1.本发明属于模式生物线虫分析及微流控技术领域，具体涉及一种单线虫直接加样微流控芯片及其使用方法。
背景技术：2.秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans)是一种重要的模式生物，已在胚胎发育、细胞凋亡、dna损伤和修复、衰老和寿命等生物医药相关研究领域中得到广泛的应用。常规线虫研究往往采用线虫群体的研究结果，难以对单个线虫实现精确的刺激传递、操控和追踪，难以获得单线虫的分析检测数据，在一定程度上影响了结果的准确性和研究深度。单线虫水平的研究充分考虑了线虫的个体差异，可以获得更丰富、更准确的信息，从而避免群体研究时平均值所带来的偏差。单线虫的分离和操控对于单线虫的研究有很重要的意义，但传统研究手段难以实现对一定数量单线虫的精确控制，且现有方法可能会对线虫生理产生影响。微流控芯片，又叫芯片实验室(lab-on-a-chip)，是一种在微米尺度操控流体的科学和技术，具有微型化、集成化、高通量、自动化等优势，可以在微小平台上实现常规化学或生物实验室的各种功能，已成为线虫研究的强大工具，可实现单线虫的分离、控制和检测，获得更多、更准确的数据。但是，已有的微流控单线虫分离和加样方法，通常需要复杂的微流控结构设计和加工方法，以及特殊的线虫分离和加样流程，导致单线虫加样过程难度大、时间长、结果重复性较差，且实现单线虫100％进样率的难度较大，在实际应用中存在诸多不足之处，限制了单线虫研究的广泛开展。
技术实现要素：3.为解决上述问题，本发明提供了一种单线虫直接加样微流控芯片及其使用方法，该微流控芯片尤其适用于简便、快速的单线虫加样以及单线虫并行控制和检测，有利于更方便的获得单线虫分析检测结果，为基于单线虫的模式生物研究和应用提供有效的技术方案。
4.为了实现上述目的，本发明提供了一种单线虫直接加样微流控芯片，包括微通道结构层和芯片底板，所述微通道结构层上包括顺序连接的进液单元、单线虫并行分析单元和出液单元；
5.所述单线虫并行分析单元由若干组并行排列的单线虫分析结构组成，每组中的单线虫分析结构包括单线虫培养池，所述单线虫培养池的相对两端分别与培养池进液通道和培养池出液通道连接，所述单线虫培养池还与线虫加样通道的一端连接，所述线虫加样通道的另一端与线虫加样口连接；所述进液单元与培养池进液通道连接，所述出液单元与培养池出液通道连接；
6.所述培养池进液通道、培养池出液通道、线虫加样通道均为与单线虫培养池连接的一侧起内径逐渐增大，所述培养池进液通道和所述培养池出液通道的内径最小处小于单线虫样品的直径，线虫加样通道的内径最小处与单线虫样品的直径相当。
7.进一步地，上述技术方案中，所述进液单元由液体入口和进液分液通道结构组成，所述进液分液通道结构的一端与液体入口连接，所述进液分液通道结构的另一端与培养池进液通道连接；所述进液分液通道结构为由液体入口并行分流至各组单线虫分析结构的培养池进液通道。
8.进一步地，上述技术方案中，所述出液单元包括液体出口和出液分液通道结构，所述出液分液通道结构的一端与液体出口连接，所述出液分液通道结构的另一端与培养池出液通道连接；所述出液分液通道结构为由各组单线虫分析结构的培养池出液通道并行汇流至液体出口。
9.进一步地，上述技术方案中，所述单线虫并行分析单元为至少一组，当所述单线虫并行分析单元为两组以上时，每组单线虫并行分析单元与同一液体入口连接，每组单线虫并行分析单元分别与不同的液体出口连接。
10.进一步地，上述技术方案中，所述微通道结构层设有通道的一侧与芯片底板封接。
11.进一步地，上述技术方案中，所述微通道结构层为透气的弹性硅橡胶材料，包括聚二甲基硅氧烷pdms；所述芯片底板为透光材料，包括玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯pmma、聚碳酸酯pc。
12.进一步地，上述技术方案中，所述培养池进液通道和培养池出液通道与单线虫培养池相连的部分的宽度均小于单线虫样品的直径，深度与单线虫样品的直径相当。
13.进一步地，上述技术方案中，所述单线虫培养池为椭圆形或圆形，单线虫培养池的直径大于单线虫样品的最大长度，深度大于单线虫样品的直径。
