一种靶向pd-l1蛋白的多肽及其用途
技术领域
1.本发明属于生物医学领域的一种，尤其是涉及了一种能够靶向结合程序性死亡受体-配体1(pd-l1)的新型多肽及其用途。
背景技术：2.噬菌体展示技术是将编码外源多肽或蛋白质的dna序列通过基因工程插入到噬菌体基因，从而在噬菌体衣壳蛋白表面展示多肽或蛋白质的技术。大量展示有不同随机多肽的噬菌体可构成噬菌体文库，用于针对特定靶标的筛选，以探究多肽与靶标之间的相互作用。在生物学领域，该技术被广泛的应用于蛋白质与蛋白质、蛋白质与多肽、蛋白质与dna等分子相互作用的研究中。
技术实现要素：3.本发明的目的在于提供一种与pd-l1蛋白具有高度亲和力并能够特异性靶向结合pd-l1蛋白的多肽序列，能够与肿瘤细胞表面过表达的程序性死亡受体-配体1(pd-l1)靶向亲和，并阐明该多肽在免疫治疗领域中的用途。
4.本发明通过噬菌体海量筛选得到一种pd-l1靶向肽，能够特异性结合pd-l1蛋白，阻断t细胞表面的pd-1与肿瘤细胞表面的pd-l1之间的相互作用，进而抑制肿瘤生长。
5.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
6.一、一种靶向pd-l1蛋白的多肽：
7.所述多肽的氨基酸序列为no.1～no.3所示之一。
8.如下表：
9.表1氨基酸序列表
[0010] 氨基酸序列no.1hwfhrhhno.2lplitfnno.3wslgytg
[0011]
二、一种生物活性物质，包含所述多肽，还包括共价键连接的化合物或纳米颗粒、工程化的噬菌体等微生物、多聚体混合物。
[0012]
该生物活性物质具有与多肽相同的生物医学功能，即靶向结合pd-l1蛋白，阻断pd-1蛋白与pd-l1蛋白的结合。
[0013]
三、一种多聚核苷酸序列，能够编码所述的多肽，或者能够编码所述的生物活性物质。
[0014]
四、一种用于治疗疾病的多肽类药物，包含所述的多肽，药物用于靶向结合pd-l1蛋白、阻断肿瘤免疫逃逸。
[0015]
所述多肽、所述生物活性片段、所述多聚核苷酸序列、所述多肽类药物在制备用于肿瘤靶向治疗的生物医学材料和药物中应用。具体是在制备用于通过靶向结合pd-l1蛋白
实现肿瘤靶向治疗的生物医学材料和药物中的应用。
[0016]
本发明的多肽能阻断pd-l1与程序性死亡受体1(pd-1)间的免疫检查点识别，从而阻断肿瘤免疫逃逸，重建机体的免疫反应，进而起到抑制肿瘤生长的作用。
[0017]
本发明的有益效果是：
[0018]
本发明人利用噬菌体7肽库筛选得到了能够特异性结合pd-l1蛋白的多肽序列。相比于pd-l1蛋白抗体等，pd-l1结合肽的优势在于：(1)序列短小，合成生产成本低；(2)多肽片段结构稳定，降低了运输保存的成本及难度；(3)可通过多种方式进行给药。在肿瘤免疫治疗领域，具有特异性靶向结合能力，为免疫检查点阻断药物的研发开拓了新的思路。
附图说明
[0019]
图1为实施例1中利用噬菌体7肽库对pd-l1蛋白进行4轮筛选的过程中，2-3轮重复筛选的噬菌体输出量。
[0020]
图2为实施例2中利用dnastar软件对测序结果进行分析后，出现频次较高的3种多肽序列及其相应的频次。
[0021]
图3为实施例2中利用cabs-dock网站模拟多肽和蛋白质的结合位点，hwfhrhh(hh)多肽和pd-l1蛋白的模拟结合位点与pd-1蛋白和pd-l1蛋白结合位点类似。
[0022]
图4为实施例3中通过酶联免疫吸附实验探究展示3种不同多肽序列的噬菌体与pd-l1蛋白的亲和能力。
具体实施方式
[0023]
