1.本发明属于生物工程领域，尤其涉及一株碱性蛋白酶高产菌株及其发酵工艺。
背景技术：2.碱性蛋白酶(alkaline protease)属丝氨酸蛋白水解酶类，可以在碱性条件下水解蛋白质肽键，其最适作用ph一般为9～11，该酶种最早在猪的胰脏中发现。该类酶在食品、饲料、洗涤、医药和环保等各个工业领域有很高的应用价值，其在酶工业中占有很大的比重，全球酶制剂市场中蛋白酶的销售额达到60％，而碱性蛋白酶就占25％。由于微生物蛋白酶均为胞外酶，与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性，同时易于实现工业化生产。而且碱性蛋白酶比中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力，有较大耐热性且有一定的酯酶活力。因此，碱性蛋白酶研究成为蛋白酶研究的热点。芽孢杆菌是碱性蛋白酶生产应用最广泛的菌种之一，本发明所涉及到的菌株为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)菌株。
3.随着社会的进步，科技的不断发展，碱性蛋白酶应用领域的不断拓宽，人们对蛋白酶需求不断增加，故对于碱性蛋白酶的产量的提高，成本的降低要求也日益迫切。
4.目前，关于碱性蛋白酶的研究也有不少，例如专利cn106867982a公布的一种碱性蛋白酶的生产方法，酶活达到50000u/ml，专利cn111500513a公开的一种碱性蛋白酶酶活为28882u/ml，专利cn108949731a公开的一种提高碱性蛋白酶发酵活力的生产方法中酶活为58000u/ml。整体来看现有技术研究的酶活水平并不高，且产业化的研究不多，多存在于研究阶段，并不能实际工业产业化。
技术实现要素：5.针对现有技术问题，本技术提供了一株碱性蛋白酶高产菌株及其发酵工艺。
6.首先，本技术的首要目的是提供一株碱性蛋白酶高产菌株，获得高产碱性蛋白酶的菌株。另一目的是提供适合该碱性蛋白酶高产菌株的发酵工艺，使该菌株发挥最佳产酶效率。最终使酶活水平较现有技术有了大幅度提高，为生产提供了有力的技术支持。
7.针对上述目的，本技术的技术方案之一为：
8.一株碱性蛋白酶高产菌株，该菌株为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，于2022年1月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24316。
9.该菌株所产碱性蛋白酶最适反应温度为55-60℃，最适反应ph为7.0-11.0；具有较好的热稳定性，在55-60℃下保温3h仍具有80％以上的酶活。
10.该碱性蛋白酶高产菌株是经安全系数高、突变性能高效的常压室温等离子体(简称artp)诱变获得，该菌株本身产酶能力显著高出现有技术其他菌株，并经过进一步的生产实践验证，其环境适应性、遗传稳定性等各方面均适合工业化生产。
11.在上述碱性蛋白酶高产菌株的基础上，本技术的另一技术方案为：上述碱性蛋白酶高产菌株的发酵工艺，包括：(1)种子培养阶段；(2)种子扩大培养阶段；(3)发酵培养阶段。
12.上述发酵工艺中：
13.所述步骤(2)种子扩大培养阶段采用如下培养基(按照质量百分比计)：豆粕3.00％-4.00％，牛肉膏1.50％-3.00％，葡萄糖2.00％-4.00％，麦芽糊精2.00％-3.00％，无水磷酸二氢钾0.10％-0.50％，无水磷酸氢二钾0.05％-0.10％，无水硫酸镁0.02％-0.05％，氯化钠0.20％-0.40％，消泡剂0.10％-0.40％，水余量。该种子培养基添加了发酵培养基中的氮源及无机盐成分，一方面营养丰富更易于菌株的生长；另一方面增强了菌株在发酵液中的适应能力，有利于在发酵液中生长产酶。
