中性的snp二者。snp交换可以靶向编码序列、非编码序列或二者。[0274]在另一方面，使用基于切口酶的编辑方法、采用自动化编辑方法的模块、仪器和系统、和/或自动化多模块细胞编辑仪器来创建细胞文库，用于系统地将短串联重复序列(“str”)引入或取代到个体细胞的基因组中，以创建“str交换”细胞文库。在一些实施方案中，本公开内容的str交换方法包括添加有益的str以及去除有害和/或中性的str二者。str交换可以靶向编码序列、非编码序列或二者。[0275]在一些实施方案中，用于创建细胞文库的snp交换和/或str交换是多重化的，并且细胞群体内的多于一个细胞是在单轮编辑中编辑的，即，细胞文库的细胞内的多于一个改变是在单个自动化操作中编辑的。在其他实施方案中，用于创建细胞文库的snp和/或str交换是递归的，并导致多于一个有益序列和/或去除有害序列合并到单细胞中。多于一个改变既可以是一组特定的限定的改变，也可以是部分随机化的组合的突变文库。去除有害突变和合并有益突变可以在各种细胞过程方面提供直接的改进。去除遗传负担或将有益改变合并到没有遗传负担的株也为可以进一步实现改进的另外的随机诱变提供新的、稳健的起点。[0276]snp交换克服了随机突变方法的基础性限制，因为snp交换不是随机方法，而是遍及细胞的单个突变进行系统性引入或去除。[0277]剪接位点编辑[0278]rna剪接是加工期间内含子被切除，并且外显子被剪接在一起，以产生被翻译成蛋白的mrna加工。细胞机构对剪接信号的精确识别对该加工是关键的。因此，本公开内容的细胞文库包括使用基于切口酶的编辑方法、采用自动化编辑方法的模块、仪器和系统、和/或自动化多模块细胞编辑仪器创建的细胞文库，用于系统地引入对各个基因组中已知的和/或预测的剪接供体和/或受体位点的改变，以创建各个基因的剪接位点变体的文库。这样的编辑可以帮助阐明在细胞环境中基因各种亚型的生物学重要性。各种编码区的剪接位点的合理设计的序列包括与各种哺乳动物紊乱相关联的实际突变或预测的突变，可以使用诸如见于以下的分析技术来预测：nalla和rogan,hummutat,25:334-342(2005)；divina等人,eurjhumgenet,17:759-765(2009)；desmet等人,nucleicacidsres,37:e67(2009)；faber等人,bmcbioinformatics,12(增刊4):s2(2011)。[0279]起始/终止密码子交换和核酸类似物的掺入[0280]在一些方面，本公开内容提供了使用基于切口酶的编辑方法、采用自动化编辑方法的模块、仪器和系统、和/或自动化多模块细胞编辑仪器创建的细胞文库的创建，用于在整个生物体基因组中或在基因组(例如，激酶组或分泌组)中的编码区的选定子集中交换起始密码子和终止密码子变体。在细胞文库中，个体细胞将用一个或更多个起始密码子或终止密码子替换一个或更多个感兴趣的基因的起始密码子或终止密码子。[0281]例如，真核生物使用的典型起始密码子是atg(aug)，并且原核生物使用最多的是atg(aug)，然后是gtg(gug)和ttg(uug)。细胞文库可以包括具有对一个或更多个感兴趣的基因的天然起始密码子的取代的个体细胞。[0282]在一些方面，本公开内容提供了通过在选定的感兴趣基因前面用ttg替换atg起始密码子进行的细胞文库创建。在其他方面，本公开内容提供了通过用gtg替换atg起始密码子进行的细胞文库自动化创建。在其他方面，本公开内容提供了通过用atg替换gtg起始密码子进行的细胞文库自动化创建。在其他方面，本公开内容提供了通过用ttg替换gtg起始密码子进行的细胞文库自动化创建。在其他方面，本公开内容提供了通过用atg替换ttg起始密码子进行的细胞文库自动化创建。在其他方面，本公开内容提供了通过用gtg替换ttg起始密码子进行的细胞文库自动化创建。[0283]在其他实例中，酿酒酵母(s.cerevisiae)和哺乳动物的典型终止密码子分别是taa(uaa)和tga(uga)。单子叶植物的典型终止密码子是tga(uga)，而昆虫和大肠杆菌(e.coli)通常使用taa(uaa)作为终止密码子(dalphin等人,nucl.acidsres.,24:216-218(1996))。细胞文库可以包括具有对一个或更多个感兴趣的基因的天然终止密码子的取代的个体细胞。[0284]在一些方面，本公开内容提供了通过用tag替换taa终止密码子进行的细胞文库自动化创建。在其他方面，本公开内容提供了通过用tga替换taa终止密码子进行的细胞文库自动化创建。在其他方面，本公开内容提供了通过用taa替换tga终止密码子进行的细胞文库自动化创建。在其他方面，本公开内容提供了通过用tag替换tga终止密码子进行的细胞文库自动化创建。在其他方面，本公开内容提供了通过用taa替换tag终止密码子进行的细胞文库自动化创建。在其他方面，本发明教导了通过用tga替换tag终止密码子进行的细胞文库自动化创建。[0285]终止子交换和梯[0286]用于鉴定一个或更多个感兴趣的基因的剪接前mrna的最佳终止的一种机制是通过创建“终止子交换”细胞文库，其中细胞包括具有连接到一个或更多个感兴趣的基因的特定终止子序列的遗传编辑。因此，本公开内容的细胞文库包括使用基于切口酶的编辑方法、采用自动化编辑方法的模块、仪器和系统、和/或自动化多模块细胞编辑仪器创建的终止子交换细胞文库。终止子交换细胞文库可以用于例如通过从合成位点释放转录物来影响mrna稳定性。在其他实施方案中，终止子交换细胞文库可以用于鉴定转录终止效率的增加或减少，并由此鉴定未剪接的前体mrna的积累(例如，west和proudfoot,molcell.；33(3-9)；354-364(2009))和/或3'末端加工(例如，west等人,molcell.29(5):600-10(2008))。在基因连接到多于一个终止位点的情况下，该编辑可以编辑与基因相关联的多于一个终止子的编辑的组合。也可以将另外的氨基酸添加到蛋白的末端，以确定终止子对蛋白长度的影响。[0287]细胞文库可以利用任何给定数量的终止子编辑和任何给定数量的靶基因，这些终止子编辑基于活性范围的表现被选择用于终止子梯。终止子序列梯在至少一种条件下改变至少一个基因座的表达。然后使用本公开内容的自动化编辑方法、模块、仪器和系统将该梯系统地应用于生物体中的一组基因。