1.本发明涉及药物技术领域，尤其涉及三七提取物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。
背景技术：2.糖尿病是世界上最常见的慢性疾病之一，给整个社会带来了沉重的负担。据统计，2021年20-79岁人群的糖尿病患病率约为10.5％(5.366亿)，到2045年将增加到12.2％(7.832亿)。糖尿病肾病(diabetic nephropathy，dn)是糖尿病(diabetes mellitus，dm)常见的微血管并发症之一，同时也是慢性肾脏病(chronic kidney disease，ckd)的主要发病原因，其进展到最后往往变为终末期肾脏病(end-stage renal disease，esrd)，患者只能进行透析治疗，不仅造成患者身体和心灵的痛苦，更加造成严重的经济社会负担，是目前重大公共卫生问题之一。随着dn发病率和患病率的上升，糖尿病相关慢性肾脏疾病的比例已经超过肾小球肾炎相关慢性肾脏疾病的比例，根据kdigo 2020临床实践指南，血糖和血压管理仍是主要的治疗策略，然而，现有的dn治疗方法并不能完全阻止疾病进展，因此，探索有效延缓dn进展的方法，迫在眉睫。
3.三七(panax notoginseng)是中医里的一块瑰宝，属五加科草本植物，《玉揪药解》中记载，三七具有通脉行瘀、活血化瘀和消肿定痛的功效，可有效缓解血瘀的症状；研究发现，三七的有效成分多为皂苷类物质，其中三七总皂苷(panax notognseng saponins，pns)是皂苷类物质中的主要成分；但目前三七防治dn的研究甚少，且其作用机制尚未完全明确。
4.因此，亟需探究三七提取物对糖尿病肾病的作用及其在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。
技术实现要素：5.本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供三七提取物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
7.提供三七提取物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。
8.优选地，所述三七提取物为三七皂苷。
9.更优选地，所述三七皂苷为三七皂苷fc或/和三七皂苷ft1。
10.更优选地，所述三七皂苷fc的分子式为c
58h98o26
。
11.优选地，所述三七皂苷fc可减轻肾小管细胞凋亡水平。
12.优选地，所述三七皂苷fc可减轻hk-2细胞的氧化应激水平。
13.优选地，所述三七皂苷fc可改善hk-2细胞线粒体功能。
14.优选地，所述三七皂苷fc通过改善肾脏功能和结构异常，延缓糖尿病肾病的进展。
15.更优选地，所述三七皂苷ft1的分子式为c
47h80o17
，分子量为917.13。
16.优选地，所述三七皂苷ft1可减轻dn小鼠肾脏组织中ago-1的表达水平。
17.优选地，所述三七皂苷ft1改善db/db小鼠胰岛素抵抗。
18.优选地，所述三七皂苷ft1改善高脂饮食+链脲佐菌素(hfd/stz)小鼠胰岛素抵抗。
19.优选地，所述三七皂苷ft1改善db/db小鼠肾脏功能和结构异常，延缓糖尿病肾病的进展。
20.优选地，所述三七皂苷ft1改善hfd/stz小鼠肾脏功能和结构异常，延缓糖尿病肾病的进展。
21.优选地，所述治疗糖尿病肾病药物还包括：药学上可接受的一种或多种助剂。
22.优选地，所述治疗糖尿病肾病药物的剂型包括：汤剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、酒剂、冲剂、口服液剂、胶囊剂、片剂或注射剂。
23.优选地，所述治疗糖尿病肾病药物的给药途径包括：口服给药、舌下给药、经肌肉或皮下给药或静脉给药。
24.本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
