一种分离测定dpp-iv抑制剂有关物质的方法
技术领域
1.本发明属于药物分析检测领域，涉及一种分离测定dpp-iv抑制剂有关物质的方法，具体来说，涉及一种分离测定磷酸盛格列汀有关物质的方法。
背景技术：2.盛格列汀是一种新型的具有高活性和选择性的二肽基肽酶-iv（dipeptidyl peptidase iv，dpp-iv）抑制剂。临床研究结果表明，盛格列汀具有良好的降糖效果，且不会引起空腹低血糖，也不会增加动物的体重，盛格列汀还具有良好的药代特点和安全性。盛格列汀的一种药用形态为盛格列汀磷酸盐一水合物（或简称“磷酸盛格列汀”），其化学名称为(r)-3-氨基-1-((r)-8-甲基-3-(三氟甲基)-5,6-二氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(8h)-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮磷酸盐一水合物，分子式为c
18h18
f6n4o
·
h3po4·
h2o，分子量为536.37，化学结构式为：。
[0003]
磷酸盛格列汀合成工艺中采用(r)-3-(叔丁氧羰基氨基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸（盛格列汀-2）和(r)-8-甲基-3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,5-a]-吡嗪（盛格列汀-1）为起始原料，经两个步骤（即两步有效化学反应，包括步骤1的缩合反应和步骤2的脱保护基反应），得到磷酸盛格列汀。具体合成路线如下：。
[0004]
磷酸盛格列汀的合成工艺不可避免会引入一些物质，例如合成过程中带入的起始原料、中间体、聚合体、副反应产物，以及贮藏过程中的降解产物等，这些物质不利于磷酸盛格列汀的质量控制。因此，如何对磷酸盛格列汀有关物质进行检测分析，进而控制磷酸盛格列汀的质量，成为亟待解决的技术问题。
技术实现要素：[0005]
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种分离测定dpp-iv抑制剂有关物质的方法。其中，所述dpp-iv抑制剂为磷酸盛格列汀。该方法能够实现磷酸盛格列汀有关物质和主成分之间的有效分离，定性及定量检测磷酸盛格列汀有关物质情况，有利于对磷酸盛格列汀的质量进行控制，系统适用性良好，精密度和准确度较高。
[0006]
本发明采用的技术方案如下：第一方面，本发明提供了一种分离测定dpp-iv抑制剂有关物质的方法，所述dpp-iv抑制剂为磷酸盛格列汀，其包括如下步骤：配制供试品溶液的步骤：精密称定磷酸盛格列汀供试品，溶解于甲醇水溶液中并定容，得磷酸盛格列汀供试品溶液；配制分离度溶液的步骤：精密称定磷酸盛格列汀供试品和杂质，溶解于甲醇水溶液中并定容，得分离度溶液；其中，所述杂质包含杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7和杂质8；配制参比溶液的步骤：精密称定磷酸盛格列汀供试品，溶解于甲醇水溶液中并定容，或者，使用甲醇水溶液稀释所述磷酸盛格列汀供试品溶液，得磷酸盛格列汀参比溶液；其中，所述磷酸盛格列汀参比溶液中磷酸盛格列汀的浓度为所述磷酸盛格列汀供试品溶液中浓度的0.5%-2%；液相色谱检测的步骤：对所述甲醇水溶液、所述磷酸盛格列汀参比溶液、所述分离度溶液和所述磷酸盛格列汀供试品溶液分别进行液相色谱检测，所述液相色谱的条件包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相为二元流动相系统，其中，流动相a为乙腈，流动相b为ph值为5.0-6.0的0.015mol/l磷酸二氢钠水溶液；洗脱方式为梯度洗脱；杂质计算的步骤：以主成分对照法计算得出磷酸盛格列汀供试品中杂质相对于磷酸盛格列汀的含量。
[0007]
进一步地，所述磷酸盛格列汀具有如下结构：；所述杂质1具有如下结构：；所述杂质2具有如下结构：
；所述杂质3具有如下结构：；所述杂质4具有如下结构：；所述杂质5具有如下结构：；所述杂质6具有如下结构：；所述杂质7具有如下结构：；
所述杂质8具有如下结构：。
[0008]
进一步地，所述杂质为杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7和杂质8的组合。
[0009]
进一步地，所述梯度洗脱的程序如下：0分钟时，流动相a与流动相b的体积比为（5-10）：（95-90）；40分钟时，流动相a与流动相b的体积比为（75-70）：（25-30）；43分钟时，流动相a与流动相b的体积比为75：25；45分钟时，流动相a与流动相b的体积比为（5-10）：（95-90）；50分钟时，流动相a与流动相b的体积比为（5-10）：（95-90）。