在一些方面，本公开内容提供了使用本公开内容的自动化编辑方法、模块、仪器和系统的细胞文库创建，其中文库被创建以编辑文库的个体细胞的基因组中的一个或更多个区域中的终止子信号。真核生物的转录终止通过与rna聚合酶ii缔合的蛋白因子识别的终止子信号操作。例如，细胞文库可以包含具有在编码多腺苷酸化特异性因子(cpsf)和裂解刺激因子(cstf)的基因和/或编码由cpsf和cstf因子募集到终止位点的蛋白的基因中的编辑的单独真核细胞。在原核生物中，称为rho独立性终止和rho依赖性终止的两种主要机制介导转录终止。例如，细胞文库可以包含具有编码影响这些终止途径的结合、效率和/或活性的蛋白的基因中的编辑的单独原核细胞。[0288]在某些方面，本公开内容提供了选择具有最佳特性的终止序列(“终止子”)的方法。例如，在一些实施方案中，本公开内容教导提供了用于在宿主细胞内引入和/或编辑一个或更多个终止子和/或产生一个或更多个终止子的变体的方法，所述变体表现出一定范围的活性。终止子的特定组合可以被分组在一起作为终止子梯，并且本公开内容的细胞文库包括代表终止子被可操作地连接到其他方面遗传背景相同的一个或更多个感兴趣的靶基因的个体细胞。可被修改以利用自动化仪器的非自动化编辑策略的实例可见于例如serber等人的美国专利第9,988,624号，题为“microbialstrainimprovementbyahtpgenomicengineeringplatform”。[0289]在特定方面，通过编辑待被可操作地连接到一组预先选定的终止子的一组靶基因来产生终止子交换细胞文库，这些终止子用作用于表达感兴趣的基因的“终止子梯”。例如，编辑细胞使得内源性终止子被可操作地连接到与终止子梯中的不同终止子编辑的感兴趣的单独基因。当内源性终止子不存在，其序列未知，或者它先前已经以某种方式被改变时，终止子梯中的单个终止子可以插入到感兴趣的基因的后面。这些产生的细胞文库具有梯中的个体终止子被可操作地连接到其他方面遗传背景相同的一个或更多个靶基因的个体细胞。所讨论的终止子梯然后与给定的感兴趣的基因相关联。[0290]终止子梯可以用于更普遍地影响基因组或基因组的选定子集中的所有或大多数orf(例如，激酶组或分泌组的orf)的终止。该组靶基因也可以是已知或疑似参与特定细胞途径(例如调控途径或信号传导途径)的基因。该组靶基因可以是通过与先前展示的有益编辑(先前的启动子交换或先前的snp交换)相关、通过基于在先前产生的编辑之间的上位相互作用的算法选择、基于关于对靶有益的orf的假设的其他选择标准或通过随机选择而与功能相关的orf。在特定的实施方案中，靶基因可以包括非蛋白编码基因，包括非编码rna。实施例[0291]阐述了以下实施例，以便为本领域技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并且以下实施例并不旨在限制发明人视作其发明的范围，它们也不旨在代表或暗示以下实验是进行的所有实验或仅有的实验。本领域的技术人员应理解，可以对如特定方面中示出的本发明进行许多变化和/或修饰而不脱离本发明广泛描述的精神或范畴。因此，本发明的方面在所有方面被认为是说明性的而非限制性的。[0292]实施例i：全自动化单重rgn指导的编辑运行[0293]用如以下中描述的自动化多模块仪器成功地进行了使用mad7核酸酶的单重自动化基因组编辑：例如，美国专利第9,982,279号；和2018年6月30日提交的ussn16/024,831；2018年6月30日提交的ussn16/024,816；2018年9月28日提交的ussn16/147,353；2018年9月30日提交的ussn16/147,865；和2018年6月30日提交的ussn16/147,871。[0294]在自动化仪器中包括的等温核酸组装模块中经由gibson将ampr质粒骨架和lacz_f172*编辑盒组装成“编辑载体”。lacz_f172功能性敲除lacz基因。“lacz_f172*”指示编辑发生在lacz氨基酸序列中的第172个残基处。组装后，在等温核酸组装模块中使用ampure珠将产物脱盐，用80％乙醇洗涤，并以缓冲液洗脱。将组装的编辑载体和重组工程化就绪的电感受态细胞转移到编辑机构引入模块中进行电穿孔。将细胞和核酸合并，并且允许混合1分钟，并且进行电穿孔30秒。穿孔脉冲的参数为：电压，2400v；长度，5ms；间隔，50ms；脉冲数，1；极性，+。转移脉冲的参数为：电压，150v；长度，50ms；间隔，50ms；脉冲数，20；极性，+/-。电穿孔后，将细胞转移至恢复模块(另一生长模块)，并且允许其在含有氯霉素的soc培养基中恢复。1小时后将羧苄青霉素添加至培养基中，并且允许细胞恢复另外2小时。恢复后，将细胞保持在4℃，直至由使用者取回。[0295]在自动化处理和恢复后，将细胞的等分试样铺在补充有乳糖(作为糖底物)、氯霉素和羧苄青霉素的macconkey琼脂基础上，并且使其生长直至出现集落。白色集落代表功能性编辑的细胞，紫色集落代表未编辑的细胞。所有液体转移都由自动化多模块细胞处理仪器的自动化液体操作装置进行。[0296]自动化处理的结果是总共约1.0e03个细胞被转化(与常规台式的结果相当)，并且编辑效率是83.5％。通过对细胞基因组的编辑的区域测序确认白色集落中的lacz_172编辑。此外，通过网络摄像头远程观察自动化细胞处理的步骤，并且发送文本消息来更新自动化处理程序的状态。[0297]实施例ii：全自动化递归编辑运行[0298]使用自动化多模块细胞处理系统成功地实现了递归编辑。在自动化系统中包括的等温核酸组装模块中经由gibson将ampr质粒骨架和lacz_v10*编辑盒组装成“编辑载体”。与lacz_f172编辑类似，lacz_v10编辑功能性敲除lacz基因。“lacz_v10”指示编辑发生在lacz氨基酸序列中的氨基酸位置10处。组装后，在等温核酸组装模块中使用ampure珠将产物脱盐，用80％乙醇洗涤，并且以缓冲液洗脱。将第一组装的编辑载体和重组工程化就绪的电感受态大肠杆菌细胞转移到编辑机构引入模块中进行电穿孔。将细胞和核酸合并，并且允许混合1分钟，并且进行电穿孔30秒。穿孔脉冲的参数为：电压，2400v；长度，5ms；间隔，50ms；脉冲数，1；极性，+。转移脉冲的参数为：电压，150v；长度，50ms；间隔，50ms；脉冲数，20；极性，+/-。电穿孔后，将细胞转移至恢复模块(另一生长模块)，允许其在含有氯霉素的soc培养基中恢复。