土曲霉F6-3及其在制备6-羟基芦荟大黄素-8-甲醚中的应用

土曲霉f6-3及其在制备6-羟基芦荟大黄素-8-甲醚中的应用
(一)技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种皮氏叫姑鱼共附生真菌及其在制备6-羟基芦荟大黄素-8-甲醚(questinol)中的应用，有助于解决高纯度questinol的规模化制备这一难题。
(二)

背景技术：

2.6-羟基芦荟大黄素-8-甲醚(questinol)主要是由散囊菌、柄篮状菌、曲霉、青霉等真菌产生的一种蒽醌类次级代谢产物，分子式为c
16h12
o6,相对分子质量300，难溶于甲醇、二氯甲烷等有机溶剂，其化学结构如式(i)所示：
[0003][0004]
questinol在抗炎、抗菌和肥胖抵抗等方面均表现出了良好的活性。尤其是在抗炎活性方面，questinol不仅可以显著抑制no和pge2的产生，还可以抑制促炎症因子tnf-α、il-1β和il-6的释放。在肥胖抵抗活性方面，questinol可显著减少斑马鱼体内脂质沉积，其药效由于阳性对照药物白藜芦醇，且无明显毒性；构效关系研究表明，questinol结构中c-3位羟甲基，以及c-1和c-6位羟基，可能是其发挥抗肥胖活性的必需基团。可见，questinol在预防和治疗炎症和肥胖等方面非常具有良好的开发前景。
[0005]
目前，questinol的制备方法均为微生物发酵法。然而，在已报道的文献报道中，无论是液体发酵还是固体发酵，questinol的产率都很低。鉴于questinol在真菌中的广泛分布，从真菌中筛选questinol高产菌株，并开发经济、便捷的微生物发酵工艺，对于高纯度questinol的规模化制备具有重要意义。
(三)

技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，另辟蹊径，提供一株新菌株——土曲霉f6-3及其在制备6-羟基芦荟大黄素-8-甲醚(questinol)中的应用，本发明以特殊生境真菌——皮氏叫姑鱼共附生真菌为筛选对象，经过大量的创造性实验，筛选得到土曲霉f6-3，通过菌株的发酵培养和发酵产物的提取分离，以高产率获得高纯度questinol，解决了现有的技术缺陷。
[0007]
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：
[0008]
本发明提供一株皮氏叫姑鱼共附生真菌新菌株——土曲霉(aspergillus terreus)f6-3，分离自皮氏叫姑鱼表皮，该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年1月13日，保藏编号为cctcc no:m2022065，地址为中国，武汉，武汉大学。
[0009]
本发明还提供了一种土曲霉f6-3在制备6-羟基芦荟大黄素-8-甲醚中的应用，所述应用的方法为：(1)将土曲霉f6-3接种至大米固体培养基，在20-30℃条件下暗培养15-30天(优选28℃、20天)，获得大米发酵产物；所述大米固体培养基为大米和蒸馏水的混合物，其中蒸馏水用量以大米质量计为1-5ml/g(优选1.35ml/g)；(2)将大米发酵产物(优选捣碎)中加入有机溶剂，室温浸提，提取液浓缩至无液体流出，获得粗提物浸膏；(3)将步骤(2)粗提物浸膏用水悬浮，以有机溶剂萃取，收集有机相，减压浓缩至干，得到萃取物浸膏；(4)将步骤(3)萃取物浸膏用甲醇溶解后进行mci chp20p柱层析，以体积浓度20-100％甲醇-水为洗脱液进行梯度洗脱，收集体积浓度70％的甲醇-水洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物；(5)将步骤(4)所得浓缩物用甲醇溶解后进行硅胶柱层析(优选硅胶200-300目，高h＝40cm，直径d＝5cm)，分别以体积比100-20:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱液进行梯度洗脱，收集体积比20:1的二氯甲烷-甲醇洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物；(6)将步骤(5)所得的浓缩物用甲醇溶解，于室温重结晶，过滤，得晶体，即得到式(ⅰ)所示的questinol；
[0010][0011]
优选的，步骤(1)所述土曲霉f6-3接种至大米固体培养基前，先进行活化培养，再将活化后的菌悬液以体积浓度0.1-1％的接种量接种大米固体培养基，所述活化是指将土曲霉f6-3接种至马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基，28℃培养，使菌株活化，将活化后的菌株用体积浓度2％吐温80无菌水重悬，得到菌悬液；所述菌悬液中菌体浓度为1
×
10
5-1
×
108个/ml，优选1
×
106个/ml；所述pda培养基组成为马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂18g/l，溶剂为蒸馏水，ph自然。