[0010]
进一步地，所述液相色谱的条件还包括：柱温为40-50℃；流速为0.9-1.1ml/min；进样体积为15-25μl。
[0011]
进一步地，所述液相色谱的条件还包括：检测波长为200-220nm。
[0012]
进一步地，所述磷酸盛格列汀供试品溶液中磷酸盛格列汀的浓度为0.5-1.5mg/ml。
[0013]
进一步地，所述分离度溶液中磷酸盛格列汀的浓度为0.5-1.5mg/ml，各杂质的浓度为1.0-2.0μg/ml。
[0014]
进一步地，所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分比为40%-60%。
[0015]
第二方面，本发明提供了下列化合物或其药学上可接受的盐中的一种或多种在分离测定dpp-iv抑制剂有关物质的方法（特别是第一方面中的方法）中用于配制分离度溶液的用途：、、、、、、
和；其中，所述dpp-iv抑制剂为磷酸盛格列汀。
[0016]
第三方面，本发明提供了在分离测定dpp-iv抑制剂有关物质的方法（特别是第一方面中的方法）中用于配制分离度溶液的下列化合物或其药学上可接受的盐：、和；其中，所述dpp-iv抑制剂为磷酸盛格列汀。
[0017]
本发明具有如下有益效果：1、本发明能够实现磷酸盛格列汀有关物质（既包括现有技术中已公开的化合物，还包括本发明中新发现的化合物）和主成分之间的有效分离；2、本发明能够定性及定量检测磷酸盛格列汀有关物质（既包括现有技术中已公开的化合物，还包括本发明中新发现的化合物）情况，有利于对磷酸盛格列汀的质量进行控制；3、本发明系统适用性良好，精密度和准确度较高。
附图说明
[0018]
图1是空白溶液的液相色谱图。
[0019]
图2是分离度溶液的液相色谱图。
具体实施方式
[0020]
以下对本发明的实施方式进行说明，但本发明不限定于此。在发明请求保护的范围内可以进行各种变更，而适当组合不同实施方式、实施例中各自公开的技术手段而得到的实施方式、实施例也涵盖在本发明的范围之内。
[0021]
除非另有定义，本发明所使用的科学和技术术语的含义与本发明所属技术领域中
的普通技术人员所通常理解的含义相同。
[0022]
在本发明中，使用“数值a~数值b”、“数值a-数值b”、“数值a以上”、“数值a以下”表示的数值范围是指包含端点数值a、b的范围。
[0023]
在本发明中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
[0024]
在本发明中，术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”可以指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
[0025]
在本发明中，“有关物质”是指在dpp-iv抑制剂合成过程中带入的起始原料、中间体、聚合体、副反应产物，以及在dpp-iv抑制剂贮藏过程中的降解产物等。其中，所述dpp-iv抑制剂为磷酸盛格列汀。
[0026]
在本发明的一些实施方式中，所述磷酸盛格列汀为(r)-3-氨基-1-((r)-8-甲基-3-(三氟甲基)-5,6-二氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(8h)-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮磷酸盐一水合物。
[0027]
在本发明的一些实施方式中，所述有关物质包括杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7和杂质8以及其他未知杂质。
[0028]
在本发明的一些实施方式中，所述杂质1为磷酸盛格列汀合成过程中的起始物料盛格列汀-2的酸降解物/脱保护产物，即(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸，其具有如下结构：。
[0029]
在本发明的一些实施方式中，所述杂质2为磷酸盛格列汀合成过程中的起始物料盛格列汀-1，即(r)-8-甲基-3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,5-a]-吡嗪，其具有如下结构：。
[0030]
在本发明的一些实施方式中，所述杂质3为(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯，其具有如下结构：。
[0031]
在本发明的一些实施方式中，所述杂质4为(r)-3-氨基-n,n-二乙基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酰胺，其具有如下结构：。
[0032]