25.本发明通过对db/db小鼠及高脂饮食+链脲佐菌素(stz)诱导的糖尿病肾病模型进行体内实验，探讨三七皂苷fc以及三七皂苷ft1对糖尿病肾病的治疗作用；三七皂苷fc可以改善蛋白尿和肾组织病理学，减少肾小管细胞凋亡，并调节pten/pdk1/akt/mtor通路蛋白的表达减轻dn肾小球和线粒体损伤，体外研究进一步证明，三七皂苷fc能减少线粒体超氧化物的产生，减轻线粒体膜电位(mmp)损失；三七皂苷ft1可改善胰岛素抵抗，减轻胰岛素受体信号通路蛋白p-irs1/2、p-akt、p-erk1/2表达，且能下调两种糖尿病肾病模型小鼠肾组织中ago-1的蛋白表达，通过调节ago-1/tsp-1通路抑制胰岛素抵抗，改善代谢，减轻dn肾脏损伤；三七皂苷fc以及三七皂苷ft1可应用于制备治疗糖尿病肾病的药物。
附图说明
26.图1为本发明实施例1中三七皂苷fc对糖尿病小鼠血、尿生化等指标的影响结果图；其中，图1a为治疗8周后尿白蛋白/肌酐比(acr)水平的统计分析图；图1b为治疗8周后血尿素氮(bun)水平的统计分析图；图1c为治疗8周后肾脏重量与体重之比(kw/bw)水平的统计分析图；
27.图2为本发明实施例1中三七皂苷fc对糖尿病小鼠肾脏形态学的影响；其中，图2a为各组小鼠肾组织的he染色图片；图2b为各组小鼠肾组织的足细胞肾病蛋白(nephrin)免疫组化染色图片；图2c为nephrin表达变化的半定量分析；
28.图3为本发明实施例1中三七皂苷fc对糖尿病小鼠足细胞凋亡的影响；其中，图3a为正常(normal)组；图3b为模型(model)组；图3c为氯沙坦(losartan)治疗组；图3d为三七皂苷fc(notoginsenoside fc)治疗组；
29.图4为本发明实施例1中hk-2细胞线粒体ros水平的荧光图像；
30.图5为本发明实施例1中hk-2细胞线粒体膜电位水平的荧光图像；
31.图6为本发明实施例1中三七皂苷fc对糖尿病小鼠pten/pdk1/akt/mtor信号通路的调节作用；其中，图6a为pten、pdk1、p-akt和p-mtor的免疫组化染色图片；图6b是对pten的免疫组化进行半定量分析的结果图；图6c是对pdk1的免疫组化进行半定量分析的结果图；图6d是对p-akt的免疫组化进行半定量分析的结果图；图6e是对p-mtor的免疫组化进行半定量分析的结果图；
32.图7为本发明实施例2中糖尿病小鼠肾脏组织中ago-1高表达结果图；其中，图7a为ago-1蛋白的表达；图7b为db/m以及db/db小鼠ago-1蛋白表达的半定量分析；图7c为hfd/stz小鼠ago-1蛋白表达的半定量分析；图7d为ago-1蛋白的免疫组化染色图片；
33.图8为本发明实施例2中三七皂苷ft1显著降低糖尿病小鼠肾脏组织ago-1表达；其中，图8a为ago-1蛋白的表达；图8b为ago-1蛋白的免疫组化染色图片；
34.图9为本发明实施例2中三七皂苷ft1改善db/db小鼠胰岛素抵抗；其中，图9a为ipgtt水平；图9b为ipitt水平；图9c为各组小鼠ipgtt-auc比较图；图9d为各组小鼠ipitt-auc比较图；图9e为db/db各组小鼠血糖比较图；图9f为pas染色图片；图9g为tsp-1蛋白表达的western印迹图像；图9h为p-irs-1、p-erk 1/2和p-akt蛋白表达的western印迹图像；
35.图10为本发明实施例2中三七皂苷ft1改善hfd/stz小鼠胰岛素抵抗；其中，图10a为ipgtt水平；图10b为ipitt水平；图10c为各组小鼠ipgtt-auc比较图；图10d为各组小鼠ipitt-auc比较图；图10e为stz+hfd各组小鼠血糖比较图；图10f为p-irs-1、p-erk 1/2和p-akt蛋白表达的western印迹图像；
