一种过表达pigr蛋白的细胞系及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物技术和细胞学领域，具体涉及一种过表达pigr蛋白的细胞系及其制备方法和应用。
背景技术：2.多聚免疫球蛋白受体(pigr)是一种属于免疫球蛋白超家族的ⅰ型跨膜糖蛋白，在动物黏膜相关免疫组织中介导分泌型抗体iga和igm的跨上皮细胞转运，经酶切后分泌到黏膜表面发挥抑制病原微生物黏附和入侵的作用。哺乳动物的pigr分子由胞质区，胞外配体结合区和跨膜区三部分构成，其中胞外配体结合区含有5个免疫球蛋白样功能结构域(immunoglobulinlike domain，ild1-ild5)，其中，ild1、ild4和ild5的氨基酸序列在哺乳动物中高度保守。 ild1是与多聚免疫球蛋白(polymeric immunoglobulin,pig)结合的重要结构域。在其它脊椎动物中，ild的数量有所不同，如鸟类和两栖类的pigr分子胞外区含4个ild，分别对应哺乳动物的ild1、ld3、ild4和ild5，而鱼类pigr分子只发现有对应哺乳动物ild1和ild5 的两个免疫球蛋白样结构域。
3.相关技术中，pigr的免疫学功能研究目前主要集中在调节粘膜上皮细胞中pig的表达、配体与pigr的结合、pig的胞内转运和piga在病原体和抗原的细胞内中和作用、pig在表面裂解为sc以及上皮表面和外分泌物中游离sc和siga的新功能等方面。而在鱼类研究上则主要涉及pigr在细菌感染过程中的调控作用。研究发现，多种鱼类包括泥鳅、鲫鱼、鲤鱼、斑马鱼、草鱼以及大菱鲆等感染细菌后的pigr表达水平相较健康的鱼体具有显著性差异。虹鳟以及海鲈体内的pigr通过与其共生菌和病原菌相结合而发挥抑制病原菌增殖的作用，表明 pigr在维持微生物群落以及抵御黏膜表面病原菌入侵方面发挥着重要作用。pigr作为细胞表面受体在黏膜免疫过程发挥功能的同时也被部分病毒劫持作为细胞受体入侵细胞，如白斑综合症病毒、猪流行性腹泻病毒、鼠诺如病毒等。
4.相关技术中，pigr在水生动物中研究的报道还非常有限，关于水生动物pigr在抵抗病毒入侵过程中发挥的作用的研究，较为清晰的是日本囊对虾pigr(mjpigr)与白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,wssv)。wssv的vp24与mjpigr胞外部分结合后，mjpigr 的胞内部分则与钙调素作用募集网格蛋白和ap-2复合物促进wssv进入细胞完成自身增殖。这些结果证明pigr对病毒增殖具有重要的调控作用。
技术实现要素：5.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种过表达pigr蛋白的细胞系及其制备方法和应用，通过构建pigr过表达质粒并将其转染至罗非鱼脑细胞(tibc)中，从而得到了永生化过表达pigr蛋白细胞株tibc-pigr
+
。该细胞株易培养，增殖速度快，可无限扩大，性质稳定，易保存，方法技术成熟，重复性强，一般研究人员即可完成，具有遗传稳定性。
6.本发明的第一个方面，提供seq id no：4或seq id no：3所示的核酸分子在制备
pigr 过表达载体中的应用。
7.在本发明中，发明人基于pigr基因完整orf(seq id no：4)构建得到pigr过表达载体，并发现该载体能够稳定转染罗非鱼脑细胞(tibc)，从而得到过表达pigr蛋白的细胞系。
8.seq id no：4的具体核苷酸序列为：5
’‑
atgagagagttctgcaccagcttggctcg aactgacgagacctcctcgaccaatccaagtaaagacaaagtgagcatttttgatgacc cggcccaggagatgttcacagtgaccatgaacaacctgaaagagacgcagtctgggtg gtacttgtgtggtgtggaattaggtaacgggtggaaggccgatgatgttgcttacacta aagtgaaagtcattcacggtgtgtcagtcgtgaacagcatggtgagtggggaagaagg aagtagtgtcacggttcagtgcctttacagtgaaagattcagagaaagtgagaagaag tggtgtcggagcggaggctggagctcctgtctgtcgacgggttctgaagggagttacg aagatacttcagtggccatcagcgatgacagaactgggactttcactgtaaccttaaag aagctgcagatgagagatgctggctggtatttatgttctgcagggcagcagcaagtagc