1.本发明属于生物医学领域的一种靶向多肽及其用途，具体是涉及了一种能够靶向黑色素瘤的新型多肽及其用途。
背景技术：2.噬菌体展示技术是将编码外源多肽或蛋白质的dna序列通过基因工程插入到噬菌体基因，从而在噬菌体衣壳蛋白表面展示多肽或蛋白质的技术。大量展示有不同随机多肽的噬菌体可构成噬菌体文库，用于针对特定靶标的筛选，以探究多肽与靶标之间的相互作用。在生物学领域，该技术不仅被广泛的应用于多肽与蛋白质、dna等分子相互作用的研究中，还被应用在多肽靶向组织/器官的研究中。
3.黑色素瘤(melanoma)是一种罕见却极具浸润性的皮肤癌症，是一种从黑色素细胞发展而来的癌症。该肿瘤是皮肤癌当中最危险的一种，其恶性程度高，是皮肤癌的主要死亡原因之一。免疫疗法是转移性黑色素瘤的一线治疗，免疫疗法药物的首选为pd-1或ctla-4抑制剂，患者接受单药治疗或组合疗法。现在市场上的治疗癌症的单克隆抗体药物普遍缺乏靶向性，这不仅会导致疗效变差，还会引起副作用。
技术实现要素：4.本发明的目的在于提供一种与黑色素瘤具有高度亲和力并能够特异性靶向结合黑色素瘤的多肽序列，以及该多肽在靶向治疗领域中的用途，针对体内黑色素瘤和体外黑色素细胞(b16-f10)能够特异性结。
5.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
6.一、一种靶向黑色素瘤的多肽，所述多肽的氨基酸序列为no.1～no.6所示之一。具体如下表：
7.表1氨基酸序列表
[0008][0009][0010]
二、一种生物活性物质，包含所述多肽，包括共价键连接的化合物或纳米颗粒、工程化的噬菌体等微生物、多聚体混合物。
[0011]
该生物活性物质具有与多肽的生物医学功能，即靶向黑色素瘤。
[0012]
三、一种多聚核苷酸序列，能够编码所述的多肽，或者能够编码所述的生物活性物质。
[0013]
四、一种用于治疗疾病的多肽类药物，其特征在于，包含所述的多肽，药物用于靶向黑色素瘤。
[0014]
所述多肽、所述生物活性片段、所述的多聚核苷酸序列、所述的多肽类药物在制备用于肿瘤靶向治疗的生物医学材料和药物中应用。具体是在制备用于通过靶向结合pd-l1蛋白实现肿瘤靶向治疗的生物医学材料和药物中的应用。
[0015]
本发明的有益效果是：
[0016]
本发明通过筛选得到的靶向黑色素瘤的多肽，能够特异性靶向小鼠体内皮下接种的黑色素瘤，而不在其他主要器官富集，和治疗药物联用可以实现肿瘤部位的富集，提高治疗效果并降低药物副作用。
[0017]
相比于蛋白类药物，本发明靶向黑色素瘤的多肽的优势在于：(1)序列短小，合成生产成本低；(2)多肽片段结构稳定，降低了运输保存的成本及难度；(3)可通过多种方式进行给药。在肿瘤靶向治疗领域，为靶向药物的研发开拓了新的思路。
附图说明
[0018]
图1为实施例1中利用噬菌体12肽库对体内黑色素瘤和体外黑色素细胞(b16-f10)交替4轮筛选的过程中，每轮的噬菌体输出量。
[0019]
图2为实施例2中利用dnastar软件对测序结果进行分析后，出现频次较高的6种多肽序列及其相应的频次。
[0020]
图3为实施例2中利用relic软件对子文库信息分布进行分析的结果图。
[0021]
图4为实施例3中通过噬菌体滴度实验探究展示2种亲和力强的多肽序列的噬菌体与黑色素瘤的靶向结合能力。
具体实施方式
[0022]
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的阐述，以下实施例仅为本发明的优选实施例，并不限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0023]
本发明的实施例如下：
[0024]
实施例1利用通过噬菌体展示技术所构建的噬菌体12肽库，针对黑色素瘤特异性结合阳性多肽进行四轮体内/细胞交替筛选。
[0025]
1.1、复苏、培养宿主菌e.coil er2738
[0026]