14.所述步骤(3)发酵培养阶段采用如下培养基(按照质量百分比计)：豆粕3.00％-4.00％，花生饼粉2.00％-4.00％，牛肉膏0.50％-1.50％，麦芽糊精2.00％-4.00％，葡萄糖2.00％-4.00％，氯化钾0.05％-0.15％，无水磷酸二氢钾0.20％-0.30％，无水磷酸氢二钾0.10％-0.30％，无水氯化钙0.02％-0.06％，无水硫酸镁0.01％-0.04％，吐温80 0.02％-0.05％，丝氨酸0.02％-0.05％，消泡剂0.10％-0.40％，水余量。该发酵配方中加入了吐温80和丝氨酸，对酶活的提高有着明显的作用。首先，吐温80是一种优良的表面活性剂具有增加发酵液溶氧的作用，在一定状态下可以形成胶团包裹有机营养物质，易于被细胞吸收利用；其次，吐温80特有的极性和非极性基团能够协助碱性蛋白酶被动扩散分泌至胞外，提高酶活产量。丝氨酸化学结构的活性中心c端结构域上含有一组丝氨酸残基(ser195)，添加适量的丝氨酸能够促进菌体的生长产酶。
15.步骤(3)发酵培养阶段的培养基补料配方为(按照质量百分比计)：麦芽糊精30％-40％，葡萄糖30％-40％，牛肉膏1.00％-3.00％，水余量。
16.具体的发酵工艺步骤包括：
17.(1)种子培养阶段：采用常规培养方法将活化菌种培养至od
600
为3.10-3.30即可，例如可以采用lb液体培养基33℃培养，搅拌转速200r/min-500r/min。
18.优选种子培养阶段ph为7.2-7.4。
19.种子培养阶段可以根据最终发酵培养阶段发酵体积的大小选择一级种子培养或多级种子培养，但为了保证菌种活性、遗传稳定性以以及环境适应性等方面，此阶段优选可以采用1-3级种子培养，考虑到工业生产需求最优为2级种子培养。
20.(2)种子扩大培养阶段：接种量8-12％，发酵过程维持ph6.2-7.2，发酵过程溶氧控制在20-25％，温度33-35℃，培养至od
600
为18.0-20.0。对应的发酵周期在6h左右。
21.优选的，步骤(2)种子扩大培养阶段，通风比1：1～1：2(v:v)，搅拌转速200r/min-500r/min。
22.(3)发酵培养阶段：接种量8-12％，发酵过程溶氧控制在20-25％，温度33-35℃，当还原糖浓度低于2.8％时补料，采用流加式补料使还原糖浓度控制在2.0-4.0％范围内，还原糖依照dns法进行检测，发酵后期酶活。在发酵后期54-66h，检测酶活不再增加即为发酵终点。
23.优选的，步骤(3)发酵培养阶段，发酵期间控制ph6.2-7.5。ph的调节可以采用硫酸或氢氧化钠，优选10％硫酸或20％氢氧化钠。
24.优选的，步骤(3)发酵培养阶段，通风比1：1～1：2(v:v)，搅拌转速200r/min-500r/min。
25.除此之外的发酵工艺各步骤均按照现有技术进行即可，例如培养基的灭菌、发酵过程的补料方式等等，在此不再进行赘述。
26.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
27.本发明提供了一株高产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌，具有非常好的产酶能力，保藏编号为cgmcc no.24316。该菌株所产碱性蛋白酶最适反应温度为55-60℃，最适反应ph为7.0-11.0；本发明产生碱性蛋白酶具有较好的热稳定性，在55-60℃的情况下保温3h仍具有80％及以上的酶活。通过发酵工艺及发酵培养基的改进使得发酵酶活可达到120000u/ml以上，超过文献报道和现有市场水平，为碱性蛋白酶产量提高，成本优化提供技术支持。
