snp位点及其引物、探针和检测试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一组snp位点及其应用，检测所述snp位点的引物和探针，以及包括所述引物和探针的检测试剂盒。
背景技术：2.器官移植通常是将健康的器官移植到受者体内，使之迅速恢复功能的手术。器官移植后容易发生排斥反应，所以要进行器官移植监测。目前，实体器官移植术后，移植物的健康监测通常采用抽血进行肝功能检查，或穿刺针采集组织进行病理学检查。
3.对于常规抽血功能检查，其各项指标如肌酐、alt、ast、胆红素等等灵敏度和特异性均不高，无法准确的反应移植物的健康状况。
4.对于目前金标准的组织活检，其虽可直接的反应移植物的健康状况。但存在以下重大缺点：
5.(1)侵入式检测，对病人造成较大痛苦，同时对移植物造成损伤；
6.(2)检出异常时，移植物实质性损伤已经发生，并且损伤往往已经较为严重，这时对于临床医生来说拯救移植物往往已经太晚；
7.(3)若穿刺针未采集到移植物的病灶组织部分，会对结果准确性造成较大影响，因此准确性和灵敏度不高。
8.在上述背景下，寻求一种灵敏度高，特异性强，能够准确的评估实体器官移植物的损伤状况和排斥风险的无创检测方法具有重要意义。
9.发明人的在先专利，如cn201710348135.0、cn201910452358.0、cn202011026555.5分别提出了针对肝移植、肾移植、肺移植术后移植物损伤状况和排斥风险的检测试剂盒及检测方法。但是，在先技术基于数字pcr反应体系是一管pcr反应仅检测一个snp位点，由于数字pcr成本较高，导致在先申请所述的检测方法检测成本过高。因此，有必要引入多重pcr的思路进一步有效降低检测成本。
技术实现要素：10.本发明的一个目的是提供一组snp位点及其在制备评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥风险的产品中的应用；本发明的另一个目的是提供一种用于检测上述snp位点的引物和探针，以及包括所述引物和探针的试剂盒。通过对移植后受体总游离dna的上述24个snp位点进行检测，最终获得供者游离dna/总游离dna的比值，即gcfdna供者含量比。根据gcfdna供者含量比快速而准确地判断移植排斥的程度。
11.此外，本发明提供一种检测总游离dna中供体游离dna含量的方法，引入多重荧光pcr方法，对在先的一管pcr反应检测一个snp位点的技术进行改进，得到一管pcr反应可以检测多个snp位点的方法。
12.本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
13.第一方面，本发明提供一组snp位点，所述snp位点为rs2242301、rs1318、
rs748384、rs260502、rs1210635、rs1038394、rs26801、rs2075386、rs2242349、rs1039322、rs803092、rs1800738、rs854792、rs1805790、rs730121、rs1124119、rs1882881、rs2235116、rs2235148、rs742018、rs2028566、rs33204、rs1040383、rs2235512的组合，所述snp位点用于评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥风险，实体器官包括肝、肾、心、肺。
14.本发明研究表明，将上述24个snp位点作为检测靶点，计算得到的总游离dna中供者游离dna的含量，即gcfdna供者含量比，能够准确反映出移植排斥的程度，为临床检测实体器官移植术后移植物损伤和排斥风险提供了一种简单而有效的检测手段。
15.第二方面，本发明提供一种snp位点在制备评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥风险的产品中的应用，实体器官包括肝、肾、心、肺，所述snp位点为rs2242301、rs1318、rs748384、rs260502、rs1210635、rs1038394、rs26801、rs2075386、rs2242349、rs1039322、rs803092、rs1800738、rs854792、rs1805790、rs730121、rs1124119、rs1882881、rs2235116、rs2235148、rs742018、rs2028566、rs33204、rs1040383、rs2235512的组合。
16.优选的，所述产品通过检测待测样品中的总游离dna中供体游离dna含量来评估实体器官移植术后移植物排斥风险。
17.第三方面，本发明提供一种用于评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥风险的引物和探针，所述引物为seq id no.1-48所示的序列，所述探针为seq id no.49-96所示的序列。
18.具体的，所述seq id no.1-48所示的引物和seq id no.49-96所示的探针用于扩增、检测上述24个snp位点，每一个snp位点对应的上下游引物和探针如下所示：