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的阐述，以下实施例仅为本发明的优选实施例，并不限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0024]
实施例1利用通过噬菌体展示技术所构建的噬菌体7肽库，针对pd-l1蛋白特异性结合阳性多肽进行4轮筛选(2-4轮重复筛选)。
[0025]
1.1、复苏、培养宿主菌e.coil er2738
[0026]
制备lb固态培养板，置于37℃培养箱中预热30min。使用挑菌棒，挑取e.coil er2738菌液，以“z”字形涂于lb平板表面，置于37℃培养箱中培养12小时。在摇菌管中加入5ml含有四环素的液态lb培养基中，使用无菌枪头挑取平板中的单克隆菌落，并将枪头置于培养基中。将培养管置于37℃摇床中，220rpm振荡培养，直至细菌处于对数生长中期。
[0027]
1.2、噬菌体滴度的测定
[0028]
将lb/iptg/xgal平板置于37℃培养箱中预热1小时。将噬菌体溶液进行梯度稀释，取10μl稀释后的噬菌体溶液加入200μl处于对数生长期的e.coil er2738菌液中。静置15min。将感染后的噬菌体加到lb/iptg/xgal平板表面，使用无菌涂覆棒均匀涂开。将涂好的平板倒置于37℃培养箱中，过夜培养。第二天检查平板上的噬菌体蓝斑并计数。
[0029]
1.3、菌液的制备
[0030]
将20ml的lb培养基置于250ml的无菌锥形瓶中，再加入1ml处于对数生长中期的宿主菌e.coil er2738。将锥形瓶置于37℃摇床中，220rpm振荡培养，直至细菌处于对数生长
中期。
[0031]
1.4、噬菌体的扩增及纯化
[0032]
将中和后的噬菌体洗脱液加入20ml处于对数生长期的e.coil er2738菌液中。室温静置20min后，将菌液置于37℃摇床中，220rpm振荡培养4.5小时。之后将菌液倒入50ml离心管中，12000g离心20min。将上清液倒入含有4ml peg/nacl溶液的离心管中，置入4℃冰箱中，过夜沉降。第二天，将该离心管12000g离心20min，弃上清液。在离心管中加入1ml pbs溶液，将沉淀重新溶解，并将重悬液转移至1.5ml ep管中，置于37℃摇床中，振荡1小时。之后将ep管12000g离心10min，并将上清液转移至含有200μl peg/nacl溶液的ep管中。将ep管置于4℃，静置1小时沉降噬菌体。之后将ep管12000g离心20min，弃上清液，加入100μl pbs重悬沉淀。
[0033]
第1轮筛选
[0034]
1.1、pd-l1蛋白质的包被
[0035]
将500μl pd-l1蛋白溶液加入24孔板中，并将24孔板置于湿盒中。将湿盒置于翘板摇床上，4℃过夜包被。
[0036]
1.2、pd-1蛋白质的包被
[0037]
使用移液枪将24孔板中的液体吸净，并在无菌滤纸上拍甩孔板以彻底除净液体。将500μl pd-1蛋白溶液加入24孔板中，并将24孔板置于湿盒中，4℃过夜包被。
[0038]
1.3、pd-l1/pd-1蛋白质的封闭
[0039]
使用移液枪将24孔板中的液体吸净，并在无菌滤纸上拍甩孔板以彻底除净液体。加入2ml 0.5％bsa封闭液。将孔板置于翘板摇床上，封闭1小时。
[0040]
1.4、洗涤
[0041]
使用移液枪将24孔板中的液体洗净，并在无菌滤纸上拍甩孔板以彻底除净液体。加入1ml无菌pbst溶液，并将孔板置于翘板摇床上。5min后再次吸弃并拍甩孔板中的液体，加入1ml无菌pbst溶液，并将孔板置于翘板摇床上。重复该步骤6次，从而彻底洗净孔板中多余的封闭液。
[0042]
、噬菌体7肽库与pd-l1蛋白质的结合
[0043]