14.进一步地，上述技术方案中，所述线虫加样通道为锥形结构且其与单线虫培养池相连的深度和最小宽度均与单线虫样品的直径相当。
15.进一步地，上述技术方案中，所述单线虫并行分析单元中的单线虫分析结构的数量至少为4个或4个的偶数倍。
16.本发明还提供了单线虫直接加样微流控芯片的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
17.①
微流控芯片准备：通过液体入口向微流控芯片结构中注入线虫培养液；
18.②
单线虫取样：将线虫悬液混匀，按其密度多次吸取含有单线虫的液滴，然后在显微镜下观察，筛选出含有合适体宽的单线虫液滴并进行标记；
19.③
单线虫加样与补样：依次将含有合适体宽单线虫的液滴从相应的线虫加样口处注入各单线虫培养池；第一轮加样结束后，通过显微镜观察是否存在加样失败的情况，若有，则进行补样操作，至全部单线虫培养池的加样率达到100％；
20.④
线虫加样口封闭：将所有的线虫加样口封闭，即完成单线虫加样过程；
21.⑤
单线虫培养与观测：通过进液单元和出液单元进行各单线虫培养池中培养液的更换以及虫卵和子代线虫的清除，实现单线虫长期培养以及定期观测。
22.本发明具有以下有益效果：
23.1.本发明设计了一种单线虫分析结构并提出了单线虫直接加样方法，可实现单线虫的直接加样、控制、长期培养及检测，提高了单线虫加样过程的简便性和可靠性。
24.2.本发明进一步设计了集成单线虫分析结构阵列的微流控芯片，通过单线虫直接加样方法，可完成一定数量单线虫的快速加样和长期分析，可提高单线虫分析方法的实用
性，有利于构建单线虫分析微流控芯片系统。
附图说明
25.图1是单线虫直接加样微流控芯片组成示意图。
26.图2是微通道结构层结构示意图。
27.图3是单线虫并行分析单元中的一个单线虫分析结构的示意图。
28.图4是含有两组单线虫并行分析单元的微流控芯片示意图。
29.图中：1、微通道结构层，2、芯片底板；11、进液单元，111、液体入口，112、进液分液通道结构；12、单线虫并行分析单元，121、培养池进液通道，122、单线虫培养池，123、培养池出液通道，124、线虫加样口，125、线虫加样通道；13、出液单元，131、液体出口，132、出液分液通道结构。
具体实施方式
30.下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。本发明所述微流控芯片的示意图中，结构尺寸均未标注，主要体现其结构构造，实际生产使用过程中，可以根据需要调整结构比例和尺寸。
31.实施例1
32.下面结合附图对本发明作进一步描述。图1示出了本发明单线虫直接加样微流控芯片组成示意图，图2为微通道结构层结构示意图，图3为单线虫并行分析单元中的一个单线虫分析结构的示意图。由图1所示，本发明单线虫直接加样微流控芯片，从上到下依次由微通道结构层1及芯片底板2组成。由图2-图3所示，所述微通道结构层由进液单元11、单线虫并行分析单元12和出液单元13按顺序连接而成。所述的进液单元11包括液体入口111和进液分液通道结构112，所述进液分液通道结构112的一端与液体入口111连接，所述进液分液通道结构112的另一端与培养池进液通道121连接；所述进液分液通道结构112为由液体入口111并行分流至各组单线虫分析结构的培养池进液通道121。
33.单线虫并行分析单元12由若干并行排列的单线虫分析结构组成，每组中的单线虫分析结构包括单线虫培养池122，所述单线虫培养池122的相对两端分别与培养池进液通道121和培养池出液通道123连接，所述单线虫培养池122还与线虫加样通道125的一端连接，所述线虫加样通道125的另一端与线虫加样口124连接；所述进液单元11与培养池进液通道121连接，所述出液单元13与培养池出液通道123连接；
34.所述培养池进液通道121、培养池出液通道123、线虫加样通道125均为与单线虫培养池122连接的一侧起内径逐渐增大，所述培养池进液通道121和所述培养池出液通道123的内径最小处小于单线虫样品的直径，线虫加样通道125的内径最小处与单线虫样品的直径相当。