19.表1本发明涉及的引物探针编号
20.21.[0022][0023]
本发明所述的seq id no.1-96的序列如下所示：
[0024]
表2本发明涉及的引物探针序列
[0025]
[0026]
[0027][0028]
第四方面，本发明提供一种上述引物和探针在制备评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥风险的产品中的应用。
[0029]
第五方面，本发明提供一种用于评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥风险的试剂盒，所述试剂盒中包括seq id no.1-48所示的引物和seq id no.49-96的探针。具体的，所述seq id no.1-48所示的引物和seq id no.49-96所示的探针用于扩增、检测上述24个snp位点。
[0030]
优选的，所述试剂盒为基于数字pcr平台的试剂盒。
[0031]
所述探针的5’端均连接报告荧光基团，其中任意12个snp位点的探针对5’端分别连接fam和vic/hex/joe/tex的报告荧光基团；另外12个snp位点的探针对5’端分别连接rox和cy5的报告荧光基团。
[0032]
本发明所述的“vic/hex/joe/tex”表示vic、hex、joe、tex中的一种。
[0033]
所述探针的3’端标记淬灭荧光基团，淬灭荧光基团为nfq或者mgb。
[0034]
为了更加清楚的描述本发明提供的试剂盒中探针荧光标记情况，举一个实例进行说明：
[0035]
例如，检测rs2242301和rs1318两个snp位点的探针标记情况为：
[0036]
rs2242301
[0037]
探针1：fam-ggcagcttgtgcata-mgb
[0038]
探针2：vic/hex/joe/tex-ggcggcttgtgcata-mgb
[0039]
rs1318
[0040]
探针1：rox-tatctacaccaccca-mgb
[0041]
探针2：cy5-tatttacaccaccca-mgb
[0042]
本发明提供的用于检测24个snp位点的24对探针，有12对探针5’端标记的报告荧光基团为fam和vic/hex/joe/tex；其余12对探针5’端标记的报告荧光基团为rox和cy5。
[0043]
在进行数字pcr分析时，选取标记fam和vic/hex/joe/tex的一个探针对(如上rs2242301)，和标记了rox和cy5的一个探针对(如上rs1318)加入到一管反应体系中进行分析检测。
[0044]
所述试剂盒中还包括pcr技术常用的试剂，如ddpcr
tm
probesupermix和超纯水。
[0045]
第六方面，本发明提供一种检测总游离dna中供者游离dna含量的方法，包括如下步骤：
[0046]
步骤1：以待测样品的总游离dna为模板，分别将5’端标记fam和vic/hex/joe/tex的一个snp位点的探针对及其对应的引物，和5’端标记rox和cy5的一个snp位点的探针对及其对应的引物加入到一个反应体系中，制备得到一管数字pcr反应微滴；依此方式共制备得到12管数字pcr反应微滴进行数字pcr反应，；
[0047]
步骤2：反应结束后，分析每一管中的snp位点，计算gcfdna供者含量比，即供者游离dna/总游离dna的比值。
[0048]
其中，gcfdna供者含量比的分析计算方法如下：
[0049]
若该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0.9-1，视该位点数据为无效数据；
[0050]
若该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0，即仅有一种碱基阳性，视该位点数据为无效数据；
[0051]
若该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0-0.9，视该位点数据为有效数据；在有效数据中，以snpno#1和snpno#2为例，当snpno#1的碱基比约等于snpno#2的两倍(2
±
0.4)，则判定snpno#1中，移植受者和移植供者均为纯合子；在snpno#2中，移植受者为纯合子，移植供者为杂合子；选择判定移植受者和移植供者均为纯合子的snp位点，采用碱基低含量/总含量，计算得到该位点的供者含量比，再将所有符合该条件snp位点的比值求平均值，即为gcfdna供者含量比。
[0052]
本发明中所述的“该位点两种碱基”是指表2中某一个snp位点对应的一对探针中标注下划线的碱基。
[0053]
本发明中所述的“snpno#1和snpno#2”是指本发明提供的24个snp位点中的任意两个。
[0054]
所述步骤1中待测样品为血液或者尿液。
[0055]
第一种情况：肝移植
[0056]
所述待测样品为血液，gcfdna供者含量比≤10％，表示受者肝移植物排斥风险低；gcfdna供者含量比＞10％，表示受者肝移植物排斥风险高；
[0057]
或者，所述待测样品为尿液，gcfdna供者含量比≤2.5％，表示受者肝移植物排斥
