1.本发明涉及生物纳米材料医学领域，具体涉及一种上转换-金属酚醛网络复合纳米材料在肿瘤治疗中协同ptt/pdt/化疗。
背景技术：2.由于肿瘤微环境的复杂性，单一疗法的治疗效果往往不能令人满意。因此，癌症治疗已经从单一疗法转向联合疗法，以实现协同治疗的最佳治疗效果。化疗依靠化疗药物（例如阿霉素（dox）、紫杉醇等）来杀死癌细胞。但是这些药物不仅能被癌细胞吸收，也会被正常细胞吸收，对正常细胞产生一定的不利影响，另外药物输送到肿瘤部位的过程中会面临药物早泄从而导致癌症处药物浓度不足等问题，因此开发出可控的药物释放体系在癌症治疗领域具有指导性意义。
3.光动力治疗（pdt）是一种非侵入、低毒且副作用小的治疗手段，在癌症治疗中具有良好的前景。光动力治疗离不开光敏剂、激发光源以及氧气这三个条件。目前使用较多的光敏剂分子主要是吸收紫外或可见光区的光，但是由于短波长的光的穿透深度有限，对于深层组织处的肿瘤治疗有一定的局限性。
4.因此，开发一种既可以实现可控药物释放又可以解决pdt中激发光源的组织穿透深度问题的新型材料，是该领域研究人员需要解决的问题。
技术实现要素：5.本发明是针对上述现有技术所存在的上述不足之处，而提供上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法，该方法简单易操作，制备的材料形貌均一；且经过改性处理后的合成的复合材料，能够满足临床诊疗一体化，在近红外光照射下，构建成像指导下的ptt/pdt/化疗联合治疗平台。
6.为实现发明目的，本发明采用如下技术方案：一种基于上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）制备nayf4:yb,er,nd纳米颗粒，作为内核：采用“热分解”法，在含6 ml油酸（oa）和15 ml十八烯（ode）的100 ml三口烧瓶中加入不同比例的y(ch3co2)3，yb(ch3co2)3，er(ch3co2)3和nd(ch3co2)3（1mmol，y：yb：er：nd=80.5%：18%：0.5%：1%）。将其放在加热套上，随后升温至160
˚
c，匀速搅拌（rpm≈700），保温五分钟，直至乙酸盐粉末全部溶解，形成稀土-油酸络合物，此时为浅黄色澄清透明溶液；接着关闭加热，待溶液冷却至60
˚
c以下。称取0.1 g氢氧化钠和0.15 g氟化铵溶于5 ml甲醇溶液中，超声溶解，随后将混合溶液逐滴缓慢加入三口烧瓶中，升温至110
˚
c，反应大约30分钟，从而使甲醇蒸发掉，随后利用真空系统，对三口烧瓶内的环境进行抽真空，时间大约30分钟，接着交换抽通气各3次，每次30秒，在氩气环境中将反应物升温至300
˚
c，保温1 h。反应完成后，将溶液冷却至室温，用无
水乙醇沉淀产物（nayf4:yb,er,nd上转换纳米颗粒），用环己烷和乙醇分别洗多次，最后得到颗粒均一的上转换纳米材料，然后储存在环己烷中；（2）制备nayf4:yb,er@nayf4核壳上转换纳米颗粒：称取金属-乙酸盐y(ch3co2)3和nd(ch3co2)3（1 mmol，y：nd=80%：20%）加入烧瓶中，并加入12 ml oa和30 ml ode，升温至160℃后，匀速搅拌，保持10 min，使其完全溶解；然后降温至80℃（环己烷沸点）以下，加入5 ml上述nayf4:yb,er,nd环己烷溶液，升温至150℃以除去环己烷溶剂，直至瓶口无液体流下且溶液无气泡产生，温度降到60℃以下；取0.0674 g naoh和0.0374 gnh4f加入到5 ml甲醇溶剂中，超声溶解后逐滴缓慢加入到反应溶液中，升温至110℃，除去甲醇，至无雾气无气泡；然后抽真空30 min，交换通氩气3次，升温300℃，反应1 h。纯化步骤如nayf4:yb,er,nd纳米粒子制备。最终纯化的nayf4:yb,er,nd@nayf4:nd（core-shell）纳米颗粒分散在15 ml环己烷中；（3）水溶性-介孔二氧化硅包覆nayf4:yb,er,nd@nayf4:nd纳米颗粒的制备：首先，称取0.1 g ctab于烧杯中，加入20 ml超纯水，升温至70℃强搅拌下使溶液澄清；关闭加热，室温下，加入5 ml nayf4:yb,er,nd@nayf4:nd（≈15 mg）环己烷溶液，过夜搅拌至溶液再次澄清；过夜后，水分蒸发导致溶剂减少，然后补水至20 ml，将上述溶液移至250 ml三口烧瓶内，再加入40 ml超纯水，6 ml无水乙醇和300μl（2 mol/l）naoh水溶液，置于油浴锅下70℃冷凝回流30 min（转速开最大），用200μl移液枪逐滴缓慢加入400μl teos，搅拌反应1 h后，冷却至室温，离心取得沉淀，无水乙醇洗涤3次，除去游离硅，获得介孔二氧化硅包覆的ucnps。为除去ctab模板剂，获得介孔结构。将沉淀溶解在40 ml酸性乙醇溶液（ph=1.4~1.5）中，60℃下回流搅拌反应1 h。离心得到沉淀，用无水乙醇洗涤2~3次，最终产物分散在20 ml无水乙醇中，此回流过程可重复2-3次，以充分去除ctab，降低生物毒性；（4）ucnps@msio
2-mc540/dox纳米复合材料的制备：配制0.2 mg/ml dox的水溶液和0.2 mg/ml mc540的水溶液，然后将ucnps@msio2水溶液通过离心得到固体沉淀，取4 mg ucnps@msio2浸泡在2 ml dox和mc540的混合溶液中，先放在超声机中超声30 min，然后室温、避光环境下在磁力搅拌加热套上快速搅拌24 h。物理吸附完成以后，通过离心去除上清液留下沉淀，然后超纯水溶解，再次离心留沉淀，洗涤三次，去除游离的dox和mc540；（5）ucnps@msio2@mpn-mc540/dox纳米复合材料的制备：在剧烈搅拌下，将40 μl ta和40 μl fecl3（24 mm）溶液加入到2 ml的ucnps@msio