28.保藏信息
29.保藏时间：2022年01月17日；
30.保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
31.保藏编号：cgmcc no.24316；
32.保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所；
33.分类命名：枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)。
附图说明
34.图1实施例2实验组与对照组发酵酶活曲线对比图；
35.图2实施例2实验组与对照组发酵周期的od
600
曲线图；
36.图3本发明中碱性蛋白酶不同温度条件下相对酶活变化曲线；
37.图4本发明中碱性蛋白酶不同ph条件下相对酶活变化曲线；
38.图5本发明中碱性蛋白酶在最佳ph条件下55℃及60℃保温3h后残余酶活。
具体实施方式
39.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成。
40.实施例1菌种筛选和诱变
41.菌种筛选：
42.山东省滨州市某盐碱地土壤中取样，依照五点取样法共取样品2g。加入盛有100ml无菌生理盐水并带有玻璃珠的500ml三角瓶中，180rpm，摇床震荡30min，80℃水浴10min，取上液1ml，按梯度稀释法稀释，分别涂布104、105、106浓度稀释液于lb平板上，37℃培养24h。首先进行初筛，选取菌落形态不同的单菌落并编号，然后分别用接种针点取单菌落移至筛选培养基上，37℃培养24h，通过产生水解透明圈和菌落直径比值为评价指标进行比较，筛选出一组比值较大的菌株，并进行斜面保藏。然后进行复筛，将斜面保存的初筛菌种活化后分别接种在lb液体培养基中，装液量100ml/500ml，培养18h，接种摇瓶发酵培养基中，发酵选用挡板三角瓶，装液量100ml/500ml，33℃，发酵48h。将发酵液10000r/min离心5min取上
清液，按照gbt23527-2009蛋白酶活力测定标准进行检测。最终选取酶活性最高的菌株进行传代稳定性实验，lb固体斜面传6代，并分别接种种子培养基，发酵培养基检测产酶情况，酶活结果无显著性差异，菌株较为稳定，平均酶活为26388u/ml，对该株菌进行甘油管-80℃保存。
43.所述lb培养基为(质量分数)：蛋白胨1.00％，酵母粉0.50％，氯化钠1.00％，ph7.2-7.4；
44.所述筛选培养基为(质量分数)：脱脂奶粉1.00％，蛋白胨1.00％，酵母粉0.50％，氯化钠1.00％，ph7.2-7.4；
45.所述摇瓶发酵培养基为(质量分数)：豆粕6.0％，蔗糖5.0％，葡萄糖2.0％，氯化钙0.07％，硫酸镁0.04％，氯化钾0.3％，吐温8.0 0.05％，ph10.0。
46.菌种诱变：
47.将保存的最佳菌种作为出发菌株，进行artp诱变，lb培养基培养培养至产孢期，无菌条件下吸取稀释好的菌液(菌量10
5-107cfu/ml)10μl均匀涂布于无菌金属载片表面，将金属载片放置在artp仪中，以氦气作为工作气体，电源的功率为120w，照射距离为2mm，气流量为10l/min，对菌悬液进行处理，处理时长为90s-100s，处理完成的金属载片放于1ml无菌水中进行洗脱并采用稀释涂布法涂布在lb固体平板上，于37℃培养箱中培养，待菌落长出后，分别挑取菌落状态不同的单菌落转接至牛奶筛选培养基平板上，同时转接原始菌株作为对照，37℃，培养24h，以产生水解透明圈和菌落直径比值为评价指标进行比较，筛选出一组比值比对照组大的菌株，再进行复筛。