在本发明的一些实施方式中，所述杂质5为磷酸盛格列汀合成过程中的起始物料盛格列汀-2，即(r)-3-(叔丁氧羰基氨基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸，其具有如下结构：。
[0033]
在本发明的一些实施方式中，所述杂质6为n-((r)-4-((r)-8-甲基-3-(三氟甲基)-5,6-二氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(8h)-基)-4-氧代-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-基)乙酰胺，其具有如下结构：。
[0034]
在本发明的一些实施方式中，所述杂质7为(r)-1-(8-甲基-3-(三氟甲基)-5,6-二氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(8h)-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1,3-二酮，其具有如下结构：。
[0035]
在本发明的一些实施方式中，所述杂质8为磷酸盛格列汀合成过程中的中间体盛格列汀-3，即为(r)-4-((r)-8-甲基-3-(三氟甲基)-5,6-二氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(8h)-基)-4-氧代-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-基氨基甲酸叔丁酯，其具有如下结构：
。
[0036]
本发明提供了一种分离测定dpp-iv抑制剂有关物质的方法，所述dpp-iv抑制剂为磷酸盛格列汀，所述方法包括如下步骤：配制供试品溶液的步骤、配制分离度溶液的步骤、配制参比溶液的步骤、液相色谱检测的步骤和杂质计算的步骤。
[0037]
在本发明的一些实施方式中，所述配制供试品溶液的步骤为：精密称定磷酸盛格列汀供试品，溶解于甲醇水溶液中并定容，得磷酸盛格列汀供试品溶液。
[0038]
在本发明的一些实施方式中，所述磷酸盛格列汀供试品溶液中磷酸盛格列汀的浓度为0.5-1.5mg/ml，例如，0.5mg/ml、0.7mg/ml、0.9mg/ml、1mg/ml、1.1mg/ml、1.3mg/ml、1.5mg/ml或其他浓度。
[0039]
在本发明的一些优选的实施方式中，所述磷酸盛格列汀供试品溶液中磷酸盛格列汀的浓度为1mg/ml。
[0040]
在本发明的一些实施方式中，所述配制分离度溶液的步骤为：精密称定磷酸盛格列汀供试品和杂质，溶解于甲醇水溶液中并定容，得分离度溶液。
[0041]
在本发明的一些实施方式中，所述分离度溶液中的杂质包含杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7和杂质8。
[0042]
在本发明的一些优选的实施方式中，所述分离度溶液中的杂质为杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7和杂质8的组合。
[0043]
在本发明的一些实施方式中，所述分离度溶液中磷酸盛格列汀的浓度为0.5-1.5mg/ml，例如，0.5mg/ml、0.7mg/ml、0.9mg/ml、1mg/ml、1.1mg/ml、1.3mg/ml、1.5mg/ml或其他浓度。
[0044]
在本发明的一些优选的实施方式中，所述分离度溶液中磷酸盛格列汀的浓度为1mg/ml。
[0045]
在本发明的一些实施方式中，所述分离度溶液中各杂质的浓度为1.0-2.0μg/ml，例如，1.0μg/ml、1.2μg/ml、1.4μg/ml、1.5μg/ml、1.6μg/ml、1.8μg/ml、2.0μg/ml或其他浓度。
[0046]
在本发明的一些优选的实施方式中，所述分离度溶液中各杂质的浓度为1.5μg/ml。
[0047]
在本发明的一些实施方式中，所述配制参比溶液的步骤为：精密称定磷酸盛格列汀供试品，溶解于甲醇水溶液中并定容，得磷酸盛格列汀参比溶液。
[0048]
在本发明的另一些实施方式中，所述配制参比溶液的步骤为：使用甲醇水溶液稀释所述磷酸盛格列汀供试品溶液，得磷酸盛格列汀参比溶液。
[0049]
在本发明的一些实施方式中，所述磷酸盛格列汀参比溶液中磷酸盛格列汀的浓度为所述磷酸盛格列汀供试品溶液中浓度的0.5%-2%，例如，0.5%、1%、1.5%、2%或其他比例。
[0050]
在本发明的一些优选的实施方式中，所述磷酸盛格列汀参比溶液中磷酸盛格列汀的浓度为所述磷酸盛格列汀供试品溶液中浓度的1%。
[0051]
在本发明的一些实施方式中，所述分离测定dpp-iv抑制剂有关物质的方法还可以包括配制杂质储备溶液的步骤，所述dpp-iv抑制剂为磷酸盛格列汀。