35.所述出液单元13包括液体出口131和出液分液通道结构132，所述出液分液通道结构132的一端与液体出口131连接，所述出液分液通道结构132的另一端与培养池出液通道123连接；所述出液分液通道结构132为由各组单线虫分析结构的培养池出液通道123并行汇流至液体出口131。
36.所述单线虫并行分析单元12，包括若干并行排列的单线虫分析结构，可进行多条
单线虫加样、控制和检测；每个单线虫分析结构(图3)中的单线虫培养池122用于单线虫正常生长，其尺寸根据线虫大小而设计，使培养池为线虫活动提供足够大的空间；同时，单线虫培养池122通过细通道分别与左、右的培养池进液通道121和培养池出液通道123相连，细通道的宽度小于线虫样品的直径，可将进入单线虫培养池122中的单线虫限制在培养池区域内，从而实现单线虫控制和长期观测；单线虫培养池122通过下方锥形的线虫加样通道125与线虫加样口124相连，锥形通道的深度和最小宽度与线虫样品的直径相当，使其不仅可以让线虫进入培养池，而且可以避免在培养池中进一步生长后的线虫自行进入线虫加样通道125。
37.本实施例中所用的微流控芯片含有8个单线虫分析结构(见图2)，芯片尺寸为40mm
×
30mm
×
4mm；其中，与单线虫培养池122相连的培养池进液通道121和培养池出液通道123的细通道宽度为20μm，深度为40μm，可将l4期秀丽隐杆线虫限制在培养池区域；单线虫培养池122为椭圆形结构，直径为1.5mm
×
1.35mm，可满足单个秀丽隐杆线虫成虫的正常活动需求。微流控芯片为双层结构，上层微通道结构层11采用软光刻法加工，由聚二甲基硅氧烷(pdms)在su-8模板上浇注而成，下层芯片底板12为平板玻璃、厚度为1.0mm，两层的封接面经等离子体清洗仪处理后贴合，实现紧密键合，即可得到所需的微流控芯片。
38.实施例2
39.本实施例中所用的微流控芯片含有两组单线虫并行分析单元，每组含有8个单线虫分析结构(见图4)，芯片尺寸为42mm
×
58mm
×
4mm；其中，每组单线虫并行分析单元可以分析一种线虫样品，每块芯片可以同时分析两种线虫样品。
40.实施例3
41.本发明所述单线虫直接加样微流控芯片的使用方法，其包括以下步骤：
42.①
微流控芯片准备：通过液体入口向微流控芯片结构中注入线虫培养液；
43.②
单线虫取样：将线虫悬液混匀，按其密度多次吸取含有单线虫的液滴，然后在显微镜下观察，筛选出含有合适体宽的单线虫液滴并进行标记；
44.③
单线虫加样与补样：依次将标记的单线虫液滴从相应的线虫加样口处缓慢注入各单线虫培养池；第一轮加样结束后，通过显微镜观察是否存在加样失败的情况，若有，则进行补样操作(即第二次加样)，至全部单线虫培养池的加样率达到100％；
45.④
线虫加样口封闭：将所有的线虫加样口封闭，即完成单线虫加样过程；
46.⑤
单线虫培养与观测：通过进液单元和出液单元进行各单线虫培养池中培养液的更换以及虫卵和子代线虫的清除，实现单线虫长期培养以及定期观测。
技术特征：1.一种单线虫直接加样微流控芯片，其特征在于：包括微通道结构层(1)和芯片底板(2)，所述微通道结构层(1)上包括顺序连接的进液单元(11)、单线虫并行分析单元(12)和出液单元(13)；所述单线虫并行分析单元(12)由若干组并行排列的单线虫分析结构组成，每组中的单线虫分析结构包括单线虫培养池(122)，所述单线虫培养池(122)的相对两端分别与培养池进液通道(121)和培养池出液通道(123)连接，所述单线虫培养池(122)还与线虫加样通道(125)的一端连接，所述线虫加样通道(125)的另一端与线虫加样口(124)连接；所述进液单元(11)与培养池进液通道(121)连接，所述出液单元(13)与培养池出液通道(123)连接；所述培养池进液通道(121)、培养池出液通道(123)、线虫加样通道(125)均为与单线虫培养池(122)连接的一侧起内径逐渐增大，所述培养池进液通道(121)和所述培养池出液通道(123)的内径最小处小于单线虫样品的直径，线虫加样通道(125)的内径最小处与单线虫样品的直径相当。