48.将初筛菌种活化后分别接种至lb种子培养基中，装液量100ml/500ml，培养18h，以10％的接种量接种至摇瓶发酵培养基，发酵选用挡板三角瓶，装液量100ml/500ml，33℃，培养48h。将发酵液10000r/min离心5min取上清液，按照gbt23527-2009蛋白酶活力测定标准进行检测。
49.选取酶活性最高的一株菌株进行传代稳定性实验，lb固体斜面传6代，并接种种子培养基，摇瓶发酵培养基检测产酶情况，每代酶活无显著性差异，具有良好的传代稳定性。平均酶活为62075u/ml。
50.对该菌株进行16srdna测序，并进行blast比对，比对结果显示，该菌株的16srdna的核苷酸序列与枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性，与其中明确标记为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的菌株有100％的同源性。因此发明人将该菌株作为生产菌株；并对其进行了生物保藏，其生物保藏编号为cgmcc no.24316。
51.所述lb种子培养基为(质量分数)：蛋白胨1.00％，酵母粉0.50％，氯化钠1.00％，ph7.2-7.4；
52.所述固体牛奶筛选培养基：酵母粉0.50％，蛋白胨1.00％，氯化钠1.00％，脱脂奶粉1.00％，琼脂2.00％，ph 7.2-7.4
53.所述摇瓶发酵培养基为(质量分数)：豆粕3.00％，花生饼粉3.50％，牛肉膏0.50％，麦芽糊精3.00％，葡萄糖3.00％，氯化钾0.10％，无水磷酸二氢钾0.20％，无水磷酸氢二钾0.10％，无水硫酸镁0.04％，氯化钙0.05％，吐温8.0 0.05％，丝氨酸0.05％，ph10.0。
54.实施例2本发明菌株(即实施例1的诱变菌株)传代稳定性研究
55.为了验证诱变菌株的传代稳定性，将诱变所得的酶活性最高菌株进行传代实验。共传6代，将每代斜面菌株接种至lb种子培养基，种子装液量100ml/500ml，培养18h，再以10％的接种量转接至摇瓶发酵培养基。发酵选用挡板三角瓶，装液量100ml/500ml，33℃，培养48h，取上清液检测酶活。以第一代菌株的摇瓶发酵酶活为100％，计算相对酶活。结果如表1所示，由结果可知，平均酶活为62075u/ml，每代酶活无显著性差异，具有良好的传代稳定性。
56.所述lb种子培养基为(质量分数)：蛋白胨1.0％，酵母粉0.5％，氯化钠1.0％，ph7.2-7.4；
57.所述摇瓶发酵培养基为(质量分数)：豆粕3.00％，花生饼粉3.50％，牛肉膏0.50％，麦芽糊精3.00％，葡萄糖3.00％，氯化钾0.10％，无水磷酸二氢钾0.20％，无水磷酸氢二钾0.10％，无水硫酸镁0.04％，氯化钙0.05％，吐温8.0 0.05％，丝氨酸0.05％，ph10.0。
58.表1诱变菌株传代稳定性实验结果
[0059][0060][0061]
实施例3种子扩大培养阶段培养基应用对比实验(30l发酵罐)
[0062]
培养基配方：
[0063]
①
一级、二级种子培养阶段培养基(lb培养基，按照质量百分比计)：酵母粉0.50％，蛋白胨1.00％，氯化钠1.00％，水余量，ph 7.2-7.4。
[0064]
②
对照组种子扩大培养阶段的培养基(按照质量百分比计)：酵母粉0.50％，蛋白胨1.00％，氯化钠1.00％，水余量，ph 7.2-7.4。
[0065]
③
实验组种子扩大培养阶段的培养基(按照质量百分比计)：豆粕3.50％，牛肉膏2.00％，葡萄糖3.00％，麦芽糊精2.50％，无水磷酸二氢钾0.30％，无水磷酸氢二钾0.10％，无水硫酸镁0.02％，氯化钠0.30％，消泡剂0.10％，水余量。