36.图11为本发明实施例2中三七皂苷ft1改善db/db小鼠肾损伤；其中，图11a为治疗8周后的acr水平；图11b为治疗8周后的血尿素氮水平；图11c为治疗8周后的24小时尿量水平；图11d为治疗8周后的肾脏重量与体重之比(kw/bw)水平；图11e为he、masson染色图像；图11f为电镜图像；图11g为纤维化相关蛋白α-sma、vimentin的western印迹图像；
37.图12a为本发明实施例2中治疗8周后的acr水平；图12b为治疗8周后的血尿素氮水平；图12c为治疗8周后的24小时尿量水平；图12d为治疗8周后的肾脏重量与体重之比(kw/bw)水平。
具体实施方式
38.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
40.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
41.实施例1
42.本实施例提供三七皂苷fc在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。
43.1、实验材料与方法
44.1.1药物制备
45.三七皂苷fc(hplc纯度98％以上)购自安徽经科有限公司(中国上海)；氯沙坦购自于默克公司；动物实验中三七皂苷fc和氯沙坦均悬浮于0.5％甲基纤维素溶液中灌胃给药；细胞实验中三七皂苷fc溶于dmso制成母液，用培养基稀释来处理人肾近端小管上皮细胞(hk-2)。
46.1.2动物实验
47.本实施例所用的db/db小鼠由上海交通大学附属第六人民医院动物房代为购买；
实验及其操作均遵照《国家实验动物管理条例》与《医学实验动物管理实施细则》，并经由上海交通大学附属第六人民医院动物伦理委员会批准；雄性db/db糖尿病小鼠(c57blks/j-leprdb/leprdb)及同窝雄性db/m野生型小鼠(c57blks/j-leprdb/+)，6周龄；db/db小鼠15只，db/m小鼠5只，饲养于spf级环境，温度18℃-29℃，相对湿度40％-70％，并给予标准清洁饮食和水；
48.db/m小鼠视为对照组(con)，db/db小鼠随机分为5组：
49.(1)模型组：给予等体积的0.5％羧甲基纤维素钠溶液灌胃；
50.(2)氯沙坦组(losartan)：氯沙坦悬浮于0.5％羧甲基纤维素钠溶液后按照10mg/kg/d的剂量灌胃；
51.(3)三七皂苷fc低剂量组：三七皂苷fc悬浮于0.5％羧甲基纤维素钠溶液后按照2.5mg/kg/d的剂量灌胃；
52.(4)三七皂苷fc中剂量组：三七皂苷fc悬浮于0.5％羧甲基纤维素钠溶液后按照5mg/kg/d的剂量灌胃；
53.(3)三七皂苷fc高剂量组：三七皂苷fc悬浮于0.5％羧甲基纤维素钠溶液后按照10mg/kg/d的剂量灌胃；
54.每周监测体重，按上述方案给药，共持续8周。
55.1.3尿液和血液生化指标检测
56.从代谢笼中收集尿液，将尿液置于4℃下以3500rpm离心15分钟，用全自动生化分析仪测量尿液上清液中的尿白蛋白和尿肌酐；使用尿白蛋白/肌酐比(acr)计算尿白蛋白排泄量；
57.从腹主动脉收集血液，将血液静置30分钟以上，4℃以3500rpm离心15分钟，用全自动生化分析仪测定血液上清液的血糖(glu)和血尿素氮(bun)。
58.1.4肾组织病理检测
59.用苏木精和伊红(he)对石蜡包埋的肾组织的4μm切片进行染色，在65℃干燥30分钟后，用二甲苯脱蜡2次，每次10分钟；依次用100％乙醇(i)、100％乙醇(ii)、95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇和去离子水复水，每次10分钟，最后，切片用he液染色。
60.1.5免疫组化检测
61.在4μm石蜡包埋的肾组织上进行免疫组织化学检测；切片脱蜡和再水化后，在柠檬酸盐缓冲液中煮沸提取抗原，切片用0.3％h2o2封闭15分钟，用5％bsa封闭1小时；nephrin、pten、pdk1、p-akt和p-mtor一抗在4℃下孵育过夜，后将切片与二抗在37℃下孵育1小时，最后，切片用二氨基联苯胺和苏木精复染后使用光学显微镜收集显微照片，所有的显微照片通过imagej软件进行分析。