2.根据权利要求1所述的单线虫直接加样微流控芯片，其特征在于：所述进液单元由液体入口(111)和进液分液通道结构(112)组成，所述进液分液通道结构(112)的一端与液体入口(111)连接，所述进液分液通道结构(112)的另一端与培养池进液通道(121)连接；所述进液分液通道结构(112)为由液体入口(111)并行分流至各组单线虫分析结构的培养池进液通道(121)；所述出液单元(13)包括液体出口(131)和出液分液通道结构(132)，所述出液分液通道结构(132)的一端与液体出口(131)连接，所述出液分液通道结构(132)的另一端与培养池出液通道(123)连接；所述出液分液通道结构(132)为由各组单线虫分析结构的培养池出液通道(123)并行汇流至液体出口(131)。3.根据权利要求1所述的单线虫直接加样微流控芯片，其特征在于：所述单线虫并行分析单元(12)为至少一组，当所述单线虫并行分析单元(12)为两组以上时，每组单线虫并行分析单元与同一液体入口连接，每组单线虫并行分析单元分别与不同的液体出口连接。4.根据权利要求1所述的单线虫直接加样微流控芯片，其特征在于：所述微通道结构层(1)设有通道的一侧与芯片底板(2)封接。5.根据权利要求1所述的单线虫直接加样微流控芯片，其特征在于：所述微通道结构层(1)为透气的弹性硅橡胶材料，包括聚二甲基硅氧烷pdms；所述芯片底板(2)为透光材料，包括玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯pmma、聚碳酸酯pc。6.根据权利要求1所述的单线虫直接加样微流控芯片，其特征在于：所述培养池进液通道(121)和培养池出液通道(123)与单线虫培养池(122)相连的部分的宽度均小于单线虫样品的直径，深度与单线虫样品的直径相当。7.根据权利要求1所述的单线虫直接加样微流控芯片，其特征在于：所述单线虫培养池(122)为椭圆形或圆形，单线虫培养池(122)的直径大于单线虫样品的最大长度，深度大于单线虫样品的直径。8.根据权利要求1所述的单线虫直接加样微流控芯片，其特征在于：所述线虫加样通道(125)为锥形结构且其与单线虫培养池(122)相连部分的深度和最小宽度均与单线虫样品的直径相当。9.根据权利要求1所述的单线虫直接加样微流控芯片，其特征在于：所述单线虫并行分析单元(12)中单线虫分析结构的数量至少为4个或4个的偶数倍。
10.权利要求1-9中任一项所述的单线虫直接加样微流控芯片的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
①
微流控芯片准备：通过液体入口向微流控芯片结构中注入线虫培养液；
②
单线虫取样：将线虫悬液混匀，按其密度多次吸取含有单线虫的液滴，然后在显微镜下观察，筛选出含有合适体宽的单线虫液滴并进行标记；
③
单线虫加样与补样：依次将含有合适体宽单线虫的液滴从相应的线虫加样口处注入各单线虫培养池；第一轮加样结束后，通过显微镜观察是否存在加样失败的情况，若有，则进行补样操作，至全部单线虫培养池的加样率达到100％；
④
线虫加样口封闭：将所有的线虫加样口封闭，即完成单线虫加样过程；
⑤
单线虫培养与观测：通过进液单元和出液单元进行各单线虫培养池中培养液的更换以及虫卵和子代线虫的清除，实现单线虫长期培养以及定期观测。
技术总结本发明公开了一种单线虫直接加样微流控芯片及其使用方法，属于模式生物线虫分析及微流控技术领域。所述的微流控芯片结构层由进液单元、单线虫并行分析单元和出液单元按顺序连接而成；所述的单线虫并行分析单元由若干并行排列的单线虫分析结构组成，每个单线虫分析结构由培养池进液通道、单线虫培养池、培养池出液通道、线虫加样口和线虫加样通道构成。本发明所述微流控芯片尤其适用于简便、快速、高效的单线虫加样以及单线虫并行控制和检测，有利于更方便的获得单线虫分析检测结果，为基于单线虫的模式生物研究和应用提供有效的技术方案。案。
技术研发人员：钟润涛 刘琦 杨倩倩 常文博 陈克欣 王梦雨 孙野青
受保护的技术使用者：大连海事大学
技术研发日：2022.06.23
技术公布日：2022/11/1