[0066]
④
发酵培养阶段培养基(按照质量百分比计)：豆粕3.50％，花生饼粉3.00％，牛肉膏0.70％，麦芽糊精2.20％，葡萄糖4.00％，氯化钾0.08％，无水磷酸二氢钾0.30％，无水磷酸氢二钾0.30％，无水氯化钙0.03％，无水硫酸镁0.04％，吐温800.05％，丝氨酸0.05％，消泡剂0.20％，水余量。
[0067]
⑤
发酵培养阶段补料配方为(按照质量百分比计)：麦芽糊精30％，葡萄糖35％，牛肉膏2.00％，水余量。
[0068]
三级种子培养基应用对比实验步骤：
[0069]
①
菌种活化：将保存在中-80℃冰箱保存在中的菌种冻存管取出，在无菌操作台中，用接种环蘸取菌种，活化到提前做好的lb斜面固体培养基上，33℃培养20h，待用。
[0070]
②
一级种子培养阶段：在无菌操作台中，用接种针刮取一环上述活化好的菌种，接入100ml/500ml无菌的lb液体培养基中，33℃，180rpm震荡培养18h，完成一级种子的制备。
[0071]
③
二级种子培养阶段：采用2000三角瓶培养，将一级种子接入900ml/2000ml无菌的lb液体培养基中，33℃，180rpm震荡培养16h，。
[0072]
④
种子扩大培养阶段：同时采用2个条件一致的30l发酵罐培养，除种子培养基配方不同，其余培养条件均相同。有效装液量20l，接种量10％，ph6.8-7.2，通风比1：1～1：2(v:v)，搅拌转速200-500r/min，发酵过程溶氧控制在20-25％。当对照组菌种od
600
值达到3.10-3.30之间时(此时达到指数期中期)转入发酵罐。当实验组菌种od
600
值达到18.0-20.0之间时(此时达到指数期中期)转入发酵罐。
[0073]
⑤
发酵培养阶段：同时采用2个条件一致的30l发酵罐培养，除种子不同，其余培养条件均相同。有效装液量20l，接种量10％，发酵期间控制ph6.2-7.5，发酵过程中用10％硫酸或20％氢氧化钠调节ph。通风比1：1～1：2.0(v:v)，搅拌转速200-500r/min，发酵过程溶氧控制在20-25％，当还原糖浓度低于2.8％时补料，采用流加式补料使还原糖浓度控制在2.8-3.5％范围内，还原糖依照dns法进行检测。发酵过程中跟踪菌体od
600
值及酶活情况，酶活检测依照gbt23527-2009标准。
[0074]
由图1和图2结果可知，种子培养阶段培养基经过优化后酶活可提高57.3％左右，发酵周期由66h左右眼缩短至60h左右；从实验数据可知实验组发酵酶活远高于对照组，但其菌体od
600
值并没有显著提高(即菌体数量并没有显著高于对照组)，故分析可能是菌种的适应能力和生长能力在优化的种子扩大培养阶段的培养基中得到了极大的提高，以至于后期进入发酵罐后能迅速利用营养物质产生酶活。
[0075]
实施例4本发明碱性蛋白酶高产菌株5000l发酵罐发酵工艺一
[0076]
(1)培养基配方：
[0077]
①
一级、二级种子培养阶段培养基(lb培养基，按照质量百分比计)：酵母粉0.50％，蛋白胨1.00％，氯化钠1.00％，水余量，ph 7.2-7.4。
[0078]
②
种子扩大培养阶段培养基(按照质量百分比计)：豆粕4.00％，牛肉膏1.50％，葡萄糖2.50％，麦芽糊精3.00％，无水磷酸二氢钾0.20％，无水磷酸氢二钾0.10％，无水硫酸镁0.03％，氯化钠0.32％，消泡剂0.15％，水余量。
[0079]
③
发酵培养阶段培养基(按照质量百分比计)：豆粕4.00％，花生饼粉2.00％，牛肉膏0.90％，麦芽糊精3.50％，葡萄糖2.00％，氯化钾0.10％，无水磷酸二氢钾0.30％，无水磷酸氢二钾0.20％，无水氯化钙0.04％，无水硫酸镁0.03％，吐温800.03％，丝氨酸0.03％，消泡剂0.30％，水余量。