[0052]
在本发明的一些实施方式中，所述配制杂质储备溶液的步骤为：分别精密称定至少一种杂质，溶解于甲醇中，得至少一种杂质储备溶液。
[0053]
在本发明的一些实施方式中，所述至少一种杂质储备溶液可以任意组合，进而得到含有两种或两种以上杂质的储备溶液。
[0054]
在本发明的一些实施方式中，所述杂质储备溶液中杂质的浓度为100-500μg/ml，例如，100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml或其他浓度。
[0055]
在本发明的一些优选的实施方式中，所述杂质储备溶液中杂质的浓度为300μg/ml。
[0056]
在本发明中，所述杂质储备溶液可直接使用也可经稀释后使用。
[0057]
在本发明的一些实施方式中，可以使用甲醇水溶液将所述杂质储备溶液稀释，并使最终杂质浓度为12-17μg/ml，例如，12μg/ml、13μg/ml、14μg/ml、15μg/ml、16μg/ml、17μg/ml或其他浓度。
[0058]
在本发明的一些优选的实施方式中，可以使用甲醇水溶液将所述杂质储备溶液稀释，并使最终杂质浓度为15μg/ml。
[0059]
相应的，在本发明的另一些实施方式中，所述配制分离度溶液的步骤为：精密称定磷酸盛格列汀供试品，使用甲醇水溶液溶解并稀释所述杂质储备溶液或经过稀释的杂质储备溶液，使所述分离度溶液中磷酸盛格列汀和各杂质的浓度为目标浓度。
[0060]
在本发明的一些实施方式中，所述分离测定dpp-iv抑制剂有关物质的方法还可以包括配制杂质定位溶液的步骤，所述dpp-iv抑制剂为磷酸盛格列汀。
[0061]
在本发明的一些实施方式中，所述配制杂质定位溶液的步骤为：分别精密称定至少一种杂质，溶解于甲醇中并定容，或者，精密称定所述杂质储备溶液或经过稀释的杂质储备溶液，使用甲醇水溶液稀释并定容，得至少一种杂质定位溶液。
[0062]
在本发明的一些实施方式中，所述杂质定位溶液中各杂质的的浓度为1.0-2.0μg/ml，例如，1.0μg/ml、1.2μg/ml、1.4μg/ml、1.5μg/ml、1.6μg/ml、1.8μg/ml、2.0μg/ml或其他浓度。
[0063]
在本发明的一些优选的实施方式中，所述杂质定位溶液中各杂质的浓度为1.5μg/ml。
[0064]
在本发明的一些实施方式中，所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分比为40%-60%，例如，40%、50%、60%或其他比例。
[0065]
在本发明的一些优选的实施方式中，所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分比为50%。
[0066]
在本发明的一些实施方式中，所述甲醇水溶液可以提前配制，并作为空白溶液。
[0067]
在本发明的一些实施方式中，所述液相色谱检测的步骤为：对所述甲醇水溶液、所述磷酸盛格列汀参比溶液、所述分离度溶液和所述磷酸盛格列汀供试品溶液分别进行液相色谱检测。
[0068]
在本发明的一些实施方式中，所述液相色谱的条件包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相为二元流动相系统，其中，流动相a为乙腈，流动相b为ph值为5.0-6.0的0.015mol/l磷酸二氢钠水溶液；洗脱方式为梯度洗脱。
[0069]
在本发明的一些优选的实施方式中，所述色谱柱为agilent 5tc-c18(2) 4.6
×
250mm,5μm。
[0070]
在本发明的一些实施方式中，所述磷酸二氢钠水溶液的ph值为5.0、5.5、6.0或其他数值。
[0071]
在本发明的一些优选的实施方式中，所述磷酸二氢钠水溶液的ph值为5.5。
[0072]
在本发明的一些实施方式中，所述梯度洗脱的程序如下：0分钟时，流动相a与流动相b的体积比为（5-10）：（95-90）；40分钟时，流动相a与流动相b的体积比为（75-70）：（25-30）；43分钟时，流动相a与流动相b的体积比为75：25；45分钟时，流动相a与流动相b的体积比为（5-10）：（95-90）；50分钟时，流动相a与流动相b的体积比为（5-10）：（95-90）。
[0073]
在本发明的一些优选的实施方式中，所述梯度洗脱的程序如下：0分钟时，流动相a与流动相b的体积比为5：95；40分钟时，流动相a与流动相b的体积比为75：25；43分钟时，流动相a与流动相b的体积比为75：25；45分钟时，流动相a与流动相b的体积比为5：95；50分钟时，流动相a与流动相b的体积比为5：95。
[0074]