62.1.6免疫荧光与tunel法检测凋亡
63.将小鼠肾脏组织白片放入60℃烘箱2小时，使石蜡融化；依次进行脱蜡、4％多聚甲醛固定、抗原修复、0.3％曲拉通(triton x-100)破膜打孔、tunel标记染色、5％bsa封闭、孵第一抗体、避光孵荧光第二抗体以及避光dapi染料染色后，用吸水滤纸将多余液体吸干，滴加抗荧光淬灭封片剂，缓慢用盖玻片覆盖组织进行封片，后用透明指甲油固定盖玻片，置于通风橱干燥30分钟；最后用荧光显微镜进行观察，拍片，在室温下避光进行。
64.1.7细胞培养
65.将人肾近曲小管上皮细胞(hk-2)置于含10％胎牛血清以及1％双抗的dmem培养基中，于5％co2、37℃条件下常规培养；
66.选取对数生长期的hk-2细胞，随机分为6组：
67.(1)正常葡萄糖对照组(con)：细胞培养在含5.5mmol/l葡萄糖的培养基中；
68.(2)高渗透压组(hm)：细胞培养在含5.5mmol/l葡萄糖+24.5mmol/l甘露醇的培养基中；
69.(3)高糖组(hg)：细胞培养在含30mmol/l葡萄糖的培养基中；
70.(4)三七皂苷fc-l组：细胞培养在含30mmol/l葡萄糖+10μmol/l三七皂苷fc的培养基中；
71.(5)三七皂苷fc-m组：细胞培养在含30mmol/l葡萄糖+15μmol/l三七皂苷fc的培养基中；
72.(6)三七皂苷fc-h组：细胞培养在含30mmol/l葡萄糖+20μmol/l三七皂苷fc的培养基中；
73.三七皂苷fc溶于dmso中制成母液，然后用培养基稀释，各组均处理48小时。
74.1.8活细胞成像
75.mitosox red是一种特异性靶向活细胞线粒体的荧光探针，具细胞膜渗透性，能快速和选择性结合线粒体，一旦进入线粒体，被超氧化物氧化，产生红色荧光；使用mitosox red线粒体超氧化物指示剂测量线粒体超氧化物的产生，通过jc-1检测试剂盒检测线粒体膜电位(mmp)水平。
76.1.9统计分析
77.使用graphpad prism 8对数据进行分析，所有数据均以平均值
±
标准差(sd)表示，多组间差异采用单因素方差分析(anova)，p《0.05为差异有统计学意义。
78.2、实验结果
79.2.1三七皂苷fc对糖尿病小鼠血、尿生化等指标的影响
80.与对照组大鼠相比，糖尿病小鼠acr水平明显升高，但治疗8周后，三七皂苷fc和氯沙坦均可显著降低糖尿病大鼠acr水平(图1a)；与糖尿病模型组相比，三七皂苷fc和氯沙坦组均可显著降低血尿素氮水平(图1b)；db/db小鼠的肾重/体重比值明显高于正常db/m小鼠，治疗8周后，三七皂苷fc和氯沙坦均降低了糖尿病大鼠的肾重/体重比(图1c)。
81.2.2三七皂苷fc对糖尿病小鼠肾脏形态学的影响
82.组织学上，he染色显示糖尿病小鼠有明显的肾小球系膜基质沉积，肾小管扩张和肾小管空泡变性，三七皂苷fc和氯沙坦均可明显改善这些病理改变(图2a)；与对照组(normal)组相比，模型(model)组小鼠肾脏nephrin水平下降，表明其黏附水平降低；而与model组相比，氯沙坦(losartan)治疗组与三七皂苷fc(notoginsenoside fc)治疗组其肾脏nephrin水平相对升高，表明其黏附水平有所上升(图2b-c)；上述结果表明，三七皂苷fc改善了糖尿病大鼠肾脏形态的异常。
83.2.3三七皂苷fc对糖尿病小鼠足细胞凋亡的影响
84.为了探究三七皂苷fc对db/db糖尿病小鼠肾脏足细胞凋亡水平的影响，将小鼠肾脏冰冻切片进行wt 1及tunel的免疫荧光检测，并在荧光显微镜下观察各组小鼠肾脏足细胞凋亡水平；结果如图3a-d所示，与正常(normal)组相比，模型(model)组小鼠肾脏足细胞
凋亡水平升高；与model组相比，氯沙坦(losartan)治疗组与三七皂苷fc(notoginsenoside fc)治疗组的小鼠肾脏足细胞凋亡水平有所降低。
85.2.4三七皂苷fc对高糖作用下hk-2细胞线粒体氧化应激水平的影响