[0080]
④
发酵培养阶段补料配方为(按照质量百分比计)：麦芽糊精30％，葡萄糖35％，牛肉膏2.50％，水余量。
[0081]
(2)发酵生产工艺步骤：
[0082]
①
菌种活化：将保存在-80℃冰箱中的菌种冻存管取出，在无菌操作台中，用接种环蘸取菌种，活化到提前做好的lb斜面固体培养基上，33℃培养20h，待用。
[0083]
②
一级种子培养阶段：在无菌操作台中，用接种针刮取一环上述活化好的菌种，接入1000ml/2000ml无菌的lb液体培养基中，33℃，180rpm震荡培养18h，完成一级种子的制备，检测od2.90。
[0084]
③
二级种子培养阶段：采用50l发酵罐培养，有效装液量30l，接种量10％，ph6.8-7.2，通风比1：1～1：2(v:v)，搅拌转速200r/min，最高500r/min，发酵过程前期溶氧控制在20-25％，发酵7h检测od3.15转接三级种子罐。
[0085]
④
种子扩大培养阶段：采用500l发酵罐培养，有效装液量300l，接种量10％，ph6.8-7.2，通风比1：1～1：2(v:v)，搅拌转速200r/min，最高300r/min，发酵过程前期溶氧控制在20-25％，发酵6h，od19.0转接发酵罐。
⑤
发酵培养阶段：采用5000l发酵罐培养，有效装液量3000l，接种量10％，发酵期间控制ph6.2-7.5，发酵过程中用10％硫酸或20％氢氧化钠调节ph。通风比1：1～1：2(v:v)，搅拌转速200r/min，最高300r/min，发酵过程溶氧控制在20-25％，当还原糖浓度低于2.8％时补料，
[0086]
用流加式补料使还原糖浓度控制在2.8-3.5％范围内，还原糖依照dns法进行检测，酶活检测依照gbt23527-2009标准。发酵72h进行放罐处理，60h酶活达到最高128650u/ml，60-72h酶活基本维持在120000u/ml水平，变化幅度不大，分析结果可知本批次60h之后酶活基本稳定，不再增加，菌体衰老，60h为最佳发酵周期。
[0087]
实施例5本发明碱性蛋白酶高产菌株5000l发酵罐发酵工艺二
[0088]
(1)培养基配方：
[0089]
①
一级、二级种子培养阶段培养基(lb培养基，按照质量百分比计)：酵母粉0.50％，蛋白胨1.00％，氯化钠1.00％，水余量，ph 7.2-7.4。
[0090]
②
种子扩大培养阶段培养基(按照质量百分比计)：豆粕3.50％，牛肉膏2.00％，葡萄糖2.00％，麦芽糊精2.80％，无水磷酸二氢钾0.10％，无水磷酸氢二钾0.08％，无水硫酸镁0.02％，氯化钠0.20％，消泡剂0.10％，水余量。
[0091]
③
发酵培养阶段培养基(按照质量百分比计)：豆粕3.00％，花生饼粉3.00％，牛肉膏1.50％，麦芽糊精2.50％，葡萄糖3.50％，氯化钾0.10％，无水磷酸二氢钾0.30％，无水磷酸氢二钾0.25％，无水氯化钙0.04％，无水硫酸镁0.02％，吐温800.03％，丝氨酸0.05％，消泡剂0.20％，水余量。
[0092]
④
发酵培养阶段补料配方为(按照质量百分比计)：麦芽糊精40％，葡萄糖30％，牛肉膏1.00％，水余量。
[0093]
(2)发酵生产工艺步骤：
[0094]
①
菌种活化：将保存在-80℃冰箱中的菌种冻存管取出，在无菌操作台中，用接种环蘸取菌种，活化到提前做好的lb斜面固体培养基上，33℃培养20h，待用。
[0095]
②
一级种子培养阶段：在无菌操作台中，用接种针刮取一环上述活化好的菌种，接入1000ml/2000ml无菌的lb液体培养基中，33℃，180rpm震荡培养18h，完成一级种子的制备，检测od2.80。