在本发明的一些实施方式中，所述液相色谱的条件还可以包括：柱温为40-50℃，例如，40℃、45℃、50℃或其他柱温；流动相的流速为0.9-1.1ml/min，例如，0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min或其他流速；进样体积为15-25μl，例如，15μl、20μl、25μl或其他体积。
[0075]
在本发明的一些优选的实施方式中，所述流动相的流速为1.0ml/min。
[0076]
在本发明的一些优选的实施方式中，所述柱温为45℃。
[0077]
在本发明的一些优选的实施方式中，所述进样体积为20μl。
[0078]
在本发明的一些实施方式中，所述液相色谱的条件还可以包括：检测波长为200-220nm，例如，200nm、210nm、220nm或其他波长。
[0079]
在本发明的一些优选的实施方式中，所述检测波长为210nm。
[0080]
在本发明的一些实施方式中，所述液相色谱检测的步骤还可以包括对所述杂质定位溶液进行液相色谱检测。
[0081]
在本发明的一些实施方式中，所述杂质计算的步骤为：以主成分对照法计算得出磷酸盛格列汀供试品中杂质相对于磷酸盛格列汀的含量。
[0082]
本发明还提供了在分离测定dpp-iv抑制剂有关物质的方法中用于配制分离度溶液的下列化合物或其药学上可接受的盐：
、和；其中，所述dpp-iv抑制剂为磷酸盛格列汀。
[0083]
本发明还提供了下列化合物或其药学上可接受的盐中的一种或多种在分离测定dpp-iv抑制剂有关物质的方法中用于配制分离度溶液的用途：、、、、、、和；其中，所述
dpp-iv抑制剂为磷酸盛格列汀。
[0084]
在本发明的一些实施方式中，所述药学上可接受的盐包括但不限于碱加成盐（例如钠盐、钾盐、铵盐、钙盐、镁盐、有机胺盐或类似的盐）、无机酸盐（例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、亚磷酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐等）、有机酸盐（例如乙酸盐、丙酸盐、异丁酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乳酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐等）等。
[0085]
以下将结合附图和具体实施例来进一步阐述本发明的技术方案。除非另有说明，下列实施例中所使用的仪器、耗材和试剂等均可通过常规商业手段获得。
[0086]
实施例1：系统适用性仪器：agilent1260；色谱柱：agilent 5tc-c18(2) 4.6
×
250mm，5μm，安捷伦科技(上海)有限公司；流速：1.0ml/min；柱温：45℃；进样体积：20μl；检测波长：210nm；流动相a：乙腈；流动相b：0.015mol/l磷酸二氢钠溶液（用氢氧化钠调节ph值至5.5）。流动相的梯度洗脱程序如表1所示：表1 梯度洗脱程序参比溶液(a)：称取磷酸盛格列汀，精密称定于容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，混匀，使得磷酸盛格列汀的浓度为1mg/ml。
[0087]
参比溶液(b)：准确移取参比溶液（a）到容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，使得磷酸盛格列汀浓度为10μg/ml。
[0088]
空白溶液(稀释液)：500ml甲醇溶解在500ml纯化水中配制。
[0089]
杂质储备溶液1：称取杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8，精密称定于容量瓶中，用甲醇溶解后稀释至刻度，使得杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8的浓度为300μg/ml。
[0090]
杂质储备溶液2：准确移取杂质储备溶液1到容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，混匀，使得杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8的浓度为15μg/ml。
[0091]
杂质定位溶液：准确移取杂质储备溶液2到容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，混匀，使得上述各杂质的浓度为1.5μg/ml。
[0092]
分离度溶液：称取磷酸盛格列汀，精密称定于容量瓶中，先加少量的稀释液溶解再加入杂质储备溶液2，用稀释液稀释至刻度，混匀，使得磷酸盛格列汀浓度为1mg/ml，杂质1、
杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8的浓度为1.5μg/ml。