1小时后将羧苄青霉素添加至培养基中，并且使细胞生长另外2小时。然后将细胞转移至离心模块中，并且然后进行培养基交换。将细胞重悬于含有氯霉素和羧苄青霉素的tb中，使细胞在该tb中生长至od600为2.7，然后将细胞浓缩并且使其成为电感受态。[0299]在细胞生长期间，在等温核酸组装模块中制备第二编辑载体。第二编辑载体包含卡那霉素抗性基因，并且编辑盒包含galky145*编辑。如果成功，则galky145*编辑赋予细胞摄取和代谢半乳糖的能力。由galky154*盒产生的编辑在第154个氨基酸残基处引入终止密码子，将酪氨酸氨基酸改变为终止密码子。该编辑使galk基因产物成为非功能性的，并且抑制细胞代谢半乳糖的能力。组装后，在等温核酸组装模块中使用ampure珠将第二编辑载体产物脱盐，用80％乙醇洗涤，并且以缓冲液洗脱。使用与以上详述相同的参数，将组装的第二编辑载体和电感受态细胞(用第一编辑载体转化并且针对第一编辑载体进行选择)转移到编辑机构引入模块进行电穿孔。电穿孔后，将细胞转移至恢复模块(另一生长模块)，允许其在含有羧苄青霉素的soc培养基中恢复。恢复后，将细胞保持在4℃直至取回，之后将细胞的等分试样铺在补充有氯霉素和卡那霉素的lb琼脂上。为了定量lacz和galk编辑二者，在两种培养基类型上产生复制斑块板：1)补充有乳糖(作为糖底物)、氯霉素和卡那霉素的macconkey琼脂基础，和2)补充有半乳糖(作为糖底物)、氯霉素和卡那霉素的macconkey琼脂基础。所有液体转移都由自动化多模块细胞处理系统的自动化液体操作装置进行。[0300]在该递归编辑实验中，筛选的集落中的41％具有lacz和galk编辑二者，其结果与使用“台式”或手动方法获得的双重编辑效率相当。[0301]用编辑盒质粒转染细胞，该编辑盒质粒介导带有或不带有介导精确的基因组编辑的dna序列(hdr供体)的基因特异性grna的表达。该质粒还表达能够富集已经功能性转染了编辑盒质粒的细胞的手柄(细胞表面受体、荧光蛋白、抗生素抗性基因)。细胞还用核酸酶(质粒、mrna、蛋白)共转染，当与基因特异性grna配对时，核酸酶可以在基因组靶处介导dna序列特异性核酸内切酶活性。[0302]在递送有富集能力的编辑盒之后，富集手柄必须被表达到支持转染细胞的特定阳性选择同时允许耗尽未接收有富集能力的编辑盒的细胞的水平。在某些情况下，富集报告物的表达水平可以使得能够富集具有显著较高或较低富集报告物水平的亚群。[0303]表面报告物表达细胞可以用荧光团缀合的抗体特异性标记，并且然后使用荧光激活细胞分选仪(facs)将其分选为不同的群体(受体阴性、高或低)。通过对具有不同荧光强度水平的细胞进行电子门控，人们可以特异性地富集摄取相对较多或较少的编辑盒拷贝的亚群。如在对富集群体与未富集群体进行的gfp到bfp分析中观察到的，某些富集细胞亚群表现出较高的编辑率，如通过gfp阳性、bfp阳性和双阴性细胞的相对百分比测定的。经由细胞表面展示的受体或亲和配体进行的富集也使用抗体偶联的磁珠进行。[0304]实施例iii：gfp表达测定的开发[0305]使用rna指导的核酸酶-gfp表达盒开发了编辑检测测定，所述编辑检测测定加速了从最初的核酸酶筛选到最后阶段的单细胞克隆的基因组编辑工作流程。该载体还包含u6-grna盒，从而创建了用于crispr/核酸酶的递送和表达的单个载体系统(图10)。[0306]开发了两个系统来帮助富集经期望的基因组编辑的细胞群体，例如，使用细胞分选。第一个系统使用单个载体，其中rna指导的核酸酶(例如，cas9核酸酶或mad7核酸酶)和来自同一mrna的gfp共表达，以及双质粒系统，其中rna指导的核酸酶在单独的载体上表达。本文描述的单个载体系统包含用于核酸酶-gfpmrna体外转录的t7启动子(图10)。[0307]经由gfp表达进行检测和富集的能力显著减少了基因组编辑应用中与单细胞克隆和基因分型相关的劳动和成本。下面的数据集说明了我们的单个载体系统可以如何用于低水平和高水平切割的表达监测和facs富集。特别地，单个质粒gfp形式确保了所有所需的crispr/核酸酶组分(例如mad7和grna编码序列)被有效地递送到gfp阳性细胞。[0308]基于gfp表达将细胞级分分为低池、中池和高池，并观察插入缺失活性的相应的增加。对于靶向kras基因座的grna，当比较未分选群体与具有最高gfp表达的前2％的细胞时，观察到插入缺失活性的4倍增加(参见图13a和图13b)。当最初针对基因靶进行核酸酶筛选时，并不是所有靶向grna设计都能产生可检测到的插入缺失活性，并且目前的grna设计规则不能基于序列内容或基因组背景预测活性。针对ccr5的grna设计，最初未能产生可检测到的插入缺失，当将其分为低、中、高gfp级分时，可以在中和高gfp级分中检测到插入缺失活性。[0309]gfp报告物允许快速检测转染效率，节省了与下游表达定量测定相关的时间和成本。该测定还允许快速排除与特定细胞类型相关的质粒递送和表达问题。如果尽管进行了重复尝试，但在特定的细胞类型中仍无法观察到gfp表达和核酸酶插入缺失活性，则使用核酸酶-gfpmrna可以规避启动子/细胞类型的不相容性。[0310]实施例iv：gfp到bfp转换测定[0311]使用具有稳定整合的gfp基因的基因组拷贝的哺乳动物细胞(hek293t-gfp)创建了gfp到bfp的报告细胞系。这些细胞系使得能够通过各种不同的机制(包括流式细胞术，荧光细胞成像，以及通过对基因组整合的gfp基因测序进行基因型检测)对不同类别的基因组编辑(nhej、hdr、无编辑)进行表型检测。gfp基因缺乏编辑或完全修复切割事件导致细胞保持gfp阳性。通过非同源末端连接(nhej)途径修复的切割事件往往导致核苷酸插入或缺失事件(indel)，从而导致编码序列的移码突变，造成gfp基因表达和荧光的损失。使用gfp到bfp的hdr供体作为修复模板，通过同源指导修复(hdr)途径修复的切割事件，导致细胞荧光谱从gfp荧光谱到bfp荧光谱的转换。通过facs测量的基因编辑前后gfp和bfp荧光的实例在图14a和图14b中示出。[0312]实施例v：使用facs针对编辑盒摄取进行thy1.2介导的富集[0313]将具有稳定整合的gfp基因拷贝的细胞(hek293t-gfp)用表达mad7核酸酶的质粒和gfp到bfp编辑盒质粒(该质粒还驱动细胞表面配体thy1.2表达)进行共同核转染。