2-mc540/dox水溶液中。最后通过离心分离并用去离子水洗涤三次最后得到收集ucnps@msio2@mpn-mc540/dox纳米复合材料。
7.所述步骤（1）包括如下具体步骤：（1）在含6 ml油酸（oa）和15 ml十八烯（ode）的100 ml三口烧瓶中加入不同比例的y(ch3co2)3，yb(ch3co2)3，er(ch3co2)3和nd(ch3co2)3（1mmol，y：yb：er：nd=80.5%：18%：0.5%：1%）。将其放在加热套上，随后升温至160
˚
c，匀速搅拌，保温五分钟，直至乙酸盐粉末全部溶解，形成稀土-油酸络合物，此时为浅黄色澄清透明溶液；（2）接着关闭加热，待溶液冷却至60
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c以下。称取0.1 g氢氧化钠和0.15 g氟化铵溶于5 ml甲醇溶液中，超声溶解，随后将混合溶液逐滴缓慢加入三口烧瓶中，升温至110
˚
c，反应大约30分钟，从而使甲醇蒸发掉，随后利用真空系统，对三口烧瓶内的环境进行抽真空，时间大约30分钟，接着交换抽通气各3次，每次30秒，在氩气环境中将反应物升温至300
˚
c，保温1 h。反应完成后，将溶液冷却至室温，用无水乙醇沉淀产物（nayf4:yb,er,nd上转换
纳米颗粒），用环己烷和乙醇分别洗多次，最后得到颗粒均一的上转换纳米材料，然后储存在环己烷中。
8.所述步骤（1）中加热套使用的转速为700 rpm。
9.所述步骤（2）中在氩气环境中300
˚
c下反应1小时。
10.所述步骤（3）包括如下具体步骤：（1）首先，称取0.1 g ctab于烧杯中，加入20 ml超纯水，升温至70℃强搅拌下使溶液澄清；关闭加热，室温下，加入5 ml nayf4:yb,er,nd@nayf4:nd（≈15 mg）环己烷溶液，过夜搅拌至溶液再次澄清；（2）过夜后，水分蒸发导致溶剂减少，然后补水至20 ml，将上述溶液移至250 ml三口烧瓶内，再加入40 ml超纯水，6 ml无水乙醇和300μl（2 mol/l）naoh水溶液，置于油浴锅下70℃冷凝回流30 min（转速开最大），用200μl移液枪逐滴缓慢加入400μl teos，搅拌反应1 h后，冷却至室温，离心取得沉淀，无水乙醇洗涤3次，除去游离硅，获得介孔二氧化硅包覆的ucnps；（3）为除去ctab模板剂，获得介孔结构。将沉淀溶解在40 ml酸性乙醇溶液（ph=1.4~1.5）中，60℃下回流搅拌反应1 h。离心得到沉淀，用无水乙醇洗涤2~3次，最终产物分散在20 ml无水乙醇中，此回流过程可重复2-3次，以充分去除ctab，降低生物毒性。
11.所述步骤(3)中加热搅拌的温度为70℃，转速为1250 rpm。
12.所述步骤(3)中加入nayf4:yb,er,nd@nayf4:nd环己烷溶液约为15 mg，过夜溶液澄清后在进行下一步实验。
13.所述步骤(3)中，除去ctab模板剂要在ph=1.4~1.5的酸性乙醇溶液进行回流，该过程可重复2-3次，以充分去除ctab，降低生物毒性。
14.所述步骤(4)包括如下具体步骤：（1）配制0.2 mg/ml dox的水溶液和0.2 mg/ml mc540的水溶液，然后将ucnps@msio2水溶液通过离心得到固体沉淀，取4 mg ucnps@msio2浸泡在2 ml dox和mc540的混合溶液中，先放在超声机中超声30 min，然后室温、避光环境下在磁力搅拌加热套上快速搅拌24 h；（2）物理吸附完成以后，通过离心去除上清液留下沉淀，然后超纯水溶解，再次离心留沉淀，洗涤三次，去除游离的dox和mc540。
15.所述步骤（5）中，在剧烈搅拌下，将40 μl ta和40 μl fecl3（24 mm）溶液加入到2 ml的ucnps@msio
2-mc540/dox水溶液中。最后通过离心分离并用去离子水洗涤三次最后得到收集ucnps@msio2@mpn-mc540/dox纳米复合材料。
16.前述上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法，其特征在于，其是采用“热分解”法合成，其尺寸均一，具有良好的生物相容性，优异的光热性能和ph响应性能。
17.前述上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法，其特征在于，将其通过体外细胞治疗实验以及小鼠体内肿瘤治疗实验证明该复合材料实现了ptt/pdt/化疗的肿瘤联合治疗，并且具有较高的联合治疗效果。
18.本发明的优点在于：(1) 本发明提供的上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法，重点在于，采用“热分解”法合成ucnps。合成过程操作简单方便。复合纳米材料的制备过程重复率高、稳
定。本发明能够实现纳米级结构的稳定、均一、生物相容性好。
19.(2) 本发明提供的上转换-金属酚醛网络复合纳米材料，重点在于，在ucnps表面包覆一层介孔二氧化硅，使其成为水溶性，用于后面的生物实验。利用二氧化硅的介孔结构，将光敏剂mc540和化疗药物dox负载到ucnps@msio2孔道中。最后采用简单的组装方法，将ucnps@msio2与含有ta和fe
3+