[0093]
供试品溶液：用分离度溶液作为供试品溶液。
[0094]
杂质计算：以主成分对照法计算杂质的含量。
[0095]
杂质总和＝∑(已知杂质+未知杂质)。
[0096]
按照色谱条件分别进样空白溶液1针；参比溶液(b)6针；分离度溶液1针；供试品溶液1针，记录色谱过程。
[0097]
结果见表2，图谱见图1，2。
[0098]
表2 系统适用性结果：磷酸盛格列汀和各杂质之间的最小分离度为4.04(分离度≥1.5)，系统适用性良好。
[0099]
实施例2：专属性实验的条件，液相色谱方法和溶液的配制如实施例1。
[0100]
方法的专属性研究考察峰鉴别和选择性。分别进样空白溶液，杂质定位溶液和分离度溶液，记录色谱图。
[0101]
结果见表3，图谱见图1，2。
[0102]
表3 专属性分离度数据同系统适用性。
[0103]
结果：磷酸盛格列汀各杂质和主成分之间，各杂质之间都能达到良好的分离。
[0104]
实施例3：检测限和定量限实验的条件，液相色谱方法和溶液的配制如实施例1。
[0105]
对于已知的潜在杂质，检测限(lod)和定量限(loq)是根据信噪比法来确定的。把已知浓度的杂质储备溶液2稀释到最低浓度的试样，检测信噪比不低于s/n-10确定系统的loq，根据不低于s/n-3确定系统的lod。对未知杂质，用磷酸盛格列汀替代考察单个未知杂质的检测限和定量限。
[0106]
结果见表4，5。
[0107]
表4 各杂质检测限测定结果表5 各杂质定量限测定结果实施例4：线性和范围实验的条件，液相色谱方法和溶液的配制如实施例1。
[0108]
对已知杂质，在loq浓度至不低于150％指标浓度的范围内取5个浓度点进行研究。线性关系以测得的响应信号(峰面积)对被分析物浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归，至少报告相关系数r2来证实良好的线性关系，要求该线性回归系数r2的数值应在0.990-1.000。
[0109]
对未知杂质，用磷酸盛格列汀替代考察单个(未知)杂质的线性和范围。
[0110]
结果见表6，7，8，9，10，11，12，13，14。
[0111]
表6 杂质1线性测定结果
结果：杂质1对照品线性回归方程为y = 23.717x + 0.5017，r2＝0.9998，在0.051~2.693μg/ml范围内与其峰面积呈良好的线性关系。
[0112]
表7 未知杂质线性测定结果结果：未知杂质对照品线性回归方程为y = 27.795x + 0.6054，r2＝0.9999，在0.065~3.257μg/ml范围内与其峰面积呈良好的线性关系。
[0113]
表8 杂质2线性测定结果结果：杂质2对照品线性回归方程为y = 19.316x + 0.2227，r2＝0.9999，在0.068~2.968μg/ml范围内与其峰面积呈良好的线性关系。
[0114] 表9 杂质3线性测定结果
结果：杂质3对照品线性回归方程为y = 21.96x + 0.2656，r2＝0.9999，在0.060~2.622μg/ml范围内与其峰面积呈良好的线性关系。
[0115]
表10 杂质4线性测定结果结果：杂质4对照品线性回归方程为y = 44.91x + 0.4763，r2＝0.9999，在0.031~2.565μg/ml范围内与其峰面积呈良好的线性关系。
[0116]
表11 杂质5线性测定结果结果：杂质5对照品线性回归方程为y = 20.127x + 0.1974，r2＝0.9998，在0.081~3.048μg/ml范围内与其峰面积呈良好的线性关系。
[0117]
表12 杂质6线性测定结果
结果：杂质6对照品线性回归方程为y = 39.306x + 0.7407，r2＝0.9999，在0.038~3.020μg/ml范围内与其峰面积呈良好的线性关系。
[0118]
表13 杂质7线性测定结果结果：杂质7对照品线性回归方程为y = 35.512x
ꢀ‑ꢀ
0.102，r2＝0.9999，在0.044~3.546μg/ml范围内与其峰面积呈良好的线性关系。
[0119]
表14 杂质8线性测定结果结果：杂质8对照品线性回归方程为y = 32.443x + 0.41，r2＝0.9999，在0.048~3.010μg/ml范围内与其峰面积呈良好的线性关系。
[0120]
实施例5：精密度实验的条件，液相色谱方法和溶液的配制如实施例1。
[0121]
加标供试品溶液配制：取供试品约10mg，精密称定，置于10ml量瓶中，加稀释剂适量振摇使溶解，再精密量取杂质储备溶液2 1.0ml，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为加标供试品溶液。（各杂质浓度约为1.5μg/ml，占主成分的0.15%）。分别各重新称量配置6次加标供试品溶液，一针样品一针参比依次进样，按自身对照法计算。