thy1.2是在小鼠胸腺细胞上表达并且不存在于任何人类细胞上的细胞表面蛋白。因此，thy1.2是用于鉴定已经接收提供thy1.2表达所必需的编辑机构的人类细胞的独特报告物。[0314]简言之，在4d核转染仪x单元(lonza,morristown,nj)上使用程序cm-130，在20μlnucleocuvette中，用200ngmad7表达质粒和200ng表达thy1.2的gfp到bfp编辑盒对2×105个细胞进行核转染。[0315]核转染后24小时，用与荧光团藻红蛋白(pe)缀合的抗thy1.2抗体标记细胞。然后在facsmelody(bectondickenson,franklinlakes,nj)上使用荧光激活细胞分选(facs)分析来富集抗体标记的细胞，以分离thy1.2阴性细胞与表达低量或高量的thy1.2的细胞(图15)。将facs分选的亚群以及未富集的对照样品铺在24孔组织培养皿的单独孔中，并允许经历基因编辑。接收精确的hdr介导的两碱基交换的细胞展示出gfp到bfp的转换表型。[0316]转染后120小时，通过facs分选针对thy1.2表达进行富集的细胞亚群的gfp或bfp的表达水平通过facs进行分析。在facs点状图的gfp阳性(野生型或无编辑)、gfp阴性(nhej介导的插入或缺失移码)、或bfp阳性(hdr介导的gfp到bfp序列的精确转换)象限中的细胞计数百分比被定量并在样品间进行比较(图17)。未富集群体为83％gfp阳性(wt)，17％gfp和bfp阴性(nhej)，和1％bfp阳性(hdr)。通过facs针对编辑盒摄取和thy1.2表达富集的细胞为15％-68％gfp阳性(wt)、30％-74％gfp和bfp阴性(nhej)和2％-10％bfp阳性(hdr)，这取决于低表达或高表达群体是否被特异性地富集。[0317]实施例vi：使用macs针对编辑盒摄取进行thy1.2介导的富集[0318]使用磁激活细胞分选(macs)分析的如上文实施例v中描述的富集方法显示出非常相似的效率。如上所述，将具有稳定整合的gfp基因拷贝的细胞(hek293t-gfp)用表达mad7核酸酶的质粒和gfp到bfp编辑盒质粒(该质粒还驱动细胞表面配体thy1.2表达)进行共同核转染。简言之，在4d核转染仪x单元(lonza,morristown,nj)上使用程序cm-130，在20μlnucleocuvette中，用200ngmad7表达质粒和200ng表达thy1.2的gfp到bfp编辑盒对2×105个细胞进行核转染。[0319]核转染后24h，用抗thy1.2磁珠标记细胞，并根据制造商的方案在macs柱(miltenyibiotec,sunnyvale,ca)上进行纯化。用抗thy1.2-pe荧光抗体标记来自macs柱流通级分、柱洗涤级分和磁纯化的洗脱级分的细胞样品以及富集前的对照，并通过facs分析thy1.2表达水平。在所测试的条件下，macs纯化特异性地富集了具有最高thy1.2表达水平的细胞亚群，如通过thy1.2-pe标记测量的(图16a-图16e)。将来自macs纯化的流通级分、洗涤级分和洗脱级分的细胞以及未富集的对照铺在24孔组织培养皿的单独孔中，并允许经历基因编辑和gfp到bfp转换。[0320]转染后120小时，通过macs珠针对thy1.2表达进行富集的细胞亚群的gfp或bfp的表达水平通过facs进一步分析。在facs点状图的gfp阳性(野生型或无编辑)、gfp阴性(nhej介导的插入或缺失移码)、或bfp阳性(hdr介导的gfp到bfp序列的精确转换)象限中的细胞计数百分比被定量并在样品间进行比较(图17)。未富集群体为80％gfp阳性(wt)，17％gfp和bfp阴性(nhej)，和1％bfp阳性(hdr)。通过macs富集编辑盒摄取和thy1.2表达的细胞为15％-35％gfp阳性(wt)、57％-74％gfp和bfp阴性(nhej)和8％-10％bfp阳性(hdr)。[0321]具有最高thy1.2表达水平的独特细胞群体，无论是通过facs还是macs富集的，都具有显著较高的总编辑率，而且具有较高的hdr与nhej比率。另外，未编辑的gfp阳性细胞群体已显著减少。实施例iv和实施例v在此描述的方法使得使用者能够获得具有高得多的比例的具有预期编辑的细胞和较少的未编辑的细胞的细胞群体。[0322]实施例vii：使用facs针对编辑盒摄取进行δtetherin-ha介导的富集[0323]将具有稳定整合的gfp基因拷贝的细胞(hek293t-gfp)用表达mad7核酸酶的质粒和gfp到bfp编辑盒质粒(该质粒也驱动细胞表面配体tetherin的表达，该tetherin已被工程化为含有另外的his-标签和使蛋白无功能的缺失)进行共同核转染。所用的δtetherin-ha是含有使分子无功能的缺失的细胞表面代替物手柄。[0324]简言之，在4d核转染仪x单元(lonza,morristown,nj)上使用程序cm-130，在20μlnucleocuvette中，用200ngmad7表达质粒和200ng表达δtetherin-ha的gfp到bfp编辑盒对2×105个细胞进行核转染。[0325]核转染后24小时，用与荧光团藻红蛋白(pe)缀合的抗ha抗体标记细胞。然后使用facsmelody(bectondickenson,franklinlakes,nj)富集抗体标记的细胞，以分离δtetherin-ha阴性细胞与表达低量或高量δtetherin-ha的细胞。将facs分选的亚群以及未富集的对照样品铺在24孔组织培养皿的单独孔中，并允许经历基因编辑。接收精确的hdr介导的编辑的细胞展示出gfp到bfp的转换表型。[0326]转染后120小时，通过facs分选或macs珠针对δtetherin-ha表达进行富集的细胞亚群的gfp或bfp的表达水平通过facs进行分析。在facs点状图的gfp阳性(野生型或无编辑)、gfp阴性(nhej介导的插入或缺失移码)、或bfp阳性(hdr介导的gfp到bfp序列的精确转换)象限中的细胞计数百分比被定量并在样品间进行比较(图18)。未富集群体为42％gfp阳性(wt)，54％gfp和bfp阴性(nhej)，和4％bfp阳性(hdr)。通过facs或macs针对编辑盒摄取和δtetherin-ha表达富集的细胞为2％-23％gfp阳性(wt)、70％-82％gfp和bfp阴性(nhej)、和7％-16％bfp阳性(hdr)，这取决于低表达或高表达群体是否被特异性富集。