取无菌ep管，加入1ml pbs溶液以及10μl(2
×
10
11
pfu)7肽噬菌体文库，通过涡旋进行混合。将混合液加入24孔板中，并将孔板置于翘板摇床上，室温孵育1小时。
[0044]
、收集未结合的噬菌体
[0045]
使用移液枪将24孔板中的液体收集到无菌ep管中。加入少量无菌pbs溶液洗涤，保证未结合的噬菌体全部被收集。
[0046]
二到四轮重复筛选
[0047]
pd-l1蛋白质的包被
[0048]
将500μl pd-l1蛋白溶液加入24孔板中，并将24孔板置于湿盒中。将湿盒置于翘板摇床上，4℃过夜包被。
[0049]
pd-l1蛋白质的封闭
[0050]
使用移液枪将24孔板中的液体洗净，并在无菌滤纸上拍甩孔板以彻底除净液体。加入2ml 0.5％bsa封闭液。将孔板置于翘板摇床上，封闭1小时。
[0051]
洗涤
[0052]
使用移液枪将24孔板中的液体洗净，并在无菌滤纸上拍甩孔板以彻底除净液体。加入1ml无菌pbst溶液，并将孔板置于翘板摇床上。5min后再次吸弃并拍甩孔板中的液体，加入1ml无菌pbst溶液，并将孔板置于翘板摇床上。重复该步骤6次，从而彻底洗净孔板中多余的封闭液。
[0053]
噬菌体子文库与pd-l1蛋白质的结合
[0054]
取无菌ep管，加入1ml pbs溶液以及噬菌体子文库(2
×
10
11
pfu)，通过涡旋进行混合。将混合液加入24孔板中，并将孔板置于翘板摇床上，室温孵育1小时。
[0055]
洗涤
[0056]
使用移液枪将24孔板中的液体洗净，并在无菌滤纸上拍甩孔板以彻底除净液体。加入1ml无菌pbst溶液，并将孔板置于翘板摇床上。5min后再次吸弃并拍甩孔板中的液体，加入1ml无菌pbst溶液，并将孔板置于翘板摇床上。重复该步骤10次，从而彻底洗净孔板中与pd-l1蛋白不结合或结合不牢固的噬菌体。
[0057]
洗脱及中和
[0058]
将孔板中的pbst洗涤液尽量除去，然后向细胞培养瓶中加入800μl洗脱缓冲液(1mg ml-1
bsa，0.1m甘氨酸，ph＝2.2)，在冰上培养15分钟，向混合物中加入200μl tris-hcl以中和洗脱液。
[0059]
第二到四轮的筛选
[0060]
按照相同的步骤进行第二、三、四轮的筛选，将每一轮扩增纯化后的噬菌体溶液作为下一轮筛选的次级噬菌体肽库。每一轮筛选的噬菌体投入量保持一致，测定每轮筛选洗脱产物的滴度作为每轮噬菌体输出量分别为4.4
×
105,6.82
×
105,and 7.11
×
105pfu ml-1
，并计算每轮噬菌体的输出/投入比分别为2.2
×
10-6
，3.41
×
10-6
，3.56
×
10-6
。
[0061]
噬菌体输出结果如图1所示，图1为利用噬菌体7肽库对pd-l1蛋白特异性结合多肽的三轮重复筛选实验结果图。实验结果显示在同样的噬菌体投入量下，噬菌体输出逐轮递增，表明与pd-l1亲和性强的噬菌体得到有效富集。
[0062]
测试1：噬菌体阳性单克隆
[0063]
将第二、三、四轮的洗脱产物进行滴度测定。选择噬菌斑个数为30～300个的平板，随机挑取50个噬菌体蓝斑，加入50个含5ml lb培养基的摇菌管中，37℃，220rpm振荡培养24小时。每个单克隆取700μl培养物加入含300μl甘油(50％)溶液的ep管中，混匀后放入-80℃冰箱保存。剩余菌液进行测序处理。
[0064]
测试2：分析噬菌体单克隆的dna序列。
[0065]
使用dnastar软件分析多肽的氨基酸序列，利用cabs-dock网站模拟多肽和蛋白质的结合位点。
[0066]