[0122]
结果见表15。
[0123]
表15 各已知杂质的重复性试验结果中间精密度采用相同的操作方法，由不同人员在不同色谱系统下重复上述试验，结果见下表16。
[0124]
表16 各已知杂质中间精密度试验结果结果：由上述数据可知，本方法的精密度较高。
[0125]
实施例6：准确度实验的条件，液相色谱方法和溶液的配制如实施例1。
[0126]
准确度是通过在供试品中加入指标的80％，100％，120％三个不同浓度各杂质测的回收率所得。已知杂质的准确度是加入已知量的杂质，再测定加样样品中已知杂质的测定结果和理论值之间的比值(回收率)，以百分率％表达。
[0127]
结果见表17，18，19，20，21，22，23，24。
[0128]
表17 杂质1回收率测定结果
结果：杂质1的回收率在96.3%-99.4％之间，该方法具有较高的准确度。
[0129]
表18 杂质2回收率测定结果结果：杂质2的回收率在97.1%-100.7%之间，该方法具有较高的准确度。
[0130]
表19 杂质3回收率测定结果结果：杂质3的回收率在100.0%-102.9%之间，该方法具有较高的准确度。
[0131]
表20 杂质4回收率测定结果
结果：杂质4的回收率在99.0%-102.2%之间，该方法具有较高的准确度。
[0132]
表21 杂质5回收率测定结果结果：杂质5的回收率在91.1%-102.9%之间，该方法具有较高的准确度。
[0133]
表22 杂质6回收率测定结果结果：杂质6的回收率在98.3%-101.0%之间，该方法具有较高的准确度。
[0134]
表23 杂质7回收率测定结果
结果：杂质7的回收率在97.3%-101.1%之间，该方法具有较高的准确度。
[0135]
表24 杂质8回收率测定结果结果：杂质8的回收率在97.3%-100.4%之间，该方法具有较高的准确度。
[0136]
应用例：磷酸盛格列汀有关物质的分离测定（1）分离测定方法：配制供试品溶液：精密称定磷酸盛格列汀供试品，溶解于甲醇水溶液中并定容，得磷酸盛格列汀供试品溶液；在本应用例中，所述磷酸盛格列汀供试品（批号：第一批次，第二批次，第三批次）溶液中磷酸盛格列汀的浓度为1mg/ml；配制分离度溶液：精密称定磷酸盛格列汀供试品和杂质，溶解于甲醇水溶液中并定容，得分离度溶液；其中，所述杂质包含杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7和杂质8；在本应用例中，所述分离度溶液中的杂质为杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7和杂质8的组合，各杂质在所述分离度溶液中的浓度均为1.5μg/ml，所述分离度溶液中磷酸盛格列汀的浓度为1mg/ml；配制参比溶液：精密称定磷酸盛格列汀供试品，溶解于甲醇水溶液中并定容，或者，使用甲醇水溶液稀释所述磷酸盛格列汀供试品溶液，得磷酸盛格列汀参比溶液；其中，所述磷酸盛格列汀参比溶液中磷酸盛格列汀的浓度为所述磷酸盛格列汀供试品溶液中浓度的0.5%-2%；在本应用例中，使用甲醇水溶液稀释上述磷酸盛格列汀供试品溶液，使得所述磷酸盛格列汀参比溶液中磷酸盛格列汀的浓度为10μg/ml（即所述磷酸盛格列汀参比溶
液中磷酸盛格列汀的浓度为所述磷酸盛格列汀供试品溶液中浓度的1%）；在本应用例中，上述各步骤中使用的甲醇水溶液中的甲醇的体积百分比为50%；液相色谱检测：对所述甲醇水溶液、所述磷酸盛格列汀参比溶液、所述分离度溶液和所述磷酸盛格列汀供试品溶液分别进行液相色谱检测，所述液相色谱的条件包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相为二元流动相系统，其中，流动相a为乙腈，流动相b为ph值为5.0-6.0的0.015mol/l磷酸二氢钠水溶液；洗脱方式为梯度洗脱；在本应用例中，所述液相色谱的条件如实施例1中所述；杂质计算：以主成分对照法计算得出磷酸盛格列汀供试品中杂质相对于磷酸盛格列汀的含量。
[0137]
（2）分离测定结果：利用上述方法对实际生产的第一、第二和第三批次的磷酸盛格列汀供试品有关物质进行分离测定的结果如表25所示。其中“含量%”为利用主成分对照法计算得出的各批次供试品中各杂质的实际重量百分比。
[0138]
表25 磷酸盛格列汀供试品有关物质分离测定结果综上所述，本发明能够实现磷酸盛格列汀有关物质（既包括现有技术中已公开的化合物，还包括本发明中新发现的化合物）和主成分之间的有效分离，定性及定量检测磷酸盛格列汀有关物质（既包括现有技术中已公开的化合物，还包括本发明中新发现的化合物）情况，系统适用性良好，精密度和准确度较高，可用于磷酸盛格列汀原料药以及制剂有关物质的质量检测。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本发明既可直接应用于磷酸盛格列汀有关物质的实际检测，也可适当修改或变化后用于实际检测。