[0012]
优选的，步骤(1)中发酵培养条件为：28℃条件下暗培养20天。
[0013]
优选的，步骤(2)中所述有机溶剂为95％乙醇、甲醇或丙酮；所述有机溶剂体积用量以大米固体培养基中大米干重计为2～8ml/g(优选5-6ml/g)；所述浸提至少进行3次，每次提取时间为3～5天。
[0014]
优选的，步骤(3)中所述水体积用量以粗提物浸膏重量计为2～5ml/g(优选3.1ml/g)；所述有机溶剂为乙酸乙酯，所述有机溶剂与水的体积比为1:0.5～3；萃取3-5次，每次萃取用的有机溶剂与水体积比优选1:1。
[0015]
优选的，步骤(4)方法为：萃取物浸膏以甲醇溶解后进行mci chp20p柱层析，依次以体积比为20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10和100:0的甲醇/水混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱2～5个(优选2个)柱体积，流速10-20ml/min(优选15ml/min)；收集体积比70:30的甲醇-水洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物；甲醇体积用量以萃取物浸膏质量计为3-5ml/g(优选4ml/g)。
[0016]
优选的，步骤(5)方法为：将步骤(4)中的浓缩物用甲醇溶解后进行硅胶柱层析分离(硅胶200-300目，高h＝40cm，直径d＝5cm)，分别以二氯甲烷-甲醇＝100:1、80:1、60:1、
40:1、20:1(v/v)为洗脱液，收集体积浓度20:1的二氯甲烷-甲醇洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物；所述甲醇体积用量以浓缩物质量计为15-30ml/g，优选28ml/g。
[0017]
优选的，步骤(6)甲醇体积用量以浓缩物质量计为25-35ml/g(优选28-29ml/g)。
[0018]
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
[0019]
本发明提供一种经多年实验筛选获得的保藏编号为cctcc m 2012065的皮氏叫姑鱼共附生真菌新菌株——土曲霉f6-3，并首次报道了利用该菌株发酵培养，高产率制备高纯度questinol的方法，使得questinol产率达到0.88g/kg大米，纯度达到99％；该制备方法具有发酵条件简单、菌种易培养、工艺步骤少、生产周期短等优势，具有工业化、规模化生产的潜力。本方法对于解决高纯度questinol标准品或对照品的规模化制备这一问题具有重要意义。
(四)附图说明
[0020]
图1是土曲霉f6-3的菌落照片。
[0021]
图2是questinol的1h-nmr谱图。
[0022]
图3是questinol的
13
c-nmr谱图。
[0023]
图4是questinol的高效液相色谱图。
(五)具体实施方式
[0024]
本发明结合附图和实施例，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0025]
本发明所述室温是指25-30℃。所述pda培养基组成为马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂18g/l，溶剂为蒸馏水，ph自然。
[0026]
实施例1、菌株f6-3的筛选
[0027]
(1)皮氏叫姑鱼的采集
[0028]
皮氏叫姑鱼(johnius belangerii)于2019年12月采自海南省文昌市海域。
[0029]
(2)菌株的分离
[0030]
取皮氏叫姑鱼的表皮，采用平板稀释法开展共附生真菌的分离。取适量皮氏叫姑鱼表皮样品，用无菌海水清洗3次，尽可能除去样品表面非共附生微生物，称取样品2g，加入20ml无菌海水后，高压灭菌后磨碎至浆状，取适量处理后样品55℃放置6min以促进孢子萌发后，再在200w下超声波持续处理5min，获得处理液，作为10-1
样品。再将10-1
样品分别用无菌海水逐级稀释至10-2
、10-3
和10-4
浓度，依次各取150μl涂布于pda培养基中，每个处理重复3次，置于28℃的培养箱中倒置培养。
[0031]
培养4天后，待菌落出现后，根据菌落的形态、颜色的差异及菌落长出时间的不同，分别挑取培养基边缘的菌丝接种于新的pda培养基上进行分离培养，直至筛选出单一的菌落，记为菌株f6-3。
[0032]
实施例2、菌株f6-3的鉴定
[0033]
1、菌落形态
[0034]
将实施例1筛选的菌株f6-3接入pda培养基斜面，28℃暗培养7天后(图1)，转至4℃
冰箱内保存备用。如图1所示，培养起初，菌丝呈白色絮状；培养7天，菌落即铺满整皿，菌落呈棕黄色、干燥、不透明、边缘不平整菌株。
[0035]
2、分子生物学鉴定
[0036]