86.高糖显著增加hk-2细胞线粒体超氧化物的产生，在三七皂苷fc处理后，线粒体超氧化物的产生减少。
87.2.5三七皂苷fc对高糖作用下hk-2细胞线粒体膜电位水平的影响
88.当细胞内线粒体膜电位高时，jc-1在线粒体基质中形成聚集体，可产生红色荧光，相反，当电位较低时，由于不能聚集，此时jc-1为单体，可以发出绿色荧光；如图5所示，高糖可导致hk-2细胞中线粒体膜电位丢失，而三七皂苷fc可逆转线粒体膜去极化，上述结果提示三七皂苷fc可恢复高糖作用下hk-2细胞的线粒体功能。
89.2.6三七皂苷fc对糖尿病小鼠pten/pdk1/akt/mtor信号通路的调节作用
90.如图6a-e所示，与正常(normal)组相比，模型(model)组小鼠肾脏pten水平下降；而与model组相比，氯沙坦(losartan)治疗组与三七皂苷fc(notoginsenoside fc)治疗组其肾脏pten水平相对升高；与正常(normal)组相比，模型(model)组小鼠肾脏pdk1、p-akt和p-mtor水平升高；而与model组相比，氯沙坦(losartan)治疗组与三七皂苷fc(notoginsenoside fc)治疗组其肾脏pdk1、p-akt和p-mtor水平有所降低。
91.实施例2
92.本实施例提供三七皂苷ft1在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。
93.1、实验材料与方法
94.1.1药物制备
95.三七皂苷ft1(hplc纯度98％以上)购自安徽经科生物有限公司；氯沙坦购自于默克公司；链脲佐菌素(stz)购自sigma-aldrich公司；动物实验中三七皂苷ft1和氯沙坦均悬浮于0.5％甲基纤维素溶液中灌胃给药。
96.1.2动物实验
97.本实施例所用的db/m小鼠和db/db小鼠均购自南京大学模式动物研究所，并饲养于复旦大学药学院动物实验中心spf级动物房(温度：26℃，湿度：55％
–
60％)，动物实验操作均符合动物实验伦理委员会章程规定；
98.随机将小鼠分为6组(n＝8/每组)，db/m小鼠作为对照组，db/db小鼠被随机分为5组(n＝8/每组)：
99.(1)模型组：给予等体积的0.5％羧甲基纤维素钠溶液灌胃；
100.(2)氯沙坦阳性对照组：氯沙坦悬浮于0.5％羧甲基纤维素钠溶液后按照20mg/kg/d的剂量灌胃；
101.(3)三七皂苷ft1低剂量组：三七皂苷ft1悬浮于0.5％羧甲基纤维素钠溶液后按照2.5mg/kg/d的剂量灌胃；
102.(4)三七皂苷ft1中剂量组：三七皂苷ft1悬浮于0.5％羧甲基纤维素钠溶液后按照5mg/kg/d的剂量灌胃；
103.(5)三七皂苷ft1高剂量组：三七皂苷ft1悬浮于0.5％羧甲基纤维素钠溶液后按照10mg/kg/d的剂量灌胃；
104.每周监测体重，按上述方案给药，共持续8周；
105.本实施例所用的c57小鼠购自南京大学模式动物研究所，并饲养于复旦大学药学院动物实验中心spf级动物房(温度：26℃，湿度：55％-60％)，动物实验操作均符合动物实验伦理委员会章程规定；4周龄小鼠适应性喂养1周后给予高脂饮食，8周后，禁食12h，腹腔注射stz(40mg/kg/d)，stz以无菌0.1mol/l枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液配制，注射部位用酒精消毒，持续5天；
106.在自由饮水进食条件下，造模前测定正常血糖1次；给予stz后，每日观察动物状态，每日称1次体重，取空腹血糖在大于16.7mmol/l且小于对照组血糖2倍的小鼠进入正式实验；
107.随机将小鼠分为6组(n＝8/每组)，正常小鼠作为对照组，糖尿病小鼠被随机分为5组(n＝8/每组)：
108.(1)模型组：给予等体积的0.5％羧甲基纤维素钠溶液灌胃；
109.(2)氯沙坦阳性对照组：氯沙坦悬浮于0.5％羧甲基纤维素钠溶液后按照20mg/kg/d的剂量灌胃；