风险低；gcfdna供者含量比＞2.5％，表示受者肝移植物排斥风险高。
[0058]
第二种情况：肾移植
[0059]
所述待测样品为血液，gcfdna供者含量比≤1％，表示受者肾移植物排斥风险低；gcfdna供者含量比＞1％，表示受者肾移植物排斥风险高；
[0060]
或者，所述待测样品为尿液，gcfdna供者含量比≤10％，表示受者肾移植物排斥风险低；gcfdna供者含量比＞10％，表示受者肾移植物排斥风险高。
[0061]
第三种情况：心移植
[0062]
所述待测样品为血液，gcfdna供者含量比≤0.3％，表示受者心移植物排斥风险低；gcfdna供者含量比＞0.3％，表示受者心移植物排斥风险高；
[0063]
或者，所述待测样品为尿液，gcfdna供者含量比≤0.1％，表示受者心移植物排斥风险低；gcfdna供者含量比＞0.1％，表示受者心移植物排斥风险高。
[0064]
第四种情况：肺移植
[0065]
所述待测样品为血液，gcfdna供者含量比≤8.2％，表示受者肺移植物排斥风险低；gcfdna供者含量比＞8.2％，表示受者肺移植物排斥风险高；
[0066]
或者，所述待测样品为尿液，gcfdna供者含量比≤0.8％，表示受者肺移植物排斥风险低；gcfdna供者含量比＞0.8％，表示受者肺移植物排斥风险高。
[0067]
本发明所述的数字pcr反应的反应体系为：
[0068][0069][0070]
在本发明提供的具体实施例中，所述pcr反应程序如下：95℃、10min预变性；95℃、15s，57℃、1min，40个循环；95℃保持10min；10℃保存。
[0071]
本发明提供了一组snp位点在评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥风险中的应用，通过对移植后受体总游离dna的24个特定snp位点进行检测，结合数字pcr技术以及特定的计算方法，最终获得总游离dna中供者游离dna的含量，即gcfdna供者含量比，根据gcfdna供者含量比判断移植排斥的程度，为临床检测器官移植术后移植物损伤和排斥风险提供了一种简单而有效的辅助手段。若没有特别说明，本发明提到的实体器官包括肝、肾、心、肺。
[0072]
本技术提供的用于评估器官移植术后移植物损伤及排斥风险的试剂盒，与现有技
术相比，具有如下优势：
[0073]
(1)无创，可采用尿液作为生物样品，尿液收集便捷，可实现频繁监测，也可采用静脉血进行检测。
[0074]
(2)灵敏度高，本发明所述的数字pcr设备是现有pcr技术中精准度最高的检测平台，本发明采用数字pcr设备进行检测，灵敏度高；
[0075]
(3)实现早期监测，本发明选用核酸分子作为检测靶点，这些靶点的变化发生在器官病变或损伤的最早期；
[0076]
(4)特异性强，本发明提供24个特定snp位点进行检测，检测特异性高，可特异性的反映出移植物的健康状况；
[0077]
(5)相比本领域其它检测方法，如测序、dsa检测等需要移植受者和移植供者双方的样本相比，该方法无需移植供者样本，仅需受者尿液样本即可完成。
具体实施方式
[0078]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0079]
肝移植临床应用实例
[0080]
一，待检测的snp位点
[0081]
snp位点为rs2242301、rs1318、rs748384、rs260502、rs1210635、rs1038394、rs26801、rs2075386、rs2242349、rs1039322、rs803092、rs1800738、rs854792、rs1805790、rs730121、rs1124119、rs1882881、rs2235116、rs2235148、rs742018、rs2028566、rs33204、rs1040383、rs2235512的组合。
[0082]
二，检测试剂盒
[0083]
所述试剂盒中用于检测上述24个snp位点的引物和探针如下表所示：
[0084]
表3
[0085]
[0086]
[0087][0088]
试剂盒中还包括ddpcr
tm
probesupermix和超纯水。
[0089]
三，评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险的方法
[0090]
s1血浆中总游离dna提取
[0091]
(1)使用streck无创采血管静脉采集一名肝移植术后2周受者血液10ml；
[0092]
(2)将streck无创采血管采集的血液转移至15ml离心管中，低温4℃2000g离心10min；取上层血浆约4-6ml于新的15ml离心管中，继续低温4℃4000g离心10min；取上层血浆4-6ml于新的15ml离心管中；
[0093]
(3)取4ml血浆，使用qiagen公司qiaamp circulating nucleic acid kit进行总游离dna的提取，调整dna浓度为10-40ng/ul。
[0094]
s2制备数字pcr反应微滴
[0095]
(1)配置数字pcr反应体系，取上表中相邻两个snp位点的引物和探针加入一个反