的水溶液混合，ta的强粘附性与金属离子的络合作用诱导了ucnps@msio2表面mpn膜的快速形成。
20.(3)本发明提供的上转换-金属酚醛网络复合纳米材料，重点在于，由于mpn具有双重性能（光热性能和ph响应性能），在808 nm激光照射下，ucnps@msio2@mpn-mc540/dox表现出良好的光热性能，光热转换效率高达35.13%，可以实现光热治疗（ptt）；同时，在肿瘤微环境的弱酸条件下，mpn会逐渐分解，实现dox的可控释放，用于化疗，此外探究了光热对dox释放的影响，结果表明，光热可促进~5%的药物释放；而光敏剂mc540响应808 nm激发ucnps的545 nm的发射峰，实现光动力治疗，这种协同作用可以达到肿瘤细胞致死的目的。
21.(4)本发明提供的上转换-金属酚醛网络复合纳米材料，重点在于，在hela细胞和荷瘤小鼠的抗癌实验中的结果表明，ucnps@msio2@mpn-mc540/dox纳米复合材料在808 nm的激发下，协同ptt/pdt/化疗，相对单一的ptt治疗或pdt/化疗（ptt/化疗）协同治疗的癌细胞致死率显著升高，对于肿瘤生长的抑制效果良好。下面结合附图与具体实施方式，对本发明进一步详细说明。
附图说明
22.图1为实施例1制备纳米材料n2吸附/脱附等温线和孔径分布曲线图。
23.图2为实施例1制备纳米材料电镜图。
24.图3为实施例1制备纳米材料紫外吸收图。
25.图4为实施例2制备纳米材料光热曲线图。
26.图5为实施例3制备纳米材料在不同ph值(7.4和6.0,5.0)的pbs缓冲液中dox的时间依赖性释放曲线图。
27.图6为实施例4制备纳米材料在不同ph值（ph=7.4、ph=6.0和ph=5.0）环境下ros的释放曲线图7为实施例5制备纳米材料体外细胞毒性及体外治疗效果图。
28.图8为实施例6制备纳米材料对抗hela细胞荷瘤鼠肿瘤的抑制实验中小鼠体重变化曲线图及肿瘤生长曲线图。
具体实施方式
29.请参见图1－图8，以下通过实施例和附图对本发明的技术方案进行细致说明。
30.实施例1本实施例提供的一种上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法，其包括如下步骤：（1）制备nayf4:yb,er,nd纳米颗粒，作为内核：采用“热分解”法，在含6 ml油酸（oa）和15 ml十八烯（ode）的100 ml三口烧瓶中加入不同比例的y(ch3co2)3，yb(ch3co2)3，er(ch3co2)3和nd(ch3co2)3（1mmol，y：yb：er：nd=80.5%：18%：0.5%：1%）。将其放在
加热套上，随后升温至160
˚
c，匀速搅拌（rpm≈700），保温五分钟，直至乙酸盐粉末全部溶解，形成稀土-油酸络合物，此时为浅黄色澄清透明溶液；接着关闭加热，待溶液冷却至60
˚
c以下。称取0.1 g氢氧化钠和0.15 g氟化铵溶于5 ml甲醇溶液中，超声溶解，随后将混合溶液逐滴缓慢加入三口烧瓶中，升温至110
˚
c，反应大约30分钟，从而使甲醇蒸发掉，随后利用真空系统，对三口烧瓶内的环境进行抽真空，时间大约30分钟，接着交换抽通气各3次，每次30秒，在氩气环境中将反应物升温至300
˚
c，保温1 h。反应完成后，将溶液冷却至室温，用无水乙醇沉淀产物（nayf4:yb,er,nd上转换纳米颗粒），用环己烷和乙醇分别洗多次，最后得到颗粒均一的上转换纳米材料，然后储存在环己烷中；（2）制备nayf4:yb,er@nayf4核壳上转换纳米颗粒：称取金属-乙酸盐y(ch3co2)3和nd(ch3co2)3（1 mmol，y：nd=80%：20%）加入烧瓶中，并加入12 ml oa和30 ml ode，升温至160℃后，匀速搅拌，保持10 min，使其完全溶解；然后降温至80℃（环己烷沸点）以下，加入5 ml上述nayf4:yb,er,nd环己烷溶液，升温至150℃以除去环己烷溶剂，直至瓶口无液体流下且溶液无气泡产生，温度降到60℃以下；取0.0674 g naoh和0.0374 gnh4f加入到5 ml甲醇溶剂中，超声溶解后逐滴缓慢加入到反应溶液中，升温至110℃，除去甲醇，至无雾气无气泡；然后抽真空30 min，交换通氩气3次，升温300℃，反应1 h。纯化步骤如nayf4:yb,er,nd纳米粒子制备。最终纯化的nayf4:yb,er,nd@nayf4:nd（core-shell）纳米颗粒分散在15 ml环己烷中；（3）水溶性-介孔二氧化硅包覆nayf4:yb,er,nd@nayf4:nd纳米颗粒的制备：首先，称取0.1 g ctab于烧杯中，加入20 ml超纯水，升温至70℃强搅拌下使溶液澄清；关闭加热，室温下，加入5 ml nayf4:yb,er,nd@nayf4:nd（≈15 mg）环己烷溶液，过夜搅拌至溶液再次澄清；过夜后，水分蒸发导致溶剂减少，然后补水至20 ml，将上述溶液移至250 ml三口烧瓶内，再加入40 ml超纯水，6 ml无水乙醇和300μl（2 mol/l）naoh水溶液，置于油浴锅下70℃冷凝回流30 min（转速开最大），用200μl移液枪逐滴缓慢加入400μl teos，搅拌反应1 h后，冷却至室温，离心取得沉淀，无水乙醇洗涤3次，除去游离硅，获得介孔二氧化硅包覆的ucnps。为除去ctab模板剂，获得介孔结构。将沉淀溶解在40 ml酸性乙醇溶液（ph=1.4~1.5）中，60℃下回流搅拌反应1 h。离心得到沉淀，用无水乙醇洗涤2~3次，最终产物分散在20 ml无水乙醇中，此回流过程可重复2-3次，以充分去除ctab，降低生物毒性；（4）ucnps@msio