110.(3)三七皂苷ft1低剂量组：三七皂苷ft1悬浮于0.5％羧甲基纤维素钠溶液后按照10mg/kg/d的剂量灌胃；
111.(4)三七皂苷ft1中剂量组：三七皂苷ft1悬浮于0.5％羧甲基纤维素钠溶液后按照20mg/kg/d的剂量灌胃；
112.(5)三七皂苷ft1高剂量组：三七皂苷ft1悬浮于0.5％羧甲基纤维素钠溶液后按照30mg/kg/d的剂量灌胃；
113.每周监测体重，按上述方案给药，共持续8周。
114.1.3尿液和血液生化指标检测
115.从小鼠代谢笼中收集尿液，将尿液置于4℃下以3500rpm离心15分钟，用尿微量白蛋白酶联免疫检测试剂盒和肌酐试剂盒检测尿液上清液中的尿微量白蛋白和尿肌酐；使用尿白蛋白/肌酐比(acr)计算尿白蛋白排泄量；
116.通过眼眶取血，将血液静置30分钟以上，4℃以4500rpm离心30分钟，通过肌酐试剂盒和尿素氮试剂盒检测血肌酐和血尿素氮。
117.1.4肾组织病理检测
118.石蜡包埋的肾组织的4μm切片用苏木精和伊红(he)、马松(masson)和高碘酸-希夫(pas)染色，在65℃干燥30分钟后，将切片置于二甲苯中脱蜡2次，每次10分钟，依次用100％乙醇(i)、100％乙醇(ii)、95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇和去离子水复水，每次10分钟，随后，切片用he、masson和pas液染色，随机收集20张图片，由两位盲法研究者进行定量，计算系膜基质占据每个肾小球的百分比。
119.1.5电镜检测
120.采用透射电镜观察肾小球及足细胞足突(fp)；
121.用2％戊二醛固定肾皮质，用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色。
122.1.6免疫组化检测
123.在4μm石蜡包埋的肾组织上进行免疫组织化学检测；
124.切片进行脱蜡和再水化后，在柠檬酸盐缓冲液中煮沸提取抗原；切片用0.3％h2o2封闭15分钟，用5％bsa封闭1小时；ago-1一抗在4℃下孵育过夜，随后将切片与二抗在37℃
下孵育1小时，最后，切片用二氨基联苯胺和苏木精复染，使用光学显微镜收集显微照片，所有的显微照片通过imagej软件进行分析。
125.1.7蛋白质印迹免疫分析(western blot)：
126.western blot检测肾组织及细胞ago-1、tsp-1、p-irs1/2、irs1/2、p-akt、akt、p-erk1/2、erk1/2、p-nfκb p65蛋白水平。
127.1.8炎症因子检测
128.通过elisa检测试剂盒检测血清和肾脏组织il-1β、il-6、il-18及tnf-α表达。
129.1.9统计分析：
130.本实施例中的所有数据计量资料均表示为均数
±
标准误(mean
±
sem)表示；采用t检验(两样本比较，服从正态分布且满足方差齐性检验)或单因素方差分析(多组样本比较，服从正态分布且满足方差齐性检验)评估各组间的差异，以上统计处理运用graphpad prism6(graphpad software，美国)统计软件进行处理，p《0.05为统计学差异显著。
131.2、结果
132.2.1糖尿病小鼠肾脏组织中ago-1高表达
133.通过western blot检测发现，与db/m小鼠及正常对照c57小鼠相比，糖尿病小鼠肾脏组织中ago-1表达显著增加(图7a-c)；免疫组化结果也显示出db/db小鼠肾组织ago-1高表达(图7d)。
134.2.2三七皂苷ft1显著降低糖尿病小鼠肾脏组织ago-1表达
135.通过western blot检测发现，与糖尿病小鼠相比，经过三七皂苷ft1治疗8周后的糖尿病小鼠肾脏组织中ago-1表达显著降低(图8a)；免疫组化结果也显示出三七皂苷ft1可以显著降低肾组织ago-1高表达(图8b)。
136.2.3三七皂苷ft1改善db/db小鼠胰岛素抵抗