具有最高δtetherin-ha表达水平的独特细胞群体具有显著较高的总编辑率，而且具有较高的hdr与nhej比率。另外，未编辑的gfp阳性细胞群体已显著减少。该方法使得使用者能够获得具有高得多的比例的具有预期编辑的细胞和较少的未编辑的细胞的细胞群体。[0327]实施例viii：用于富集具有较高报告物表达率和编辑率的细胞亚群的受体特异性磁珠的滴定[0328]将具有稳定整合的gfp基因拷贝的细胞(hek293t-gfp或hap1-gfp)用表达mad7核酸酶的质粒和gfp到bfp编辑盒质粒(该质粒还驱动细胞表面配体δtetherin-ha或thy1.2的表达)进行共同核转染。简言之，在4d核转染仪x单元(lonza,morristown,nj)上对hek293t使用程序cm-130或对hap1-gfp使用程序ds-120，在20μlnucleocuvette中，用200ngmad7表达质粒和200ng表达δtetherin-ha或thy1.2的gfp到bfp编辑盒对2×105个细胞进行核转染。[0329]核转染后24小时，用递增量的抗thy1.2磁珠或抗ha磁珠标记细胞，并根据制造商的方案在磁激活细胞分选(macs)柱(miltenyi)上进行纯化。当macs珠的量增加9μl珠/100μl总富集反应体积时，具有高受体表达和低受体表达的纯化细胞的相对量发生变化。对表达thy1.2的hek293t-gfp细胞(图19a和图19b)和表达δtetherin-ha的hap1-gfp细胞(图20a和图20b)的富集都观察到该现象。[0330]将使用不同量的thy1.2特异性macs珠针对编辑机构摄取进行富集的hek293t-gfp细胞重新铺到24孔组织培养板中，并允许经历基因编辑和gfp到bfp的转换。随着珠的量增加，具有不精确编辑(gfp和bfp阴性)和精确编辑(bfp阳性)的细胞比例相应增加(图21)。我们还使用facs特异性地富集表达高δtetherin-ha水平的hap1细胞。与thy1.2报告物系统类似，相对于表现出8％插入缺失和未检测到hdr的未富集的对照，针对高δtetherin-ha表达水平富集的细胞具有相对更高的nhej介导的编辑率(48％)和hdr介导的编辑率(1％)(图22)。[0331]实施例ix.针对hdr介导的敲入编辑进行富集。[0332]如上所述，将具有稳定整合的gfp基因拷贝的细胞(hek293t-gfp)用表达mad7核酸酶和介导将六个碱基对插入dnmt3b基因中的编辑盒的一种质粒和具有gfp到bfp编辑盒的第二质粒(该质粒还驱动细胞表面配体thy1.2的表达)进行共同核转染。[0333]简言之，在4d核转染仪x单元(lonza,morristown,nj)上使用程序cm-130，在20μlnucleocuvette中，用200ngmad7表达质粒和200ng表达thy1.2的gfp到bfp编辑盒对2×105个细胞进行核转染。[0334]核转染后24小时，用抗thy1.2磁珠标记细胞，并根据制造商的方案在macs柱(miltenyibiotec,sunnyvale,ca)上进行纯化。还用抗thy1.2-pe荧光抗体标记细胞，并通过facs富集高水平thy1.2表达的细胞。将来自macs富集或facs富集或未富集的对照的细胞铺在24孔组织培养皿的单独孔中，并允许经历基因编辑。[0335]转染后120小时，使用qiagendneasy血液和组织试剂盒(velmo,netherlands)从富集或未富集细胞的每个亚群中纯化基因组dna。首先，用引物在编辑盒质粒上跨180个碱基对的同源臂区的区域之外通过pcr扩增dnmt3b基因的613个碱基对片段。进行第二pcr反应来扩增dnmt3b基因的180个碱基对区域，该区域包含mad7-grna复合物靶向的区域和编辑盒上的hdr供体靶向的6个碱基插入。使用illuminatruseqdna样品制备试剂盒根据造商的说明书对这些pcr扩增子进行制备。使用illuminamiseq使用2x300试剂盒(illumina,sandiego,ca)对样品进行测序。使用定制的ngs分析和测序读段比对流程(pipeline)进行ngs分析，以根据与dnmt3b(wt)、具有完全或部分的靶向的6个碱基插入的dnmt3b(hdr_完全或hdr_部分)或含有插入或缺失(indel或nhej)的dnmt3b序列的序列同一性，对读段计数分箱。通过facs针对编辑盒摄取进行富集的细胞具有9.8％完全的预期的hdr介导的敲入编辑、1.1％部分hdr编辑和73.9％插入缺失(图24)。通过macs针对盒摄取进行富集的细胞具有插入或缺失(indel)。通过macs针对编辑盒摄取进行富集的细胞具有11.2％完全的预期的hdr介导的敲入编辑、1.3％部分hdr编辑和78.4％插入缺失。相比之下，未进行任何富集的细胞表现出4.2％完全的预期的hdr介导的敲入编辑、0.5％部分hdr编辑和51.8％插入缺失。(图24)。[0336]具有最高水平thy1.2摄取报告物表达的独特细胞群体，无论是通过facs还是macs富集的，都具有显著较高的总编辑率，而且在dnmt3b基因座处具有较高的hdr介导的敲入与nhej的比率。另外，未编辑的细胞群体已显著减少(图24)。[0337]实施例x：create融合编辑[0338]create融合编辑是使用具有逆转录酶活性的核酸切口酶融合蛋白与编码grna的核酸的新颖技术，该grna包含与一个或更多个细胞中的核酸的靶区互补的区域，该grna与编辑盒共价连接，该编辑盒包含与一个或更多个细胞中的靶区同源的区域，该区域相对于一个或更多个细胞中的靶区具有至少一个核苷酸的突变和前间区邻近基序(pam)突变。为了测试create融合编辑在hek293t细胞中的可行性，设计了两种编辑载体，如图25中示出的。[0339]在第一种设计中，将源自ii型crispr酶的切口酶在c-末端与工程化逆转录酶(rt)融合，并克隆到cmv启动子下游。在这种情况下，所用的rt源自moloney鼠白血病病毒(m-mlv)。该设计被称为create融合编辑器2.1(cfe2.1)，并允许切口酶和m-mlvrt融合蛋白的强表达。在cfe2.2中，还在cfe2.1的c末端增加了富集手柄(t2a-dsred)。富集手柄允许选择表达切口酶和rt融合蛋白的细胞。