2-mc540/dox纳米复合材料的制备：配制0.2 mg/ml dox的水溶液和0.2 mg/ml mc540的水溶液，然后将ucnps@msio2水溶液通过离心得到固体沉淀，取4 mg ucnps@msio2浸泡在2 ml dox和mc540的混合溶液中，先放在超声机中超声30 min，然后室温、避光环境下在磁力搅拌加热套上快速搅拌24 h。物理吸附完成以后，通过离心去除上清液留下沉淀，然后超纯水溶解，再次离心留沉淀，洗涤三次，去除游离的dox和mc540；（5）ucnps@msio2@mpn-mc540/dox纳米复合材料的制备：在剧烈搅拌下，将40 μl ta和40 μl fecl3（24 mm）溶液加入到2 ml的ucnps@msio
2-mc540/dox水溶液中。最后通过离心分离并用去离子水洗涤三次最后得到收集ucnps@msio2@mpn-mc540/dox纳米复合材料。
31.所述步骤（1）包括如下具体步骤：（1）在含6 ml油酸（oa）和15 ml十八烯（ode）的100 ml三口烧瓶中加入不同比例的y(ch3co2)3，yb(ch3co2)3，er(ch3co2)3和nd(ch3co2)3（1mmol，y：yb：er：nd=80.5%：18%：0.5%：1%）。将其放在加热套上，随后升温至160
˚
c，匀速搅拌，保温五分钟，直至乙酸盐粉末全部溶
解，形成稀土-油酸络合物，此时为浅黄色澄清透明溶液；（2）接着关闭加热，待溶液冷却至60
˚
c以下。称取0.1 g氢氧化钠和0.15 g氟化铵溶于5 ml甲醇溶液中，超声溶解，随后将混合溶液逐滴缓慢加入三口烧瓶中，升温至110
˚
c，反应大约30分钟，从而使甲醇蒸发掉，随后利用真空系统，对三口烧瓶内的环境进行抽真空，时间大约30分钟，接着交换抽通气各3次，每次30秒，在氩气环境中将反应物升温至300
˚
c，保温1 h。反应完成后，将溶液冷却至室温，用无水乙醇沉淀产物（nayf4:yb,er,nd上转换纳米颗粒），用环己烷和乙醇分别洗多次，最后得到颗粒均一的上转换纳米材料，然后储存在环己烷中。
32.所述步骤（1）中加热套使用的转速为700 rpm。
33.所述步骤（2）中在氩气环境中300
˚
c下反应1小时。
34.所述步骤（3）包括如下具体步骤：（1）首先，称取0.1 g ctab于烧杯中，加入20 ml超纯水，升温至70℃强搅拌下使溶液澄清；关闭加热，室温下，加入5 ml nayf4:yb,er,nd@nayf4:nd（≈15 mg）环己烷溶液，过夜搅拌至溶液再次澄清；（2）过夜后，水分蒸发导致溶剂减少，然后补水至20 ml，将上述溶液移至250 ml三口烧瓶内，再加入40 ml超纯水，6 ml无水乙醇和300μl（2 mol/l）naoh水溶液，置于油浴锅下70℃冷凝回流30 min（转速开最大），用200μl移液枪逐滴缓慢加入400μl teos，搅拌反应1 h后，冷却至室温，离心取得沉淀，无水乙醇洗涤3次，除去游离硅，获得介孔二氧化硅包覆的ucnps；（3）为除去ctab模板剂，获得介孔结构。将沉淀溶解在40 ml酸性乙醇溶液（ph=1.4~1.5）中，60℃下回流搅拌反应1 h。离心得到沉淀，用无水乙醇洗涤2~3次，最终产物分散在20 ml无水乙醇中，此回流过程可重复2-3次，以充分去除ctab，降低生物毒性。
35.所述步骤(3)中加热搅拌的温度为70℃，转速为1250 rpm。
36.所述步骤(3)中加入nayf4:yb,er,nd@nayf4:nd环己烷溶液约为15 mg，过夜溶液澄清后在进行下一步实验。
37.所述步骤(3)中，除去ctab模板剂要在ph=1.4~1.5的酸性乙醇溶液进行回流，该过程可重复2-3次，以充分去除ctab，降低生物毒性。
38.所述步骤(4)包括如下具体步骤：（1）配制0.2 mg/ml dox的水溶液和0.2 mg/ml mc540的水溶液，然后将ucnps@msio2水溶液通过离心得到固体沉淀，取4 mg ucnps@msio2浸泡在2 ml dox和mc540的混合溶液中，先放在超声机中超声30 min，然后室温、避光环境下在磁力搅拌加热套上快速搅拌24 h；（2）物理吸附完成以后，通过离心去除上清液留下沉淀，然后超纯水溶解，再次离心留沉淀，洗涤三次，去除游离的dox和mc540。
39.所述步骤（5）中，在剧烈搅拌下，将40 μl ta和40 μl fecl3（24 mm）溶液加入到2 ml的ucnps@msio
2-mc540/dox水溶液中。最后通过离心分离并用去离子水洗涤三次最后得到收集ucnps@msio2@mpn-mc540/dox纳米复合材料。
40.前述上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法，其特征在于，其是采用“热分解”法合成，其尺寸均一，具有良好的生物相容性，优异的光热性能和ph响应性能。
41.前述上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法，其特征在于，将其通过体外细胞治疗实验以及小鼠体内肿瘤治疗实验证明该复合材料实现了ptt/pdt/化疗的肿瘤联合治疗，并且具有较高的联合治疗效果。
42.一种采用上述方法制备而得的上转换-金属酚醛网络复合纳米材料，采用“热分解”法合成。
43.附图1为本实施例1制得的介孔纳米材料孔径分析图。氮气吸附-脱附的方式对它们进行了测试。从氮气吸附-脱附等温曲线中可以看出，介孔纳米材料表现出典型的iv型等温线，使用brunauer-emmett-teller（bet）方法根据氮气吸附-脱附等温曲线计算出合成的介孔纳米材料的的孔径约为2.2 nm，基本符合介孔尺寸的规定（2-50 nm）；计算得到介孔纳米颗粒的比表面积为979 m2/g。