(1)基因组dna的提取
[0037]
使用tsingke植物dna提取试剂盒(通用型，北京擎科生物科技有限公司)提取菌株f6-3基因组dna，具体步骤如下：
[0038]
1)将spin column置于collection tube中，加入250μl buffer bl，12000rpm离心1min活化硅胶膜；
[0039]
2)挑取实施例1平板上菌株f6-3单克隆菌于1.5ml离心管内，加入400μlbuffer gp1，涡旋振荡1min，65℃水浴20min，期间可取出颠倒混匀以充分裂解；
[0040]
3)加入150μl buffer gp2，涡旋振荡1min，冰浴5min；
[0041]
4)12000rpm离心5min，将上清转移至新的离心管中；
[0042]
5)加入上清等体积的无水乙醇，立即充分振荡混匀，液体全部转入spin column中，12000rpm/min离心30s，弃废液；
[0043]
6)向spin column中加入500μl buffer pw(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm/min离心30s，弃废液；
[0044]
7)向spin column中加入500μl wash buffer(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃废液；
[0045]
8)重复操作步骤7；
[0046]
9)将spin column放回collection tube中，12000rpm离心2min，开盖晾干1min；
[0047]
10)取出spin column，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中央处加75μlte buffer(65℃预热te buffer)，20℃放置2min，12,000rpm离心2min，获得基因组dna。
[0048]
(2)its区序列的pcr扩增
[0049]
1)引物序列如下：
[0050]
its1:5’tccgtaggtgaacctgcgg 3’[0051]
its4:5’tcctccgcttattgatatgc 3’[0052]
2)pcr反应体系
[0053]
pcr体系(50μl)构成为：基因组dna模板(10p)1μl，primer 1(10p)2μl，primer 2(10p)2μl，1
×
tse101金牌mix 45μl。
[0054]
3)pcr程序设定为：98℃预变性2min，98℃变性10s，55℃复性10s，72℃延伸15s，35个循环，最后72℃延伸5min。
[0055]
4)pcr扩增产物电泳纯化与测序
[0056]
将扩增好的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳(2μl样品+6μl溴酚蓝)，300v电压下12分钟。由pcr产物电泳结果切割所需dna目的条带，经dna凝胶回收试剂盒(厂家：生工生物工程(上海)有限公司)纯化。纯化产物由北京擎科生物科技有限公司采用sanger法测序，测得its碱基序列(seq id no.1)为：cttgctttggaaggaaaaaaatgtaacaaggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattaccgagtgcgggtctttatggcccaacctcccacccgtgactattgtaccttgttgcttcggcgggcccgccagcgttgctggccgccggggggcgactcgcccccgggcccgtgcccgccggagaccccaacatgaaccctgttctgaaagcttgcagtctgagtgtgattctttgcaatcagttaaaactttcaacaatggatctcttggttc
cggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataactaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcccggcttgtgtgttgggccctcgtcccccggctcccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatggggcttcgtcttccgctccgtaggcccggccggcgcccgccgacgcatttgtttgcaacttgtttttttccaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatctaaaggcgggaagaaaatt。
[0057]
(3)数据处理
[0058]