多肽的氨基酸序列具体分别为包含有hwfhrhh序列、wslgytg序列、lplitfn序列、aflrhda序列、cnqypst序列、dvttisn序列、fhnpqll序列、gmhkslp序列、hltserl序列及ktyslpa序列等50个测试序列。其他序列还有如nssphqi、qlipwpr、sglhyal等。
[0067]
结果如图2及图3所示。图2为阳性单克隆噬菌体出现频次大于(含等于)2的多肽序列及其重复次数。其中hwfhrhh多肽序列的噬菌体出现5次，wslgytg多肽序列的噬菌体出现4次，lplitfn多肽序列的出现2次。
[0068]
图3为多肽序列与pd-l1蛋白结合位点的模拟图，从图中可见hh多肽与pd-l1蛋白
的结合位点与pd-1蛋白和pd-l1蛋白的结合位点相似。
[0069]
测试3：通过噬菌体酶联免疫吸附实验检测阳性噬菌体与pd-l1蛋白的亲和力。
[0070]
1)阳性单克隆噬菌体的扩增及纯化
[0071]
从-80℃冰箱中取出冻存的e.coil.er2738菌种，使用枪头挑取少量冰渣加入到含有6ml lb培养基(含四环素)的摇菌管中，37℃220rpm振荡培养过夜。在5个250ml锥形瓶中加入20ml lb培养基，高温高压灭菌后加入500μl过夜培养的菌液。37℃220rpm振荡培养直至细菌处于对数生长中期。
[0072]
从-80℃冰箱中取出冻存的3个阳性单克隆噬菌体样品、1个野生噬菌体、1个对照组噬菌体(多肽序列为ggggggg)样品，待样品融化后取100μl加入5个锥形瓶中。室温静置20min后，放入37℃摇床中，220rpm振荡培养4.5小时。取培养液加入5个50ml离心管中12000g离心20min。将上清液倒入5个含有4ml peg/nacl溶液的离心管中，置入4℃冰箱中，过夜沉降。第二天，将该离心管12000g离心20min，弃上清液。在离心管中加入1ml pbs溶液，将沉淀重新溶解，并将重悬液转移至1.5ml ep管中，置于37℃摇床中，振荡1小时。之后将ep管12000g离心10min，并将上清液转移至含有200ml peg/nacl溶液的ep管中。将ep管置于4℃，静置1小时沉降噬菌体。之后将ep管12000g离心20min，弃上清液，加入100μl pbs重悬沉淀。
[0073]
3个阳性单克隆噬菌体样品具体分别为包含有hwfhrhh序列、wslgytg序列及lplitfn序列的噬菌体。
[0074]
2)pd-l1蛋白的包被及封闭
[0075]
将pd-l1蛋白溶液加入96孔板中，并将96孔板置于湿盒中。将湿盒置于翘板摇床上，4℃过夜包被。使用移液枪将96孔板中的液体洗净，并在无菌滤纸上拍甩孔板以彻底除净液体。加入200μl 0.5％bsa封闭液。将孔板置于翘板摇床上，封闭1小时。
[0076]
3)洗涤
[0077]
使用移液枪将96孔板中的液体洗净，并在无菌滤纸上拍甩孔板以彻底除净液体。加入1ml pbst溶液，并将孔板置于翘板摇床上。5min后再次吸弃并拍甩孔板中的液体，加入1ml pbst溶液，并将孔板置于翘板摇床上。重复该步骤6次，从而彻底洗净孔板中与pd-l1蛋白结合或结合不牢固的噬菌体。
[0078]
4)阳性单克隆噬菌体与pd-l1蛋白的结合
[0079]
在96孔板中加入相同浓度的5种噬菌体，室温孵育1小时。
[0080]
5)洗涤
[0081]
使用移液枪将96孔板中的液体洗净，并在无菌滤纸上拍甩孔板以彻底除净液体。加入1ml pbst溶液，并将孔板置于翘板摇床上。5min后再次吸弃并拍甩孔板中的液体，加入1ml pbst溶液，并将孔板置于翘板摇床上。重复该步骤6次，从而彻底洗净孔板中与pd-l1蛋白不结合或结合不牢固的噬菌体。
[0082]
6)一抗结合
[0083]
在96孔板中加入噬菌体pviii蛋白抗体，将平板放入37℃培养箱中静置1小时。