44.附图2为本实施例1制得的上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的tem照片，观察可知，mpn包覆的ucnps@msio2具有良好的单分散性，平均粒径约为101 nm，对于在生物体内循环有重要意义。
45.附图3为本实施例1制得的上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的紫外吸收光谱。由图可知，ucnps@msio2@mpn在560 nm处有一个宽的吸收峰，这是由于fe
3+-ta络合物的形成伴随着从单宁酸到铁离子的电荷转移。
46.实施例2本实施例提供的一种上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法及应用，与实施例1基本相同，其不同之处在于：其具体将实例1制得的上转换-金属酚醛网络复合纳米材料，应用于光热实验的方法，包括以下步骤：(1) 用超纯水分别配制纳米颗粒浓度为0.1，0.2，0.4，0.8 mg/ml的所述纳米材料；(2) 各取1 ml于比色皿中用 808 nm 激光器在2 w/cm2的功率密度下进行光照；(3) 用微型热电偶来探测监测不同浓度材料随照射时间的升温情况。
47.图4为实施例2制备纳米材料光热曲线图。观察可知，随着样品浓度的增大，样品的温度逐渐升高，证实所制备的纳米材料有着很好的光热效应，光稳定性高。
48.实例3本实施例提供的一种上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法及应用，与实施例1-2基本相同，不同之处在于：负载抗癌药物dox的纳米材料，进一步作为治疗剂，应用于化疗的方法，包括以下步骤：(1)2 mg ucnp@msio2加入2 ml盐酸阿霉素溶液(0.2 mg/ml)中，黑暗中搅拌吸附24小时后得到ucnps@msio
2-dox产物通过离心分离并用水洗涤；(2) 将2 mlucnps@msio2@mpn-dox（1 mg/ml）溶液加入到分子量截止值为8000 da的透析袋中，用细线将两头扎紧，防止液体泄露。将透析袋浸没在含有10 ml不同ph值（ph 7.4、ph 6.0和ph 5.0）的磷酸盐缓冲液（pbs）的烧杯中，没有或伴随nir激光照射（2 w/cm2）条件下缓慢搅拌；(3) 在不同时间点吸出并收集透析液，然后再迅速加入等量的新鲜缓冲溶液作为
补充剂。通过紫外-可见吸收光谱法在480 nm处测定不同ph的pbs缓冲溶液中有无激光照射下的dox的时间依赖性释放量。
49.图5为实施例3制得的上转换-金属酚醛网络复合纳米材料在不同ph值(7.4和6.0,5.0)的pbs缓冲液中dox的时间依赖性释放曲线图。观察可知，dox的负载量为10.03wt %，dox的释放曲线与ph值相关，酸性条件下释放速率增加。另外，在近红外光照射下，光热促进~5% dox释放，这是光热效应加快 dox分子布朗运动，促进药物渗透。
50.实施例4本实施例提供的一种上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法及应用，与实施例1-3基本相同，不同之处在于：其具体为一种负载mc540的纳米诊疗剂复合材料的体外光动力治疗的方法，其包括以下步骤：(1) 取2 ml ucnps@msio
2-mc540水溶液于比色皿中，加入10 μl dpbf（10 mm）乙醇溶液。在黑暗环境下，用808 nm激光器（1w/cm2）照射30 min，每隔5 min测溶液的吸收光谱，记录最大吸收波长（~417 nm）处的吸光度值。照射过程中不断搅拌，使溶液能均匀受到辐射。对照组分别是无激光照射下ucnps@msio
2-mc540水溶液以及纯水溶液，以排除激光和dpbf自然降解的影响。
51.(2) 另外做了ucnps@msio2@mpn-mc540/dox在不同ph值（ph=7.4、ph=6.0和ph=5.0）环境下ros的释放实验，简单来说，首先合成的ucnps@msio2@mpn-mc540/dox在不同ph值（ph=7.4、ph=6.0和ph=5.0）的溶液中放置一段时间，等到mpn分解后在进行ros的释放实验，具体操作如上。
52.图6为实施例4制备的ucnps@msio2@mpn-mc540/dox在不同ph值（ph=7.4、ph=6.0和ph=5.0）环境下ros的释放曲线。由图可知，在ph=5.0和ph=6.0的溶液中，ucnps@msio2@mpn-mc540/dox具有与ucnps@msio
2-mc540相似的1o2产生能力，可以证明ucnps@msio2@mpn-mc540/dox在肿瘤微环境中对于实现pdt具有巨大的潜力。但在ph=7.4时，ucnps@msio2@mpn-mc540/dox产生1o2的能力较弱，这可能是由于外层的mpn膜吸收了808 nm的光，将光转换成了热，实现ptt。
53.实施例5本实施例提供的一种上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法及应用，与实施例1-4均基本相同，不同之处在于：其具体为一种负载dox和mc540的纳米诊疗剂复合材料应用于进行体外毒性评估，，其包括以下步骤：（1）将宫颈癌hela细胞以1.5