[0096]
③
二级种子培养阶段：采用50l发酵罐培养，有效装液量30l，接种量10％，ph7.2-7.4，通风比1：1～1：2(v:v)，搅拌转速200r/min，最高500r/min，发酵过程前期溶氧控制在20-25％，发酵7h检测od3.12转接三级种子罐。
[0097]
④
种子扩大培养阶段：采用500l发酵罐培养，有效装液量300l，接种量10％，
ph6.8-7.2，通风比1：1～1：2(v:v)，搅拌转速200r/min，最高300r/min，发酵过程前期溶氧控制在20-25％，发酵6h，od18.5转接发酵罐。
⑤
发酵培养阶段：采用5000l发酵罐培养，有效装液量3000l，接种量10％，ph6.2-7.2，发酵过程中用10％硫酸或20％氢氧化钠调节ph。通风比1：1～1：2(v:v)，搅拌转速200r/min，最高300r/min，发酵过程溶氧控制在20-25％，当还原糖浓度低于2.8％时补料，用流加式补料使还原糖浓度控制在2.8-3.5％范围内，还原糖依照dns法进行检测，酶活检测依照gbt23527-2009标准。发酵66h进行放罐处理，54h酶活达到最高121002u/ml，54-66h酶活基本维持在120000u/ml水平，变化幅度不大，分析结果可知54h之后酶活基本稳定，不再增加，菌体衰老，54h为最佳发酵周期。
[0098]
实施例6本发明碱性蛋白酶酶学性质研究
[0099]
最适反应温度实验：
[0100]
对实施例4中发酵获得的碱性蛋白酶进行最适温度的摸索。用硼酸钠-氢氧化钠缓冲体系配制ph10.0的缓冲液，分别测定30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃的酶活，以确定最适反应温度。以最高酶活为100％，绘制不同温度条件下相对酶活变化曲线。如图3所示，在40-65℃的范围内能够维持80％以上酶活，可见该碱性蛋白酶的温度适应范围非常广；且最适反应温度为55-60℃，可见该碱性蛋白酶可以耐受一定的高温。
[0101]
最适反应ph实验：
[0102]
对实施例4中发酵获得的碱性蛋白酶进行最适ph的摸索。分别用0.2mol/l醋酸-醋酸钠缓冲体系(ph4.0-6.0)，磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲体系(ph7.0-9.0)，硼酸钠-氢氧化钠缓冲体系，配置不同ph缓冲液。用相应缓冲液配制不同ph值的底物溶液，在55℃水浴条件下分别测定不同ph条件下的酶活，以确定最适反应ph。以最高酶活为100％，绘制不同ph条件下相对酶活变化曲线。如图4所示，在ph4.0-7.0酶活依然能维持80％以上，ph适应范围广；最适反应ph为7.0-11.0。
[0103]
热稳定性实验：
[0104]
本发明碱性蛋白酶在最佳ph10条件下，55、60℃分别保温3h，以初始酶活为100％，每隔30min检测残余酶活，详细数据如图5所示，由结果可知，本发明产生的碱性蛋白酶在55-60℃的情况下保温3h仍具有80％的酶活，热稳定性较好。