制备lb固态培养板，置于37℃培养箱中预热1小时。使用挑菌棒，挑取e.coil er2738菌液，以“z”字形涂于lb平板表面，置于37℃培养箱中培养12小时。在摇菌管中加入5ml含有四环素的液态lb培养基中，使用无菌枪头挑取平板中的单克隆菌落，并将枪头置于培养基中。将培养管置于37℃摇床中，220rpm振荡培养，直至细菌处于对数生长中期。
[0027]
1.2、菌液的制备
[0028]
将20ml的lb培养基置于250ml的无菌锥形瓶中，再加入1ml处于对数生长中期的宿主菌e.coil er2738。将锥形瓶置于37℃摇床中，220rpm振荡培养，直至细菌处于对数生长中期。
[0029]
1.3、噬菌体滴度的测定
[0030]
将lb/iptg/xgal平板置于37℃培养箱中预热1小时。将噬菌体溶液进行梯度稀释，取10μl稀释后的噬菌体溶液加入200μl处于对数生长期的e.coil er2738菌液中。静置15min。将感染后的噬菌体加到lb/iptg/xgal平板表面，使用无菌涂覆棒均匀涂开。将涂好的平板倒置于37℃培养箱中，过夜培养。第二天检查平板上的噬菌体蓝斑并计数。
[0031]
1.4、噬菌体的扩增及纯化
[0032]
将中和后的噬菌体洗脱液加入20ml处于对数生长期的e.coil er2738菌液中。室温静置20min后，将菌液置于37℃摇床中，220rpm振荡培养4.5小时。之后将菌液倒入50ml离心管中，12000g离心20min。将上清液倒入含有4ml peg/nacl溶液的离心管中，置入4℃冰箱中，过夜沉降。第二天，将该离心管12000g离心20min，弃上清液。在离心管中加入1ml pbs溶液，将沉淀重新溶解，并将重悬液转移至1.5ml ep管中，置于37℃摇床中，振荡1小时。之后将ep管12000g离心10min，并将上清液转移至含有200μl peg/nacl溶液的ep管中。将ep管置于4℃，静置1小时沉降噬菌体。之后将ep管12000g离心20min，弃上清液，加入100μl pbs重悬沉淀。
[0033]
体内筛选
[0034]
1.5、构建小鼠黑色素瘤模型
[0035]
将5
×
105个b16-f10细胞接种到c57bl/6黑色小鼠皮下，构建b16-f10黑色素瘤荷瘤小鼠模型。
[0036]
1.6、心脏灌流洗涤
[0037]
当肿瘤直径达到0.5cm时，经尾静脉注射100μl 2
×
10
12
pfu/ml的噬菌体12肽库。噬菌体文库在小鼠体内循环3小时后，对小鼠进行麻醉。用剪刀在小鼠右心房切开一个小口，然后向其左心室注入20ml生理盐水进行心脏灌流，从而洗掉未与任何组织结合的噬菌体。
[0038]
1.7、将肿瘤组织研磨成匀浆
[0039]
解剖小鼠，摘取黑色素瘤，加入1ml细胞组织裂解液和20μl苯甲基磺酰氟(pmsf)，将黑色素瘤磨成匀浆。将匀浆在1000rpm下离心20min，去除沉淀物，用移液枪轻轻地吸取上清液，加入无菌ep管中。
[0040]
细胞筛选
[0041]
1.8、细胞复苏和培养
[0042]
用dmem/fbs/ps(10％，1％)在25cm2的细胞培养瓶中培养b16-f10黑色素瘤细胞，培养24小时后，细胞数量达到90％。用移液枪将培养基轻轻移出，将5ml不含血清的培养基与细胞进行培养。同时，将10μl噬菌体库和2ml bsa封闭液(0.5％)加入空白培养瓶中孵育。细胞培养瓶和空白瓶都在37℃下放置1小时。
[0043]
1.9、噬菌体12肽库与b16-f10细胞的结合
[0044]
用移液枪吸出细胞培养瓶中的无血清培养基，将空白瓶中含有噬菌体文库的封闭液加入细胞培养瓶中。将细胞培养瓶放在细胞培养箱中孵育1小时。
[0045]
1.10、洗涤
[0046]
使用移液枪将细胞培养瓶的液体吸出，将4ml预冷的洗涤缓冲液(0.1％tween 20和0.5％bsa)加入细胞培养瓶，将细胞培养瓶置于翘板摇床上，5min后吸弃细胞培养瓶中的液体。重复该步骤10次，从而彻底洗净培养瓶中与b16-f10细胞不结合或结合不牢固的噬菌
体。
[0047]
1.11、洗脱及中和
[0048]
使用移液枪将细胞培养瓶中的液体洗净，然后向细胞培养瓶中加入800μl洗脱缓冲液(1mg ml-1
bsa，0.1m甘氨酸，ph＝2.2)，在冰上培养15分钟，向混合物中加入200μl tris-hcl以中和洗脱液。