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105个细胞/孔的密度播种于96孔板中，与含10 % fbs和1 %青霉素/链霉素的dmem共孵育，在37 ℃下5 % co2浓度的培养箱中培养24 h;（2）用移液枪吸去旧培养基，加入100 μl含不同浓度材料（0、25、50、100 μg/ml）的新培养基，再放入培养箱中孵育24 h。
54.（3）用移液枪吸出含有纳米材料的培养基混合溶液，并用pbs洗3-4次，是为了去除游离材料，随后加入新的培养基，将细胞置于808 nm（2w/cm2）激光下照射5 min。照射完成后，重新放置于恒温培养箱中培养24 h。到时间后，加入定量cck-8试剂使用酶标仪测每孔的吸光度。对照组设置为控制其他变量一致，不加808 nm激光照射。
55.图7为实施例5制备纳米材料如图所示，未加入药物dox的材料对细胞没有明显的毒性，说明材料对细胞没有显著的毒性且具有良好的生物相容性。当加入含dox的纳米复合材料时，随着纳米复合材料的浓度的增加，细胞存活率显著下降。值得注意的是，808 nm激光的照射将触发进行ptt治疗的样品材料ucnps@msio2@mpn，ptt/pdt治疗的样品材料ucnps@msio2@mpn-mc540，ptt/化疗治疗的样品材料ucnps@msio2@mpn-dox以及联合ptt/pdt/化疗的样品材料ucnps@msio2@mpn-mc540/dox。在808 nm激光照射5分钟后，单独的ptt治疗效果并不明显，即使浓度达到100 μg/ml时，细胞的存活率仍可达到60%左右；另外当hela细胞与100
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g/ml ucnps@msio2@mpn-mc540/dox孵育时的细胞活力与100
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g/ml的ucnps@msio2@mpn-mc540或ucnps@msio2@mpn-dox孵育后的细胞活力相比，细胞的存活率下降到低于10%，这充分说明pdt/ptt/化疗联合治疗在抑制癌细胞生长方面比单一的ptt或ptt/pdt（ptt/化疗）治疗有更好的疗效。
56.实施例6本实施例提供的一种上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法及应用，与实施例1-5均基本相同，不同之处在于：其具体为一种负载dox和mc540的纳米诊疗剂复合材料用于体内肿瘤光热/光动力/化疗治疗的方法，其包括以下步骤：(1) 在雌性balb/c小鼠右腋皮下注射5
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106个hela细胞, 待肿瘤体积生长到100 mm3左右;(2) 将hela荷瘤小鼠随机分为五组：（1）pbs+808 nm，（2）ucnps@msio2@mpn（10 mg/ml，100
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l）+808 nm激光，（3）ucnps@msio2@mpn-mc540（10 mg/ml，100
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l）+808 nm激光，（4）ucnps@msio2@mpn-dox（10 mg/ml，100
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l）+808 nm激光，（5）ucnps@msio2@mpn-mc540/dox（10 mg/ml，100
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l）+808 nm激光。材料注射1小时之后，将小老鼠肿瘤部位暴露在808 nm激光下，以功率密度为2.5 w/cm2照射治疗15分钟，但为了避免过热导致小鼠皮肤组织灼伤，每照射5分钟，暂停3分钟后继续照射。每隔一天进行一次治疗。治疗期间，每天记录小鼠体重和肿瘤体积变化。
57.图8实施例6制备纳米材料对抗hela细胞荷瘤小鼠肿瘤的抑制实验中肿瘤生长曲线图。组小鼠的体重同初始体重相比没有太大变化，说明材料对小鼠的健康状况并没有很大影响。我们也记录了各组肿瘤大小的变化情况：（1）组肿瘤体积有明显的增长趋势，说明激光和不加材料对肿瘤的生长没有抑制作用；（2）组为光热治疗组，可以看到肿瘤有所减小；（3）组为光热治疗+光动力治疗组，可以看到肿瘤生长体积缓慢；（4）组为光热+药物联合治疗组，肿瘤明显比(2)组的体积要小；（5）组为光热+光动力+药物联合治疗组，肿瘤明显比其他组的体积要小的多，说明ucnps@msio2@mpn-mc540/dox复合纳米材料具有良好的肿瘤联合治疗效果。解剖下来的各组小鼠肿瘤照片也与上述结果一致，更直观的反映出对肿瘤的抑制效果:（3）、（4）、（5）组肿瘤体积明显较前两组小，其中联合治疗（5）组体积最小。
58.本发明提供的方法，合成的nayf4:yb,er,nd@nayf4:nd上转换纳米粒子，包覆二氧化硅层形成ucnps@msio2，改善其亲水性并使其具备负载材料的能力，利用ucnps@msio2的介孔负载dox和mc540，形成ucnps@msio
2-mc540/dox纳米复合材料，最后在最外面一层包覆fe-ta形成的络合物（mpn），最终形成ucnps@msio2@mpn-mc540/dox纳米复合材料。