序列数据在美国国立生物信息中心(national center for biotechnology information usa，ncbi)的genbank中进行同源序列搜索比对，分析其同源性。将上述序列与genbank中的序列比较，鉴定该菌株为土曲霉(aspergillus terreus),命名为土曲霉(aspergillus terreus)f6-3，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年1月13日，保藏编号为cctcc no:m2022065，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。
[0059]
实施例3、土曲霉f6-3发酵制备questinol
[0060]
1、菌株活化
[0061]
取出保存于-80℃冰箱的土曲霉f6-3菌株冻存管，于4℃解冻后，在超净台内用无菌棉棒从冻存管蘸取适量孢子悬液，接种至pda培养基，于28℃恒温培养箱中静置培养7天，进行菌种活化。
[0062]
2、菌株发酵
[0063]
活化7天后，用10ml含有体积浓度2％吐温80的无菌水将菌株孢子洗下，置于装有100ml含体积浓度2％吐温80的无菌水中，得到孢子悬液(孢子浓度为1
×
106个/ml)；分别移取1ml孢子悬液，接种至82个装有大米培养基(大米100g，蒸馏水135ml，于121℃高温灭菌20min后，冷却)的1l三角瓶中，于28℃恒温暗培养20天，获得82瓶大米发酵产物。
[0064]
3、questinol的提取分离
[0065]
1)将步骤2制备的82瓶大米发酵产物混合并捣碎，加入95％乙醇20升，室温浸提4天，过滤，滤饼重复浸提3次(每次加入3升95％乙醇，每次4天)，合并提取液并减压浓缩至干，得粗提物浸膏674g。
[0066]
2)将步骤1)粗提物浸膏674g用1.5l蒸馏水悬浮，用乙酸乙酯萃取，每次1.5l，共萃取3次，合并乙酸乙酯相，并减压浓缩至干，得到乙酸乙酯萃取物浸膏72g。
[0067]
3)将步骤2)乙酸乙酯萃取物浸膏72g溶解于100ml甲醇后进行mci chp20p柱层析(直径d＝4cm，高h＝60cm)，依次以体积比为20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10和100:0的甲醇/水混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱1.5l(2个柱体积)，流速15ml/min；收集甲醇/水＝70:30(v/v)的洗脱部位，合并，减压浓缩至干，得浓缩物5.0g。
[0068]
4)将步骤3)中的浓缩物5.0g用100ml的甲醇溶解后进行硅胶柱层析分离(硅胶200-300目，高h＝40cm，直径d＝5cm)，分别以二氯甲烷-甲醇＝100:1、80:1、60:1、40:1、20:1(v/v)为洗脱液，收集体积浓度20:1的二氯甲烷-甲醇洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物3.5g。
[0069]
5)将步骤(4)所得的浓缩物3.5g用100ml甲醇溶解，于室温重结晶，过滤，得晶体，橙色粉末1.2g，即得式(i)所示化合物，产率达到0.88g/kg大米。
[0070]
4、步骤3制备的橙色粉末产物的结构鉴定
[0071]
questinol：橙色粉末。如图2、图3所示，其1h-nmr和
13
c-nmr数据如下：1h-nmr(600mhz,dmso-d6)δ
h 13.27(1h,s,1-oh),7.58(1h,s,h-4),7.25(1h,s,h-2),7.21(1h,s,h-5),6.90(1h,s,h-7),5.54(1h,s,11-oh),4.57(1h,s,h-11),3.90(3h,s,h-12)。
13
c-nmr(150mhz,dmso-d6)δc186.4(c-9),182.3(c-10),164.6(c-6),163.4(c-8),161.7(c-1),151.4(c-3),136.8(c-10a),132.1(c-4a),121.0(c-2),115.8(c-4),115.2(c-9a),112.6(c-8a),107.1(c-5),105.0(c-7),62.0(c-12),56.3(c-11)。以上波谱数据与文献(zhao,d.；cao,f.；guo,x.j.；zhang,y.r.；zhu,h.j.antibacterial indole alkaloids and anthraquinones from a sewage-derived fungus eurotium sp.chem.nat.compds.2018,54,1-3.)报道的questinol一致。因此，步骤3制备的晶体即为式(i)所示questinol。
[0072]
5、questinol的纯度检测
[0073]
1)将上述步骤3制备所得的questinol用甲醇溶解，定量稀释配制成浓度为100μg/ml的样品溶液。
[0074]
2)取样品溶液进行高校液相色谱分析，色谱条件如下。仪器：agilent 1200series；色谱柱：cosmosil 5c18-paq(4.6mm i.d.