[0049]
1.12、交替重复体内筛选和细胞筛选
[0050]
按照相同的步骤进行第一轮体内筛选、第二轮细胞筛选、第三轮体内筛选及第四轮细胞筛选，将每一轮扩增纯化后的噬菌体溶液作为下一轮筛选的次级噬菌体肽库。每一轮筛选的噬菌体投入量保持一致，测定每轮筛选洗脱产物的滴度作为每轮噬菌体输出量分别为22.72
×
105,2.14
×
105，30.2
×
105，6.5
×
105并计算每轮噬菌体的输出/投入比分别为11.36
×
10-6
，1.07
×
10-6
，15.1
×
10-6
，3.25
×
10-6
。
[0051]
噬菌体输出结果如图1所示，图1为利用噬菌体12肽库进行体内黑色素瘤筛选和体外b16-f10细胞筛选实验结果图。实验结果显示在同样的噬菌体投入量下，两轮体内筛选和两轮体外筛选获得的噬菌体输出逐轮递增，表明与黑色素瘤亲和性强的噬菌体得到有效富集。
[0052]
1.13、噬菌体阳性单克隆
[0053]
将第三轮及第四轮的洗脱产物进行滴度测定。选择噬菌斑个数为30～300个的平板，随机挑取85个噬菌体蓝斑，加入85个含5ml lb培养基的摇菌管中，37℃，220rpm振荡培养24小时。每个单克隆取700μl培养物加入含300μl甘油(50％)溶液的ep管中，混匀后放入-80℃冰箱保存。剩余菌液进行测序处理。
[0054]
测试2：分析噬菌体单克隆的dna序列。
[0055]
使用dnastar软件分析多肽的氨基酸序列，利用relic软件对子文库信息分布进行分析。
[0056]
多肽的氨基酸序列具体分别为包含有sntalpskfygy序列、inqdartmvmvp序列、asvasggwnphr序列、dhaqrygaghsg序列、dlpvnsvifpfr序列、lsvpwgprdnnr序列、aafyegvespms序列、ddrsamftplim序列、fnaalpskfygy序列、nhwntlletswl序列等85个测试序列。
[0057]
结果如图2及图3所示。图2为阳性单克隆噬菌体出现频次大于(含等于)2的多肽序列及其重复次数。其中sntalpskfygy和inqdartmvmvp多肽序列的噬菌体出现4次，asvasggwnphr和dhaqrygaghsg多肽序列的噬菌体出现3次，dlpvnsvifpfr和lsvpwgprdnnr多肽序列的出现2次。
[0058]
图3为relic软件对子文库信息分布进行分析，从图中可见第四轮筛选获得的子文库(灰色虚线)相对于原始噬菌体文库(黑色实线)出现明显向上和向右的偏移。
[0059]
测试3：通过噬菌体滴度实验检测阳性噬菌体与黑色素瘤的亲和力。
[0060]
1)构建小鼠黑色素瘤模型
[0061]
将5
×
105个b16-f10细胞接种到c57bl/6黑色小鼠皮下，构建b16-f10黑色素瘤荷瘤小鼠模型。
[0062]
2)心脏灌流洗涤
[0063]
当肿瘤直径达到0.5cm时，经尾静脉注射100μl 2
×
10
12
pfu/ml的噬菌体12肽库。噬
菌体文库在小鼠体内循环3小时后，对小鼠进行麻醉。用剪刀在小鼠右心房切开一个小口，然后向其左心室注入20ml生理盐水进行心脏灌流，从而洗掉未与任何组织结合的噬菌体。
[0064]
3)将组织研磨成匀浆
[0065]
解剖小鼠，摘取黑色素瘤和心、肝、脾、肺、肾等主要器官，测量并记录每个器官的重量。加入1ml细胞组织裂解液和20μl pmsf，将肿瘤和器官磨碎，将匀浆在1000rpm下离心20min，去除沉淀物，用移液枪轻轻地吸取上清液，加入无菌ep管中，收集释放的噬菌体。然后将组织液从103到107分别以100倍梯度稀释。将20μl稀释后的组织液加入180μl中期大肠杆菌(er2738)中，静置半小时使噬菌体侵染大肠杆菌。
[0066]
4)噬菌体滴度的测定
[0067]
将lb/iptg/xgal平板置于37℃培养箱中预热1小时。将噬菌体溶液进行梯度稀释，取10μl稀释后的噬菌体溶液加入200μl处于对数生长期的e.coil er2738菌液中。静置15min。将感染后的噬菌体加到lb/iptg/xgal平板表面，使用无菌涂覆棒均匀涂开。将涂好的平板倒置于37℃培养箱中，过夜培养。第二天检查平板上的噬菌体蓝斑并计数。计算噬菌体的数量：数量＝100