59.本发明的重点在于，利用了mpn的光热性能和ph响应性能，在808 nm激光照射下，
ucnps@msio2@mpn-mc540/dox表现出良好的光热性能，实现光热治疗；同时，在肿瘤微环境的弱酸条件下，mpn膜逐渐分解，实现dox的可控释放，用于化疗；而光敏剂mc540响应808 nm激发ucnps的545 nm的发射峰，实现光动力治疗。这种协同作用可以达到肿瘤细胞致死的目的。ucnps@msio2@mpn-mc540/dox纳米复合材料在808 nm的激发下，由于协同ptt/pdt/化疗治疗的效果，相对单一的ptt或pdt/ptt（ptt/化疗）协同治疗的癌细胞致死率明显升高，肿瘤生长抑制效果显著。
60.本发明并不限于上述实施方式，采用与其相同或者相似方法所得到的其它类似的纳米复合材料的方法，在本发明各实施例记载的各组分取值范围内具体选择具体的数值、用于进一步改善水溶性以及功能化的不同的有机分子等，均在本发明保护范围内，本发明实施例不再一一列出。
61.以上所述仅为本发明的示例性实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备nayf4:yb,er,nd纳米颗粒，作为内核：采用“热分解”法，在含6ml油酸(oa)和15ml十八烯(ode)的100ml三口烧瓶中加入不同比例的y(ch3co2)3，yb(ch3co2)3，er(ch3co2)3和nd(ch3co2)3(1mmol，y：yb：er：nd＝80.5％：18％：0.5％：1％)。将其放在加热套上，随后升温至160℃，匀速搅拌(rpm≈700)，保温五分钟，直至乙酸盐粉末全部溶解，形成稀土-油酸络合物，此时为浅黄色澄清透明溶液；接着关闭加热，待溶液冷却至60℃以下。称取0.1g氢氧化钠和0.15g氟化铵溶于5ml甲醇溶液中，超声溶解，随后将混合溶液逐滴缓慢加入三口烧瓶中，升温至110℃，反应大约30分钟，从而使甲醇蒸发掉，随后利用真空系统，对三口烧瓶内的环境进行抽真空，时间大约30分钟，接着交换抽通气各3次，每次30秒，在氩气环境中将反应物升温至300℃，保温1h。反应完成后，将溶液冷却至室温，用无水乙醇沉淀产物(nayf4:yb,er,nd上转换纳米颗粒)，用环己烷和乙醇分别洗多次，最后得到颗粒均一的上转换纳米材料，然后储存在环己烷中；(2)制备nayf4:yb,er@nayf4核壳上转换纳米颗粒：称取金属-乙酸盐y(ch3co2)3和nd(ch3co2)3(1mmol，y：nd＝80％：20％)加入烧瓶中，并加入12mloa和30ml ode，升温至160℃后，匀速搅拌，保持10min，使其完全溶解；然后降温至80℃(环己烷沸点)以下，加入5ml上述nayf4:yb,er,nd环己烷溶液，升温至150℃以除去环己烷溶剂，直至瓶口无液体流下且溶液无气泡产生，温度降到60℃以下；取0.0674gnaoh和0.0374gnh4f加入到5ml甲醇溶剂中，超声溶解后逐滴缓慢加入到反应溶液中，升温至110℃，除去甲醇，至无雾气无气泡；然后抽真空30min，交换通氩气3次，升温300℃，反应1h。纯化步骤如nayf4:yb,er,nd纳米粒子制备。最终纯化的nayf4:yb,er,nd@nayf4:nd(core-shell)纳米颗粒分散在15ml环己烷中；(3)水溶性-介孔二氧化硅包覆nayf4:yb,er,nd@nayf4:nd纳米颗粒的制备：首先，称取0.1g ctab于烧杯中，加入20ml超纯水，升温至70℃强搅拌下使溶液澄清；关闭加热，室温下，加入5mlnayf4:yb,er,nd@nayf4:nd(≈15mg)环己烷溶液，过夜搅拌至溶液再次澄清；过夜后，水分蒸发导致溶剂减少，然后补水至20ml，将上述溶液移至250ml三口烧瓶内，再加入40ml超纯水，6ml无水乙醇和300μl(2mol/l)naoh水溶液，置于油浴锅下70℃冷凝回流30min(转速开最大)，用200μl移液枪逐滴缓慢加入400μlteos，搅拌反应1h后，冷却至室温，离心取得沉淀，无水乙醇洗涤3次，除去游离硅，获得介孔二氧化硅包覆的ucnps。为除去ctab模板剂，获得介孔结构。将沉淀溶解在40ml酸性乙醇溶液(ph＝1.4～1.5)中，60℃下回流搅拌反应1h。离心得到沉淀，用无水乙醇洗涤2～3次，最终产物分散在20ml无水乙醇中，此回流过程可重复2-3次，以充分去除ctab，降低生物毒性；(4)ucnps@msio
2-mc540/dox纳米复合材料的制备：配制0.2mg/mldox的水溶液和0.2mg/mlmc540的水溶液，然后将ucnps@msio2水溶液通过离心得到固体沉淀，取4mgucnps@msio2浸泡在2mldox和mc540的混合溶液中，先放在超声机中超声30min，然后室温、避光环境下在磁力搅拌加热套上快速搅拌24h。物理吸附完成以后，通过离心去除上清液留下沉淀，然后超纯水溶解，再次离心留沉淀，洗涤三次，去除游离的dox和mc540；(5)ucnps@msio2@mpn-mc540/dox纳米复合材料的制备：在剧烈搅拌下，将40μlta和40μlfecl3(24mm)溶液加入到2ml的ucnps@msio
2-mc540/dox水溶液中。最后通过离心分离并用去离子水洗涤三次最后得到收集ucnps@msio2@mpn-mc540/dox纳米复合材料。2.如权利要求1所述的上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法，其特征在于，