[0084]
7)洗涤
[0085]
使用移液枪将96孔板中的液体洗净，并在无菌滤纸上拍甩孔板以彻底除净液体。加入1ml pbst溶液，并将孔板置于翘板摇床上。5min后再次吸弃并拍甩孔板中的液体，加入
1ml pbst溶液，并将孔板置于翘板摇床上。重复该步骤6次。
[0086]
8)二抗结合
[0087]
在96孔板中加入偶联辣根过氧化物酶的二抗，将平板放入37℃培养箱中静置1小时。
[0088]
9)洗涤
[0089]
使用移液枪将96孔板中的液体洗净，并在无菌滤纸上拍甩孔板以彻底除净液体。加入1ml pbst溶液，并将孔板置于翘板摇床上。5min后再次吸弃并拍甩孔板中的液体，加入1ml pbst溶液，并将孔板置于翘板摇床上。重复该步骤3次。
[0090]
10)显色
[0091]
在96孔板中加入显色底物tmb，将平板放入37℃培养箱中静置15min。
[0092]
11)终止
[0093]
在96孔板中加入2m硫酸溶液终止反应。
[0094]
12)结果的测量
[0095]
通过酶标仪测量450nm处的吸光光度值。保存结果并进行分析。
[0096]
结果如图4所示，3种工程型噬菌体与pd-l1蛋白结合的强度均高于野生型噬菌体及对照组噬菌体，其中展示有hwfhrhh序列的噬菌体与pd-l1蛋白的结合明显强于其他噬菌体。
[0097]
本发明涉及的氨基酸序列如下：
[0098]
seq id no.1；
[0099]
名称：多肽1的氨基酸序列
[0100]
来源：人工序列(artificial sequence)
[0101]
hwfhrhh
[0102]
seq id no.2；
[0103]
名称：多肽2的氨基酸序列
[0104]
来源：人工序列(artificial sequence)
[0105]
lplitfn
[0106]
seq id no.3；
[0107]
名称：多肽3的氨基酸序列
[0108]
来源：人工序列(artificial sequence)
[0109]
wslgytg。
技术特征：1.一种靶向pd-l1蛋白的多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列为no.1～no.3所示之一。2.一种生物活性物质，其特征在于：包含权利要求1所述的多肽，还包括共价键连接的化合物或纳米颗粒、工程化的噬菌体等微生物、多聚体混合物。3.一种多聚核苷酸序列，其特征在于：能够编码权利要求1所述的多肽，或者能够编码权利要求2所述的生物活性物质。4.一种多肽类药物，其特征在于：包含权利要求1所述的多肽。5.权利要求1所述多肽、权利要求2所述生物活性片段、权利要求3所述的多聚核苷酸序列、权利要求4所述的多肽类药物的应用，其特征在于：在制备用于肿瘤靶向治疗的生物医学材料和药物中的应用。6.权利要求5所述的应用，其特征在于：在制备用于通过靶向结合pd-l1蛋白实现肿瘤靶向治疗的生物医学材料和药物中的应用。
技术总结本发明公开了一种靶向PD-L1蛋白的多肽及其用途。所述多肽的氨基酸序列分别为:HWFHRHH、LPLITFN、WSLGYTG。所述多肽能够高效靶向PD-L1蛋白，阻断PD-L1与程序性死亡受体1(PD-1)间的免疫检查点识别，从而阻断肿瘤免疫逃逸，重建机体的免疫反应，进而起到抑制肿瘤生长的作用，对PD-L1蛋白具有特异性靶向结合能力，为临床上肿瘤的免疫治疗提供了新的思路。路。路。
技术研发人员：毛传斌 岳慧 杨明英
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2022.06.23
技术公布日：2022/11/1