技术特征：1.一种分离测定dpp-iv抑制剂有关物质的方法，所述dpp-iv抑制剂为磷酸盛格列汀，其包括如下步骤：配制供试品溶液的步骤：精密称定磷酸盛格列汀供试品，溶解于甲醇水溶液中并定容，得磷酸盛格列汀供试品溶液；配制分离度溶液的步骤：精密称定磷酸盛格列汀供试品和杂质，溶解于甲醇水溶液中并定容，得分离度溶液；其中，所述杂质包含杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7和杂质8；配制参比溶液的步骤：精密称定磷酸盛格列汀供试品，溶解于甲醇水溶液中并定容，或者，使用甲醇水溶液稀释所述磷酸盛格列汀供试品溶液，得磷酸盛格列汀参比溶液；其中，所述磷酸盛格列汀参比溶液中磷酸盛格列汀的浓度为所述磷酸盛格列汀供试品溶液中浓度的0.5%-2%；液相色谱检测的步骤：对所述甲醇水溶液、所述磷酸盛格列汀参比溶液、所述分离度溶液和所述磷酸盛格列汀供试品溶液分别进行液相色谱检测，所述液相色谱的条件包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相为二元流动相系统，其中，流动相a为乙腈，流动相b为ph值为5.0-6.0的0.015mol/l磷酸二氢钠水溶液；洗脱方式为梯度洗脱；杂质计算的步骤：以主成分对照法计算得出磷酸盛格列汀供试品中杂质相对于磷酸盛格列汀的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸盛格列汀具有如下结构：；所述杂质1具有如下结构：；所述杂质2具有如下结构：；所述杂质3具有如下结构：
；所述杂质4具有如下结构：；所述杂质5具有如下结构：；所述杂质6具有如下结构：；所述杂质7具有如下结构：；所述杂质8具有如下结构：
。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序如下：0分钟时，流动相a与流动相b的体积比为（5-10）：（95-90）；40分钟时，流动相a与流动相b的体积比为（75-70）：（25-30）；43分钟时，流动相a与流动相b的体积比为75：25；45分钟时，流动相a与流动相b的体积比为（5-10）：（95-90）；50分钟时，流动相a与流动相b的体积比为（5-10）：（95-90）。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱的条件还包括：柱温为40-50℃；流速为0.9-1.1ml/min；进样体积为15-25μl。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱的条件还包括：检测波长为200-220nm。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸盛格列汀供试品溶液中磷酸盛格列汀的浓度为0.5-1.5mg/ml。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离度溶液中磷酸盛格列汀的浓度为0.5-1.5mg/ml，各杂质的浓度为1.0-2.0μg/ml。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分比为40%-60%。9.下列化合物或其药学上可接受的盐中的一种或多种在分离测定dpp-iv抑制剂有关物质的方法中用于配制分离度溶液的用途：、、、、、、
和；其中，所述dpp-iv抑制剂为磷酸盛格列汀。10.在分离测定dpp-iv抑制剂有关物质的方法中用于配制分离度溶液的下列化合物或其药学上可接受的盐：、和；其中，所述dpp-iv抑制剂为磷酸盛格列汀。
技术总结本发明属于药物分析检测领域，涉及一种分离测定DPP-IV抑制剂有关物质的方法，具体来说，涉及一种分离测定磷酸盛格列汀有关物质的方法。该方法包括如下步骤：配制供试品溶液的步骤、配制分离度溶液的步骤、配制参比溶液的步骤、液相色谱检测的步骤及杂质计算的步骤。本发明提供的方法能够实现磷酸盛格列汀有关物质（既包括现有技术中已公开的化合物，还包括本发明中新发现的化合物）和主成分之间的有效分离；能够定性及定量检测磷酸盛格列汀有关物质（既包括现有技术中已公开的化合物，还包括本发明中新发现的化合物）情况，有利于对磷酸盛格列汀的质量进行控制；且本发明提供的方法系统适用性良好，精密度和准确度较高。精密度和准确度较高。精密度和准确度较高。
技术研发人员：陈彬 张京宏 万清玉 丁炬平 余强 赵家宏
受保护的技术使用者：盛世泰科生物医药技术（苏州）有限公司
技术研发日：2022.07.21
技术公布日：2022/11/1