技术特征：1.一株碱性蛋白酶高产菌株，其特征在于，该菌株为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，于2022年1月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24316；该菌株所产碱性蛋白酶最适反应温度为55-60℃，最适反应ph为7.0-11.0；具有较好的热稳定性，在55-60℃下保温3h仍具有80％以上的酶活。2.一种碱性蛋白酶的发酵工艺，其特征在于，包括：(1)种子培养阶段；(2)种子扩大培养阶段；(3)发酵培养阶段；其中：发酵菌种为枯草芽孢杆菌cgmcc no.24316；所述步骤(2)种子扩大培养阶段采用如下培养基，按照质量百分比计：豆粕3.00％-4.00％，牛肉膏1.50％-3.00％，葡萄糖2.00％-4.00％，麦芽糊精2.00％-3.00％，无水磷酸二氢钾0.10％-0.50％，无水磷酸氢二钾0.05％-0.10％，无水硫酸镁0.02％-0.05％，氯化钠0.20％-0.40％，消泡剂0.10％-0.40％，水余量；所述步骤(3)发酵培养阶段采用如下培养基，按照质量百分比计：豆粕3.00％-4.00％，花生饼粉2.00％-4.00％，牛肉膏0.50％-1.50％，麦芽糊精2.00％-4.00％，葡萄糖2.00％-4.00％，氯化钾0.05％-0.15％，无水磷酸二氢钾0.20％-0.30％，无水磷酸氢二钾0.10％-0.30％，无水氯化钙0.02％-0.06％，无水硫酸镁0.01％-0.04％，吐温80 0.02％-0.05％，丝氨酸0.02％-0.05％，消泡剂0.10％-0.40％，水余量。3.根据权利要求2所述的碱性蛋白酶的发酵工艺，其特征在于，具体的发酵工艺步骤为：(1)种子培养阶段：采用lb液体培养基将活化菌种培养至od
600
为3.10-3.30；(2)种子扩大培养阶段：接种量8-12％，发酵过程维持ph6.2-7.2，发酵过程溶氧控制在20-25％，温度33-35℃，培养至od
600
为18.0-20.0；(3)发酵培养阶段：接种量8-12％，发酵过程溶氧控制在20-25％，温度33-35℃，当还原糖浓度低于2.8％时补料，使还原糖浓度控制在2.0-4.0％范围内，在发酵后期54-66h，检测酶活不再增加即为发酵终点；步骤(3)发酵培养阶段的培养基补料配方，按照质量百分比计：麦芽糊精30％-40％，葡萄糖30％-40％，牛肉膏1.00％-3.00％，水余量。4.根据权利要求3所述的碱性蛋白酶的发酵工艺，其特征在于，所述的种子培养阶段ph为7.2-7.4；种子培养阶段可以是一级种子培养或多级种子培养。5.根据权利要求3所述的碱性蛋白酶的发酵工艺，其特征在于，步骤(2)种子扩大培养阶段，通风比1：1～1：2(v:v)，搅拌转速200r/min-500r/min。6.根据权利要求3所述的碱性蛋白酶的发酵工艺，其特征在于，步骤(3)发酵培养阶段，发酵期间控制ph6.2-7.5。7.根据权利要求3所述的碱性蛋白酶的发酵工艺，其特征在于，步骤(3)发酵培养阶段，通风比1：1～1：2(v:v)，搅拌转速200r/min-500r/min。
技术总结本发明属于生物工程领域，尤其涉及一株碱性蛋白酶高产菌株及其发酵工艺。本发明高产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌，经ARTP诱变技术诱变选育提高产酶能力，保藏编号为CGMCC No.24316。本发明所产碱性蛋白酶最适反应温度为55-60℃，最适反应pH为7.0-11.0；本发明产生碱性蛋白酶具有较好的热稳定性，在55-60℃下保温3h仍具有80％以上的酶活。通过优化培养基配方及发酵工艺，进一步该菌株使5000L发酵酶活达到120000U/mL以上，超过文献报道及现有市场水平，为碱性蛋白酶产量提高，成本优化提供技术支持。技术支持。技术支持。
技术研发人员：杨传伦 蔡颖辉 张心青 杨丹丹 刘结磊 郭南南 冯清敏 周倩 冯丽娟 高保军 杨朝洋 潘冬梅 田杰伟
受保护的技术使用者：黄河三角洲京博化工研究院有限公司
技术研发日：2022.07.07
技术公布日：2022/11/1