×
250mm)；流动相：甲醇-水(50:50,v/v)；流速：1ml/min；检测波长：285nm；进样量：20μl；柱温：室温。检测记录色谱图。
[0075]
3)待测样品的高效液相色谱检测结果如图4所示。杂色曲霉毒素的保留时间为12.522min，峰面积分析其纯度达99％。
[0076]
以上所述的实施例只是本发明的较佳方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

技术特征：
1.土曲霉(aspergillus terreus)f6-3，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年1月13日，保藏编号为cctcc no：m2022065，地址为中国，武汉，武汉大学。2.一种权利要求1所述土曲霉f6-3在发酵制备6-羟基芦荟大黄素-8-甲醚中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述6-羟基芦荟大黄素-8-甲醚按如下步骤制备：(1)将土曲霉f6-3接种至大米固体培养基，在20-30℃条件下暗培养15-30天，获得大米发酵产物；所述大米固体培养基为大米和蒸馏水的混合物，其中蒸馏水用量以大米质量计为1-5ml/g；(2)将大米发酵产物中加入有机溶剂，室温浸提，提取液浓缩至无液体流出，获得粗提物浸膏；(3)将步骤(2)粗提物浸膏用水悬浮，以有机溶剂萃取，收集有机相，减压浓缩至干，得到萃取物浸膏；(4)将步骤(3)萃取物浸膏用甲醇溶解后进行mci chp20p柱层析，以体积浓度20-100％甲醇-水为洗脱液进行梯度洗脱，收集体积浓度70％的甲醇-水洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物；(5)将步骤(4)所得浓缩物用甲醇溶解后进行硅胶柱层析，以体积比100-20:1二氯甲烷-甲醇为洗脱液，收集体积浓度20:1的二氯甲烷-甲醇洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物；(6)将步骤(5)所得的浓缩物用甲醇溶解，于室温重结晶，过滤，得晶体，即得到式(ⅰ)所示6-羟基芦荟大黄素-8-甲醚，4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述土曲霉f6-3接种至大米固体培养基前，先进行活化培养，再将活化后的菌悬液以体积浓度0.1-1％的接种量接种大米固体培养基，所述活化是指将土曲霉f6-3接种至pda培养基，28℃培养，使菌株活化，将活化后的菌株用体积浓度2％吐温80无菌水重悬，得到菌悬液。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述有机溶剂为95％乙醇、甲醇或丙酮；所述有机溶剂体积用量以大米固体培养基中大米干重计为2～8ml/g。6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述浸提至少进行3次，每次提取时间为3～5天。7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(3)中所述水体积用量以粗提物浸膏重量计为2-5ml/g；所述有机溶剂为乙酸乙酯，所述有机溶剂与水的体积比为1:0.5-3；萃取3-5次。8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(4)方法为：萃取物浸膏以甲醇溶解后进行mci chp20p柱层析，依次以体积比为30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10和100:0的甲醇/水混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱2～5个柱体积，流速10-20ml/min；收集体积比70:30的甲醇-水洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物。9.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(5)方法为：将步骤(4)所得浓缩物用甲醇溶解后进行硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇100:1、80:1、60:1、40:1、20:1为洗脱液，收集体积浓度20:1的二氯甲烷-甲醇洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物。
10.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(6)甲醇溶剂体积用量以浓缩物质量计为25-35ml/g。

技术总结
本发明涉及一种土曲霉F6-3及其在发酵制备6-羟基芦荟大黄素-8-甲醚中的应用。本发明首次报道了利用该菌株发酵培养，高产率制备高纯度questinol的方法，使得questinol产率达到0.88g/kg大米，纯度达到99％；该制备方法具有发酵条件简单、菌种易培养、工艺步骤少、生产周期短等优势，具有工业化、规模化生产的潜力。本方法对于制备高纯度questinol标准品或对照品具有重要意义。具有重要意义。


技术研发人员：应优敏 陆雪君 王鸿 陈建伟 章华伟 金国虔 王颖
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：2022.05.23
技术公布日：2022/11/1