[0340]rna引导被设计成与接近egfp到bfp编辑位点的单个区域互补。将create融合grna在3’末端延伸以包括包含ty至sh编辑的13bp的区域和与被切口的egfpdna序列互补的13bp的第二区域(图26)。这允许被切口的基因组dna与grna的3’末端退火，然后它可以被rt延伸以将编辑掺入基因组。第二种grna靶向egfpdna序列中的位于编辑位点上游86bp的区域。这种grna被设计成使得它实现使切口酶切割相对于create融合grna的相对链。这两种grna均克隆到u6启动子的下游。还包括终止grna的转录的多t序列。[0341]所进行的示例性实验过程的流程图在图27中示出。[0342]将质粒转化到neb稳定大肠杆菌(ipswich,ny)中，并使其在2mllb培养基中过夜生长。次日，使用qiagenmidiprep试剂盒(venlo,netherlands)从大肠杆菌纯化质粒。然后用rna酶a(thermofisher,waltham,mass)处理纯化的质粒，并使用dna清洁和浓缩试剂盒(zymo,irvine,ca)再次纯化。[0343]在补充有10％fbs和1×青霉素和链霉素的dmem培养基中培养hek293t细胞。将100ng总dna(50nggrna质粒和50ngcfe质粒)与1μlpolyfect(qiagen,venlo,netherlands)在96孔板中的25μloptimem中混合。将复合物孵育10分钟，并且然后将重悬于100μldmem的20,000个hek293t细胞添加到混合物中。然后将得到的混合物在37℃和5％dsred阳性细胞百分比报告的(图30)。使用基于dsred荧光强度的电子门控将细胞分选为三个群体：dsred_全部、dsred_低或dsred_高(图31)。将facs分选的亚群以及未富集的对照样品铺在24孔组织培养皿的单独孔中，并允许经历基因编辑。接收敲入编辑的细胞展示出gfp到bfp的转换表型。[0354]核转染后120小时，通过facs分选针对dsred表达进行富集的细胞亚群(其指示针对create融合编辑机构的存在进行的富集)的gfp或bfp的表达水平通过facs进行分析。在facs点状图的gfp阳性(野生型或无编辑)、gfp阴性(nhej介导的插入或缺失移码)、或bfp阳性(hdr介导的gfp到bfp序列的精确转换)象限中的细胞计数百分比被定量并在样品间进行比较(图32)。对于基于mad7的编辑，未富集的群体为89％gfp阳性(wt)、10％gfp和bfp阴性(nhej)和1％bfp阳性(hdr)。针对mad7连接的dsred表达进行富集的细胞为14％-16％gfp阳性(wt)、21％-78％gfp和bfp阴性(nhej)和3％-9％bfp阳性(hdr)，这取决于被选择进行分选的dsred亚群(dsred_全部、dsred_低或dsred_高)。对于基于create融合的编辑，未富集群体为87％gfp阳性(wt)、3％gfp和bfp阴性(nhej)和9％bfp阳性(hdr)。针对mad7连接的dsred表达进行富集的细胞为25％-55％gfp阳性(wt)、4％-7％gfp和bfp阴性(nhej)和25％-68％bfp阳性(hdr)，这取决于被选择进行分选的dsred亚群(dsred_全部、dsred_低或dsred_高)。这些结果表明，对于mad7-create和create-融合编辑系统二者，针对编辑机构摄取进行富集可以产生具有较高比例的含有精确编辑的细胞的细胞群体。[0355]实施例xii：使用单个grna的create融合编辑[0356]使用共价连接到同源臂的单个引导rna在哺乳动物细胞中进行create融合编辑，该同源臂具有对天然序列的预期编辑和在该位点处破坏核酸酶裂解的编辑。基本方案在图32中阐述。[0357]简言之，使用以下方案产生慢病毒载体：在6孔板中，使用lipofectamineltx将含有create融合盒的1000ng慢病毒转移质粒(图23和图24)连同1500ng慢病毒包装质粒(virasafe慢病毒包装系统，cellbiolabs)转染到hek293t细胞中。转染后72hr收集含有慢病毒的培养基。选择慢病毒create融合grna-ha设计的两个克隆，并且空的慢病毒骨架被包括在内作为阴性对照。[0358]转导前一天，将20,000个hek293t细胞接种在6孔板中。将不同体积的create’慢病毒(10μl至1000μl)连同10μg/ml的聚凝胺添加到6孔板中的hek293t细胞。转导48小时后，将含有15μg/ml杀稻瘟素的培养基添加到孔中。将细胞在选择中维持一周。选择后，选择具有最低存活细胞数的孔(《5％细胞)用于之后的实验。[0359]使用neon转染系统(thermofisherscientific,waltham,ma)将构建体cfe2.1、cfe2.2(如图25中示出)或野生型spcas9电穿孔到hek293t细胞中。简言之，将400ng总质粒dna与缓冲液r中的100,000个细胞以15μl的总体积混合。使用10μlneon吸头用20ms和1150v的2次脉冲对细胞进行电穿孔。电穿孔后80hr，在流式细胞仪上对细胞进行分析。[0360]如图34a和图34b中示出的，由grna的单个拷贝递送实现了高达15％的未富集编辑率。[0361]然而，当编辑与rfp+细胞的计算选择相组合时，由grna的单个拷贝递送实现了高达30％的富集编辑率。这种通过选择接收编辑机构的细胞进行的富集被显示导致精确、完全的预期编辑增加至2倍(图35)。两个或更多个富集/递送步骤也可用于在自动化仪器(例如，使用用于细胞手柄富集和鉴定具有bfp表达的细胞的模块)中实现create融合编辑的更高编辑率。当该方法富集具有较高grna表达水平的细胞时，编辑率甚至进一步增加，并且因此仪器的生长和/或富集模块可以包括grna富集。[0362]实施例xiii：可追溯的create融合编辑双盒架构[0363]将create融合系统的增强的编辑效率和降低的毒性与追溯或记录技术进行组合，提供了使用create融合编辑对以大规模并行或组合形式进行的大型基因组文库实施追溯的新颖方法。对本公开内容的方法有用的这样的记录技术的实例包括uspn10,017,760、uspn10,294,473和uspn10,287,575中描述的那些，出于所有目的，将这些uspn各自通过引用并入本文。