137.如图9a-e所示，各组小鼠腹腔注射葡萄糖30min后，血糖水平迅速升高达到峰值，然后逐渐降低；模型组小鼠ipgtt水平在第30-120分钟血糖均显著高于正常组(p《0.05)，且ipgtt-auc也较正常组显著增加(p《0.05)，经过三七皂苷ft1干预后，第30-120分钟ipgtt水平、ipgtt-auc低于模型组(p《0.05)；腹腔注射胰岛素后观察，与正常组比较，db/db小鼠ipitt水平在第30-120分钟血糖值均显著升高(p《0.05)，且ipitt-auc也表现出升高趋势(p《0.05)；与模型组比较，三七皂苷ft1治疗组可降低第30-120分钟血糖水平(p《0.05)以及ipitt-auc(p《0.01)，可见三七皂苷ft1能够调节db/db鼠的ipgtt和ipitt水平，增强外周胰岛素敏感性；三七皂苷ft1治疗8周后可显著降低血糖水平，虽低剂量三七皂苷ft1治疗效果无显著性差异，但也有一定程度的降低；对糖尿病小鼠肾脏进行pas染色发现，三七皂苷ft1可以显著降低肾脏糖原沉积(图9f)；凝血酶敏感蛋白-1(tsp-1)是一个有力的抗血管生成因子，它能通过阻止内皮细胞对各种血管生成因素的刺激反应而抑制血管生长，ago-1可以通过激活tsp-1表达来降低胰岛素敏感性，结果表明三七皂苷ft1可以显著降低db/db小鼠肾脏组织中tsp-1表达水平(图9g)；蛋白印迹进一步证明，相比于模型组小鼠，经过三七皂苷ft1的治疗后的糖尿病肾病小鼠肾脏组织中胰岛素信号通路相关蛋白p-irs-1、p-erk 1/2和p-akt表达显著增加，表明融合蛋白对胰岛素相关信号传导的激活(图9h)。
138.2.4三七皂苷ft1改善hfd/stz小鼠胰岛素抵抗
139.如图10a-e所示，各组小鼠腹腔注射葡萄糖30min后，血糖水平迅速升高达到峰值，
然后逐渐降低，模型组小鼠ipgtt水平在第30-120分钟血糖均显著高于正常组(p《0.05)，且ipgtt-auc也较正常组显著增加(p《0.05)，经过三七皂苷ft1干预后，第30-120分钟ipgtt水平、ipgtt-auc低于模型组(p《0.05)；腹腔注射胰岛素后观察发现与正常组比较，模型组小鼠ipitt水平在第30-120分钟血糖值均显著升高(p《0.05)，且ipitt-auc也表现出升高趋势(p《0.05)；与模型组比较，三七皂苷ft1治疗组可降低第30-120分钟血糖水平(p《0.05)以及ipitt-auc(p《0.01)，可见三七皂苷ft1能够调节hfd/stz鼠的ipgtt和ipitt水平，增强外周胰岛素敏感性；三七皂苷ft1治疗8周后可显著降低血糖水平，虽低剂量三七皂苷ft1治疗效果无显著性差异，但也有一定程度的降低；蛋白印迹进一步证明，相比于模型组小鼠，经过三七皂苷ft1的治疗后的糖尿病肾病小鼠肾脏组织中胰岛素信号通路相关蛋白p-irs-1、p-erk 1/2和p-akt表达显著增加，表明融合蛋白对胰岛素相关信号传导的激活(图10f)。
140.2.5三七皂苷ft1可以改善db/db小鼠肾损伤
141.在给予db/db小鼠三七皂苷ft1治疗后可以显著降低acr水平，其血尿素氮和24小时尿量显著低于未治疗的db/db小鼠(图11a-b)；小鼠肾脏指数指的是小鼠双侧肾脏质量与小鼠体重之比，反应的是肾脏相对重量变化，数据显示糖尿病肾病小鼠的肾指数相比于对照组显著升高，给予三七皂苷ft1治疗8周后可显著降低糖尿病小鼠肾指数(图11c-d)，he结果表明糖尿病肾病小鼠肾小球系膜细胞增生、基质明显增多，在经过三七皂苷ft1治疗8周后，db/db小鼠肾脏病理损伤明显减轻(图11e)；电镜检测发现，相比于未治疗的糖尿病肾病小鼠，在经过三七皂苷ft1治疗后糖尿病肾病小鼠肾小球基底膜增厚程度减轻、足细胞足突融合程度显著改善(图11f)，对小鼠肾脏组织进行masson染色发现，db/db小鼠肾脏组织中胶原沉积增加，在给予三七皂苷ft1治疗后可以显著改善糖尿病小鼠肾脏胶原沉积水平(图11e)；蛋白印迹结果及其定量统计分析进一步表明三七皂苷ft1可以降低糖尿病肾病小鼠肾脏组织中纤维化相关蛋白α-sma、vimentin表达水平(图11g)。