×n×
f/q pfu ml-1
，其中n、f和q分别是平板上噬菌体斑块的数量、稀释系数和器官的重量。将所有实验组不同组织的噬菌体数量除以对应的野生型对照组噬菌体的数量，以获得小鼠主要器官及肿瘤部位的噬菌体相对数量。
[0068]
结果如图4所示，图4为不同实验组噬菌体在不同器官组织中的相对数量。其中inqdartmvmvp噬菌体和sntalpskfygy噬菌体在黑色素瘤中的数量为野生型对照组噬菌体数量的20倍和16倍，远高于随机噬菌体序列(约4倍)，表明inqdartmvmvp噬菌体和sntalpskfygy噬菌体尾静脉注射进入小鼠体内后，在黑色素瘤内明显富集，其富集程度明显高于野生型噬菌体及随机多肽序列噬菌体。此外，实验组噬菌体在心、肝、脾、肺、肾等主要器官中均未表现出明显富集。因此，实验验证该两种多肽序列具有很强的黑色素瘤特异性靶向能力。
[0069]
本发明涉及的氨基酸序列如下：
[0070]
seq id no.1；
[0071]
名称：多肽1的氨基酸序列
[0072]
来源：人工序列(artificial sequence)
[0073]
sntalpskfygy
[0074]
seq id no.2；
[0075]
名称：多肽2的氨基酸序列
[0076]
来源：人工序列(artificial sequence)
[0077]
inqdartmvmvp
[0078]
seq id no.3；
[0079]
名称：多肽3的氨基酸序列
[0080]
来源：人工序列(artificial sequence)
[0081]
asvasggwnphr
[0082]
seq id no.4；
[0083]
名称：多肽4的氨基酸序列
[0084]
来源：人工序列(artificial sequence)
[0085]
dhaqrygaghsg
[0086]
seq id no.5；
[0087]
名称：多肽5的氨基酸序列
[0088]
来源：人工序列(artificial sequence)
[0089]
dlpvnsvifpfr
[0090]
seq id no.6；
[0091]
名称：多肽6的氨基酸序列
[0092]
来源：人工序列(artificial sequence)
[0093]
lsvpwgprdnnr。
技术特征：1.一种靶向黑色素瘤的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为no.1～no.6所示之一。2.一种生物活性物质，其特征在于，包含权利要求1所述的多肽，包括共价键连接的化合物或纳米颗粒、工程化的噬菌体等微生物、多聚体混合物。3.一种多聚核苷酸序列，其特征在于，能够编码权利要求1所述的多肽，或者能够编码权利要求2所述的生物活性物质。4.一种多肽类药物，其特征在于，包含权利要求1所述的多肽。5.权利要求1所述多肽、权利要求2所述生物活性片段、权利要求3所述的多聚核苷酸序列、权利要求4所述的多肽类药物的应用，其特征在于：在制备用于肿瘤靶向治疗的生物医学材料和药物中的应用。6.权利要求5所述的应用，其特征在于：在制备用于通过靶向结合pd-l1蛋白实现肿瘤靶向治疗的生物医学材料和药物中的应用。
技术总结本发明公开了一种能够靶向黑色素瘤的新型多肽及其用途。所述多肽的氨基酸序列分别为：SNTALPSKFYGY、INQDARTMVMVP、ASVASGGWNPHR、DHAQRYGAGHSG、DLPVNSVIFPFR、LSVPWGPRDNNR，能够制备用于通过靶向结合PD-L1蛋白实现肿瘤靶向治疗的生物医学材料和药物。本发明所述多肽能够高效靶向黑色素瘤，同时可以拓展到其他类型的肿瘤，为临床上肿瘤的靶向治疗提供了新的思路。靶向治疗提供了新的思路。靶向治疗提供了新的思路。
技术研发人员：毛传斌 岳慧 杨明英
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2022.06.23
技术公布日：2022/11/1