应体系中制备得到一管数字pcr反应微滴，进行pcr反应，24个snp位点的检测体系，共计12管，反应配制如下：
[0096]
成分体积ddpcr
tm
probesupermix10μl一个snp位点的引物和探针各0.25μl，共0.5μl另一个snp位点的引物和探针各0.25μl，共0.5μl总游离dna2μl超纯水7μl共计20μl
[0097]
(2)将配置好的反应体系加入到微滴发生卡dg8 tm cartridges的样品槽中，在发生油槽中加入60ul微滴发生油droplet generation oil for probes，最后用封膜dg8 tm gaskets封好，置于微滴发生仪上，进行反应微滴的制备；
[0098]
(3)将制备好的反应微滴缓慢转移至96孔板中，然后用铝制封膜配合封膜机器热封好后进行pcr反应，反应程序设置如下：95℃、10min预变性；95℃、15s，57℃、1min，40个循环；95℃保持10min；10℃保存。
[0099]
s3结果分析
[0100]
pcr反应结束后，将96孔板转移至qx200 tm数字pcr读取仪中，读取结果，如下表所示：
[0101]
表4
[0102]
[0103][0104]
对上表碱基比值进行分析，方法如下：
[0105]
若该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0.9-1，视该位点数据为无效数据；
[0106]
若该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0，即仅有一种碱基阳性，视该位点数据为无效数据；
[0107]
若该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0-0.9，视该位点数据为有效数据；在有效数据中，以snp rs748384和snp rs2075386为例，snp rs748384的碱基比是snp rs2075386的2.125倍，则判定snp rs748384中，移植受者和移植供者均为纯合子；在snp rs2075386中，移植受者为纯合子，移植供者为杂合子。
[0108]
选择判定移植受者和移植供者均为纯合子的snp位点，采用碱基低含量/总含量，计算得到该位点的供者含量比值，再将所有符合该条件snp位点的比值求平均值，即为gcfdna供者含量比。
[0109]
评价标准：gcfdna供者含量比≤10％，表示受者肝脏移植物相对健康，排斥风险低；gcfdna供者含量比＞10％，表示受者肝脏移植物存在较重损伤，排斥风险高。
[0110]
根据表1的数据计算得到gcfdna供者含量比(供者游离dna/总游离dna)为25.9％，表示受者肝脏移植物存在较重损伤，排斥风险高。
[0111]
四，应用常规监测方法对上述评估结果进行验证
[0112]
使用edta采血管采集实施例1中肝移植术后2周受者的血液2ml，进行肝功常规检测，结果下表所示：
[0113]
表5
[0114]
检验项目 参考范围谷丙转氨酶alt121.0
↑
0-40u/l谷草转氨酶ast288.2
↑
0-40u/l谷草/谷丙ast/alt2.38
↑
1-2总蛋白tb7460-87g/l白蛋白alb4435-55g/l球蛋白glb26.520-30g/l白球比a/g1.661.5-2.5总胆红素tbili27.6
↑
5.1-19umol/l直接胆红素dbili7.8
↑
1.7-6.8umol/l间接胆红素ibili16
↑
0-12umol/l碱性磷酸酶alp8620-110u/lr-谷氨酰转肽酶ggt480-50u/l
[0115]
上表结果显示，该肝移植术后2周受者的肝脏移植物存在实质性损伤，和本发明检测结果吻合。
[0116]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
技术特征：1.snp位点，所述snp位点为rs2242301、rs1318、rs748384、rs260502、rs1210635、rs1038394、rs26801、rs2075386、rs2242349、rs1039322、rs803092、rs1800738、rs854792、rs1805790、rs730121、rs1124119、rs1882881、rs2235116、rs2235148、rs742018、rs2028566、rs33204、rs1040383、rs2235512的组合，所述snp位点用于评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥风险，实体器官包括肝、肾、心、肺。2.权利要求1所述的snp位点在制备评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥风险的产品中的应用，实体器官包括肝、肾、心、肺，所述snp位点为rs2242301、rs1318、rs748384、rs260502、rs1210635、rs1038394、rs26801、rs2075386、rs2242349、rs1039322、rs803092、rs1800738、rs854792、rs1805790、rs730121、rs1124119、rs1882881、rs2235116、rs2235148、rs742018、rs2028566、rs33204、rs1040383、rs2235512的组合。