[0364]该方法可以如何实施的简单实例在图35a和图35b中示出。包括切口酶和rt活性的create融合酶作为双create盒融合系统在同一质粒或扩增子上编码(图35a)。create盒1编码grna-ha靶向序列，这些序列在转录成rna后对在染色体中感兴趣的功能位点处引导基于切口翻译的编辑是必需的。create盒2编码第二grna-ha组，其靶向惰性第二位点(例如作为一个可能的位置，假基因的3’utr)以整合对于每个靶位点变体是独特的dna条形码。[0365]在该示例性实施方案中，每个编辑盒内的共价偶联的grna-ha元件发挥作用以在每个切口位点处共定位rna以进行有效的逆转录，来驱动每个基因座处的编辑过程。同时，盒之间的共价偶联确保两种编辑在单细胞水平上高度相关。create盒2中编码的条形码序列的独特身份，在被整合后，由此用作可追溯的基因组条形码，该基因组条形码可以基于对固定染色体位置的测序或其他分子读取来报告遍及基因组中的编辑的身份。这种条形码化方法将下游群体测序的复杂性减化为简单的pcr扩增子测序测定。[0366]作为另外的实例，这种记录逻辑可以通过包括另外的create盒进一步扩展为覆盖单细胞内的组合编辑(图35b)。在此，记录位点和独特的条形码被维持，但编辑位点涵盖同一细胞内的≥2个靶。在这种情况下，条形码现在提供对单细胞水平上的组合编辑事件的报告，并允许使用可追溯的条形码特征对组合编辑的细胞群体进行追溯和计算去卷积的适应性。[0367]虽然本发明通过许多不同形式的实施方案来满足，但是如结合本发明的优选的实施方案详细描述的，应理解本公开内容应被认为是对本发明的原理的示例而不意在将本发明局限于本文说明和描述的具体实施方案。本领域的技术人员可以作出许多变化而不脱离本发明的精神。本发明的范围将通过所附的权利要求和它们的等同物判断。摘要和标题不应被解释为限制本发明的范围，因为它们的目的是使适当的机构以及一般公众能够迅速确定本发明的一般性质。在所附权利要求书中，除非使用术语“手段(means)”，否则其中列举的特征或要素都不应该被解释为根据35u.s.c.§112,的手段加功能的限定。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种细胞文库，所述细胞文库使用用于核酸酶指导的基因组编辑的自动化编辑系统创建，其中所述系统包括：壳体；容器，其被配置成接收细胞和一种或更多种合理设计的核酸，所述一种或更多种合理设计的核酸包含促进所述细胞中切口酶指导的基因组编辑事件的序列；转化单元，用于将所述一种或更多种核酸引入所述细胞；编辑单元，用于允许在所述细胞中发生所述切口酶指导的基因组编辑事件，富集模块；以及基于处理器的系统，其被配置成基于使用者输入来操作仪器；其中由所述自动化系统创建的所述切口酶指导的基因组编辑事件产生包含具有合理设计的编辑的个体细胞的细胞文库。2.根据权利要求1所述的细胞文库，其中所述细胞中所述切口酶指导的基因组编辑事件创建饱和诱变细胞文库。3.根据权利要求1所述的细胞文库，其中所述细胞中所述切口酶指导的基因组编辑事件创建启动子交换细胞文库。4.根据权利要求1所述的细胞文库，其中所述细胞中所述切口酶指导的基因组编辑事件创建终止子交换细胞文库。5.根据权利要求1所述的细胞文库，其中所述细胞中所述切口酶指导的基因组编辑事件创建snp交换细胞文库。6.根据权利要求1所述的细胞文库，其中所述细胞中所述切口酶指导的基因组编辑事件创建启动子交换细胞文库。7.根据权利要求1所述的细胞文库，其中所述切口酶指导的基因组编辑使用rna指导的切口酶进行。8.根据权利要求1所述的细胞文库，其中所述切口酶指导的基因组编辑使用切口酶融合蛋白进行。9.根据权利要求7所述的细胞文库，其中所述切口酶指导的基因组编辑包括使用rna指导的切口酶和单独的逆转录酶蛋白。10.一种细胞文库，所述细胞文库使用用于切口酶指导的基因组编辑的自动化编辑系统创建，其中所述系统包括：壳体；细胞容器，其被配置成接收细胞；核酸容器，其被配置成接收一种或更多种合理设计的核酸，所述一种或更多种合理设计的核酸包含促进所述细胞中切口酶指导的基因组编辑事件的序列；转化单元，用于将所述一种或更多种核酸引入所述细胞；编辑单元，用于允许在所述细胞中发生所述切口酶指导的基因组编辑事件，以及基于处理器的系统，其被配置成基于使用者输入来操作仪器；其中由所述自动化系统创建的所述切口酶指导的基因组编辑事件产生包含具有合理设计的编辑的个体细胞的细胞文库。11.根据权利要求10所述的细胞文库，其中所述细胞中所述切口酶指导的基因组编辑
事件创建饱和诱变细胞文库。12.根据权利要求10所述的细胞文库，其中所述细胞中所述切口酶指导的基因组编辑事件创建启动子交换细胞文库。13.根据权利要求10所述的细胞文库，其中所述细胞中所述切口酶指导的基因组编辑事件创建终止子交换细胞文库。14.根据权利要求10所述的细胞文库，其中所述细胞中所述切口酶指导的基因组编辑事件创建snp交换细胞文库。15.根据权利要求10所述的细胞文库，其中所述细胞中所述切口酶指导的基因组编辑事件创建启动子交换细胞文库。16.根据权利要求10所述的细胞文库，其中所述切口酶指导的基因组编辑使用rna指导的切口酶进行。17.根据权利要求10所述的细胞文库，其中所述切口酶指导的基因组编辑使用切口酶融合蛋白进行。18.根据权利要求10所述的细胞文库，其中所述切口酶指导的基因组编辑包括使用rna指导的切口酶和单独的逆转录酶蛋白。19.一种细胞文库，所述细胞文库使用用于递归的切口酶指导的基因组编辑的自动化编辑系统创建，其中所述系统包括：壳体；接收细胞和一种或更多种合理设计的核酸的装置，所述一种或更多种合理设计的核酸包含促进所述细胞中切口酶指导的基因组编辑的序列；用于将所述一种或更多种核酸引入所述细胞的装置；用于富集接收所述一种或更多种核酸的细胞的装置；用于允许所述切口酶指导的基因组编辑事件发生的装置，用于经编辑的细胞生长的装置；用于浓缩经编辑的细胞的装置；用于收集经编辑的细胞的装置；以及用于基于使用者输入配置所述系统的操作的装置；其中所述切口酶指导的基因组编辑事件在所述自动化系统中重复两次或更多次以创建包含具有两个或更多个合理设计的编辑的个体细胞的细胞文库。20.根据权利要求19所述的细胞文库，其中用于创建所述细胞文库的所述自动化系统还包括用于选择所述经编辑的细胞的装置。21.一种自动化多模块细胞编辑仪器，包括：壳体，其被配置成容纳全部模块或所述模块中的一些；被配置成接收细胞的容器；被配置成接收核酸和/或蛋白的一个或更多个容器，其中所述核酸和/或蛋白包含编辑机构；编辑机构引入模块，其被配置成将所述核酸和/或蛋白引入所述细胞；编辑模块，其被配置成允许引入的核酸编辑所述细胞中的核酸；富集模块，其富集接收所述编辑机构的细胞；