所述步骤(1)包括如下具体步骤：(1)在含6ml油酸(oa)和15ml十八烯(ode)的100ml三口烧瓶中加入不同比例的y(ch3co2)3，yb(ch3co2)3，er(ch3co2)3和nd(ch3co2)3(1mmol，y：yb：er：nd＝80.5％：18％：0.5％：1％)。将其放在加热套上，随后升温至160℃，匀速搅拌，保温五分钟，直至乙酸盐粉末全部溶解，形成稀土-油酸络合物，此时为浅黄色澄清透明溶液；(2)接着关闭加热，待溶液冷却至60℃以下。称取0.1g氢氧化钠和0.15g氟化铵溶于5ml甲醇溶液中，超声溶解，随后将混合溶液逐滴缓慢加入三口烧瓶中，升温至110℃，反应大约30分钟，从而使甲醇蒸发掉，随后利用真空系统，对三口烧瓶内的环境进行抽真空，时间大约30分钟，接着交换抽通气各3次，每次30秒，在氩气环境中将反应物升温至300℃，保温1h。反应完成后，将溶液冷却至室温，用无水乙醇沉淀产物(nayf4:yb,er,nd上转换纳米颗粒)，用环己烷和乙醇分别洗多次，最后得到颗粒均一的上转换纳米材料，然后储存在环己烷中。3.如权利要求1所述的上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中加热套使用的转速为700rpm。4.如权利要求1所述的上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中在氩气环境中300℃下反应1小时。5.如权利要求1所述的上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)包括如下具体步骤：(1)首先，称取0.1g ctab于烧杯中，加入20ml超纯水，升温至70℃强搅拌下使溶液澄清；关闭加热，室温下，加入5mlnayf4:yb,er,nd@nayf4:nd(≈15mg)环己烷溶液，过夜搅拌至溶液再次澄清；(2)过夜后，水分蒸发导致溶剂减少，然后补水至20ml，将上述溶液移至250ml三口烧瓶内，再加入40ml超纯水，6ml无水乙醇和300μl(2mol/l)naoh水溶液，置于油浴锅下70℃冷凝回流30min(转速开最大)，用200μl移液枪逐滴缓慢加入400μl teos，搅拌反应1h后，冷却至室温，离心取得沉淀，无水乙醇洗涤3次，除去游离硅，获得介孔二氧化硅包覆的ucnps；(3)为除去ctab模板剂，获得介孔结构。将沉淀溶解在40ml酸性乙醇溶液(ph＝1.4～1.5)中，60℃下回流搅拌反应1h。离心得到沉淀，用无水乙醇洗涤2～3次，最终产物分散在20ml无水乙醇中，此回流过程可重复2-3次，以充分去除ctab，降低生物毒性。6.如权利要求1所述的上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中加热搅拌的温度为70℃，转速为1250rpm。7.如权利要求1所述的上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中加入nayf4:yb,er,nd@nayf4:nd环己烷溶液约为15mg，过夜溶液澄清后在进行下一步实验。8.如权利要求1所述的上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，除去ctab模板剂要在ph＝1.4～1.5的酸性乙醇溶液进行回流，该过程可重复2-3次，以充分去除ctab，降低生物毒性。9.如权利要求1所述的上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)包括如下具体步骤：(1)配制0.2mg/ml dox的水溶液和0.2mg/ml mc540的水溶液，然后将ucnps@msio2水溶液通过离心得到固体沉淀，取4mg ucnps@msio2浸泡在2mldox和mc540的混合溶液中，先放
在超声机中超声30min，然后室温、避光环境下在磁力搅拌加热套上快速搅拌24h；(2)物理吸附完成以后，通过离心去除上清液留下沉淀，然后超纯水溶解，再次离心留沉淀，洗涤三次，去除游离的dox和mc540。10.如权利要求1所述的上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，在剧烈搅拌下，将40μl ta和40μl fecl3(24mm)溶液加入到2ml的ucnps@msio
2-mc540/dox水溶液中。最后通过离心分离并用去离子水洗涤三次最后得到收集ucnps@msio2@mpn-mc540/dox纳米复合材料。11.一种采用权利要求1～10任一项所述方法制备的上转换-金属酚醛网络复合纳米材料，其特征在于，其是采用“热分解”法合成，其尺寸均一，具有良好的生物相容性，优异的光热性能和ph响应性能。12.如权利要求11所述上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法，其特征在于，将其通过体外细胞治疗实验以及小鼠体内肿瘤治疗实验证明该复合材料实现了ptt/pdt/化疗的肿瘤联合治疗，并且具有较高的联合治疗效果。
技术总结本发明涉及生物医学纳米材料领域，公开了一种上转换-金属酚醛网络复合纳米材料的制备方法。包括如下步骤：（1）采用热分解法合成稀土上转换纳米粒子；（2）在UCNPs表面包覆一层介孔二氧化硅，使其具有水溶性，将光敏剂和化疗药物DOX负载到UCNPs@mSiO2孔道中；（3）将UCNPs@mSiO2与含有TA和Fe
技术研发人员：刘金亮 秦腾 魏芹 陈晨
受保护的技术使用者：上海大学
技术研发日：2022.05.26
技术公布日：2022/11/1