3.一种用于评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥风险的引物和探针，所述引物为seq id no.1-48所示的序列，所述探针为seq id no.49-96所示的序列；所述seq id no.1-48所示的引物和seq id no.49-96所示的探针用于扩增、检测权利要求1中所述的24个snp位点。4.一种权利要求3所述的引物和探针在制备评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥风险的产品中的应用。5.一种用于评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥风险的试剂盒，所述试剂盒中包括seq id no.1-48所示的引物和seq id no.49-96的探针；所述seq id no.1-48所示的引物和seq id no.49-96所示的探针用于扩增、检测权利要求1中所述的24个snp位点。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端均连接报告荧光基团，其中任意12个snp位点的探针对5’端分别连接fam和vic/hex/joe/tex的报告荧光基团；另外12个snp位点的探针对5’端分别连接rox和cy5的报告荧光基团；vic/hex/joe/tex”表示vic、hex、joe、tex中的一种；所述探针的3’端标记淬灭荧光基团，淬灭荧光基团为nfq或者mgb。7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括pcr技术常用的试剂，如ddpcr
tm
probesupermix和超纯水。8.一种检测总游离dna中供者游离dna含量的方法，包括如下步骤：步骤1：以待测样品的总游离dna为模板，分别将5’端标记fam和vic/hex/joe/tex的一个snp位点的探针对及其对应的引物，和5’端标记rox和cy5的一个snp位点的探针对及其对应的引物加入到一个反应体系中，制备得到一管数字pcr反应微滴；依此方式共制备得到12管数字pcr反应微滴进行数字pcr反应，；步骤2：反应结束后，分析每一管中的snp位点，计算gcfdna供者含量比，即供者游离dna/总游离dna的比值；其中，gcfdna供者含量比的分析计算方法如下：若该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0.9-1，视该位点数据为无效数据；若该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0，即仅有一种碱基阳性，视该位点数据为无效数据；若该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0-0.9，视该位点数据为有效数据；在有效数据中，以snpno#1和snpno#2为例，snpno#1的碱基比约等于snpno#2的两倍(2
±
0.4)，则判定
snpno#1中，移植受者和移植供者均为纯合子；在snpno#2中，移植受者为纯合子，移植供者为杂合子；选择判定移植受者和移植供者均为纯合子的snp位点，采用碱基低含量/总含量，计算得到该位点的供者含量比值，再将所有符合该条件snp位点的比值求平均值，即为gcfdna供者含量比。9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1中待测样品为血液或者尿液。10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1中数字pcr反应的反应体系为：成分体积ddpcr
tm
probesupermix10μl一个snp位点的引物和探针各0.25μl，共0.5μl另一个snp位点的引物和探针各0.25μl，共0.5μl总游离dna2μl超纯水7μl共计20μl所述pcr反应程序如下：95℃、10min预变性；95℃、15s，57℃、1min，40个循环；95℃保持10min；10℃保存。
技术总结本发明公开了24个SNP位点以及所述SNP位点在制备评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥风险的产品中的应用。本发明研究发现，将上述24个SNP位点作为检测靶点，计算得到的总游离DNA中供体游离DNA的含量，即GcfDNA供者含量比，能够准确反映出移植排斥的程度，为临床检测实体器官移植术后移植物损伤和排斥风险提供了一种简单而有效的检测手段。为此，本发明还提供了用于检测所述SNP位点的引物和探针，以及包括所述引物和探针的试剂盒。以及包括所述引物和探针的试剂盒。
技术研发人员：魏亮
受保护的技术使用者：成都仕康美生物科技有限公司
技术研发日：2022.05.25
技术公布日：2022/11/1