处理器，其被配置成基于使用者输入和/或预编程脚本的选择来操作所述自动化多模块细胞编辑仪器；以及自动化液体操作系统，其将细胞从被配置成接收细胞的所述容器移动到所述编辑机构引入模块，从所述编辑机构引入模块移动到所述编辑模块，以及从所述编辑模块移动到所述富集模块；以及将核酸和/或蛋白移动到所述编辑机构引入模块，所有这些都无需使用者干预。22.根据权利要求21所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中所述一个或更多个容器中的所述核酸包括骨架和编辑盒，所述自动化多模块细胞编辑仪器还包括核酸组装模块。23.根据权利要求21所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中所述富集模块使用facs富集接收所述编辑机构的细胞。24.根据权利要求21所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中所述富集模块使用macs富集接收所述编辑机构的细胞。25.根据权利要求21所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中所述编辑模块还包括在引入所述编辑机构之后的恢复模块。26.根据权利要求21所述的自动化多模块细胞编辑仪器，还包括被配置成使所述细胞生长的生长模块。27.根据权利要求26所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中所述生长模块测量生长细胞的光密度。28.根据权利要求27所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中光密度被连续测量。29.根据权利要求26所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中所述处理器被配置成调整所述生长模块中的生长条件，使得所述细胞在使用者要求的时间达到靶光密度。30.根据权利要求21所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中被配置成接收细胞的所述容器和被配置成接收核酸的所述一个或更多个容器被包含在试剂匣内。31.根据权利要求30所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中细胞编辑所需的一些或全部试剂被包含在所述试剂匣内。32.根据权利要求31所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中被包含在所述试剂匣内的所述试剂能够通过由所述处理器读取的脚本定位。33.根据权利要求32所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中所述试剂匣包含试剂，并且所述试剂匣以套件形式提供。34.根据权利要求21所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中所述编辑机构引入模块包括电穿孔装置。35.根据权利要求34所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中所述电穿孔装置是流通式电穿孔装置。36.根据权利要求21所述的自动化多模块细胞编辑仪器，还包括过滤模块，所述过滤模块被配置成浓缩所述细胞并使所述细胞成为电感受态。37.一种自动化多模块细胞编辑仪器，包括：壳体，其被配置成容纳全部模块或所述模块中的一些；容器，其被配置成接收细胞、核酸和/或蛋白，其中所述核酸和/或蛋白包含编辑机构；编辑机构引入模块，其被配置成将所述核酸和/或蛋白引入所述细胞；
编辑模块，其被配置成允许引入的核酸和/或蛋白编辑所述细胞中的核酸；富集模块，其富集接收所述编辑机构的细胞；处理器，其被配置成基于使用者输入和/或预编程脚本的选择来操作所述自动化多模块细胞编辑仪器；以及自动化液体操作系统，其将细胞从被配置成接收细胞的所述容器移动到所述编辑机构引入模块，从所述编辑机构引入模块移动到所述编辑模块，以及从所述编辑模块移动到所述富集模块；以及将核酸和/或蛋白移动到所述编辑机构引入模块，所有这些都无需使用者干预。38.根据权利要求37所述的自动化多模块细胞编辑仪器，还包括至少一个试剂匣，所述试剂匣包含在所述自动化多模块细胞编辑仪器中进行细胞编辑的试剂。39.根据权利要求38所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中用于细胞和核酸的所述容器被设置在所述试剂匣内。40.一种自动化多模块细胞编辑仪器，包括：壳体，其被配置成容纳模块中的一些或全部模块；被配置成接收细胞的容器；被配置成接收核酸的至少一个容器，其中所述核酸包含编辑机构；生长模块，其被配置成使所述细胞生长；过滤模块，其被配置成浓缩所述细胞并使所述细胞成为电感受态；转化模块，其包括将所述核酸引入所述细胞的流通式电穿孔器；组合的恢复和编辑模块，其被配置成允许所述细胞在所述转化模块中进行电穿孔后恢复，并允许所述核酸编辑所述细胞；富集模块，其富集接收所述编辑机构的细胞；处理器，其被配置成基于使用者输入和/或预编程脚本的选择来操作所述自动化多模块细胞编辑仪器；以及自动化液体操作系统，其将细胞从被配置成接收细胞的所述容器移动到所述生长模块；从所述生长模块移动到所述过滤模块，从所述过滤模块移动到所述转化模块，从所述转化模块移动到所述组合的恢复和编辑模块，以及从所述组合的恢复和编辑模块移动到所述富集模块；以及将核酸从被配置成接收核酸的所述容器移动到所述转化模块，所有这些都无需使用者干预。

技术总结
本公开内容提供了当采用核酸引导的编辑时增加细胞群体中经编辑的哺乳动物细胞的百分比的组合物、自动化多模块仪器和方法。自动化多模块仪器和方法。自动化多模块仪器和方法。


技术研发人员：阿米尔
受保护的技术使用者：因思科瑞普特公司
技术研发日：2021.01.10
技术公布日：2022/11/1