142.2.6三七皂苷ft1可以改善hfd/stz小鼠肾损伤
143.在给予hfd/stz小鼠三七皂苷ft1治疗后，可以显著降低acr水平(图12a)，其血尿素氮和24小时尿量显著低于未治疗hfd/stz小鼠(图12b-c)；数据显示糖尿病肾病小鼠的肾指数相比于对照组显著升高；而给与三七皂苷ft1治疗8周后可显著降低糖尿病小鼠肾指数(图12d)。
144.综上所述，本发明通过对db/db小鼠及高脂饮食+链脲佐菌素(stz)诱导的糖尿病肾病模型进行体内实验，探讨三七皂苷fc以及三七皂苷ft1对糖尿病肾病的治疗作用；三七皂苷fc可以改善蛋白尿和肾组织病理学，减少肾小管细胞凋亡，并调节pten/pdk1/akt/mtor通路蛋白的表达减轻dn肾小球和线粒体损伤，体外研究进一步证明，三七皂苷fc能减少线粒体超氧化物的产生，减轻线粒体膜电位(mmp)损失；三七皂苷ft1可改善胰岛素抵抗，减轻胰岛素受体信号通路蛋白p-irs1/2、p-akt、p-erk1/2表达，且能下调两种糖尿病肾病模型小鼠肾组织中ago-1的蛋白表达，通过调节ago-1/tsp-1通路抑制胰岛素抵抗，改善代谢，减轻dn肾脏损伤；三七皂苷fc以及三七皂苷ft1可应用于制备治疗糖尿病肾病的药物。
145.以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。
技术特征：1.三七提取物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述三七提取物为三七皂苷。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述三七皂苷为三七皂苷fc或/和三七皂苷ft1。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述三七皂苷fc的分子式为c
58
h
98
o
26
。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述三七皂苷ft1的分子式为c
47
h
80
o
17
，分子量为917.13。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗糖尿病肾病药物还包括：药学上可接受的一种或多种助剂。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗糖尿病肾病药物的剂型包括：汤剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、酒剂、冲剂、口服液剂、胶囊剂、片剂或注射剂。8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗糖尿病肾病药物的给药途径包括：口服给药、舌下给药、经肌肉或皮下给药或静脉给药。
技术总结本发明涉及三七提取物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用；本发明中三七皂苷Fc可以改善蛋白尿和肾组织病理学，减少肾小管细胞凋亡，并调节PTEN/PDK1/Akt/mTOR通路蛋白的表达减轻DN肾小球和线粒体损伤，三七皂苷Fc能减少线粒体超氧化物的产生，减轻线粒体膜电位损失；三七皂苷Ft1可改善胰岛素抵抗，减轻胰岛素受体信号通路蛋白p-IRS1/2、p-AKT、p-ERK1/2表达，且能下调两种糖尿病肾病模型小鼠肾组织中AGO-1的蛋白表达，通过调节AGO-1/TSP-1通路抑制胰岛素抵抗，改善代谢，减轻DN肾脏损伤；三七皂苷Fc以及三七皂苷Ft1可应用于制备治疗糖尿病肾病的药物。病肾病的药物。病肾病的药物。
技术研发人员：桂定坤 沈义兰 薛瑞 徐友华 辛文锋 林康鸿 杨细飞 汪年松
受保护的技术使用者：上海市第六人民医院
技术研发日：2022.06.24
技术公布日：2022/11/1