cgtacaggttcaggtcagaccacgcgcctctactacgacagagcctgtgacatccccac ctactccgagtcagtctgctgtgtacctccctccacccaaacccatcactaaggagtcct ggaacagtcaccgttacatgttggagtctatagcggtgtgttcgtctctcctgctccttg tgggcttggctgtattggcaagaaagttgtggatactgcacaaggaggattctgaactt agacactttaaggagatgaaagagagattccctgataatccatcgggcatgagtgacct gcaatatgttcctattgctttccataacaaagctaccatggacgtacgtgcttaccaggta ccgcgggcccgggatccaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggag-3’(seq i d no：4)。
9.本发明的第二个方面，提供一种pigr过表达载体，所述载体中含有seq id no：4所示的核酸分子。
10.在本发明中，发明人基于pigr基因完整orf(seq id no：4)构建得到pigr过表达载体，并发现该载体能够稳定转染罗非鱼脑细胞(tibc)，从而得到过表达pigr蛋白的细胞系。
11.在本发明的一些实施方式中，所述载体的核苷酸序列如seq id no：3所示。
12.在本发明中，发明人对构建得到pigr过表达载体进行测序，发现其序列如seq id no： 3所示。
13.本发明的第三个方面，提供本发明第二个方面所述的pigr过表达载体的制备方法，包括如下步骤：
14.pcr扩增pigr蛋白的cdna序列获得目的片段，并将其插入真核表达质粒中，即得。
15.在本发明的一些实施方式中，所述pcr扩增所用的引物的核苷酸序列如下所示：
16.上游引物pigr-f:5
’‑
ccgctcgagatgccgcgactctctatact-3’；
17.下游引物pigr-r:5
’‑
cggggtaccgtaagcacgtacgtcca-3’。
18.在本发明的一些实施方式中，所述引物是根据ncbi genbank(mk061423.1)数据库中的罗非鱼pigr核苷酸序列设计得到。
19.在本发明的一些实施方式中，所述cdna序列是基于tibc细胞总rna反转录得到。
20.在本发明的一些实施方式中，pigr过表达载体的制备方法具体为：pcr扩增pigr蛋白的cdna序列获得目的片段，使用限制性内切酶ecori和kpni对目的片段和空载体进行酶切，连接酶切后的目的片段和空载体，使用卡那霉素抗性平板进行筛选，即得pigr过表达载体。
21.在本发明的一些实施方式中，所述空载体为pegfp-n1载体。
22.本发明的第四个方面，提供本发明第二个方面所述的pigr过表达载体在制备过表达 pigr蛋白的产品中的应用。
23.在本发明中，发明人发现基于上述pigr过表达载体，在转染至细胞中后能够稳定表达 pigr，且表达量显著高于转染空载体的细胞。
24.本发明的第五个方面，提供一种永生化pigr过表达细胞株，所述细胞株于2022年6月 3日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学，分类学命名为罗非鱼多聚免疫球蛋白过表达脑细胞系tibc-pigr
+
，保藏编号为cctcc no:c2022162。
25.在制备过表达pigr蛋白细胞系的具体操作中，细胞摄取、整合、表达外源基因往往都是小概率事件，只有在特定的操作条件下才能提高这些小概率事件的发生；另外，外源基因整合到基因组中的概率小，而且是随机整合到基因组中的，故转染后的不同细胞表达的目的蛋白的量存在很大差异，且随着培养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少。而在本发明中，发明人通过特殊的构建方法有效的优化了传统方法中的技术缺陷，明显提高了基因重组细胞系的发生率，可获得许多高表达pigr蛋白的细胞；并且经过筛选和验证，本发明获得的超高表达pigr蛋白的细胞系的表达量是空载细胞的12.43倍，且经过多代的代培养仍具有超高效的过表达 pigr蛋白能力，且稳定性很好，是一株永久化过表达pigr蛋白的水生动物细胞系。
26.本发明的第六个方面，提供本发明第五个方面所述永生化pigr过表达细胞株的制备方法，包括如下步骤：
27.将本发明第二个方面所述的pigr过表达载体转染至罗非鱼脑细胞中，使用含抗生素的培养液进筛选培养，筛选得到的阳性克隆即为永生化pigr过表达细胞株。
28.在本发明的一些实施方式中，所述抗生素包括g418。
29.在本发明的一些实施方式中，所述制备方法具体为：
30.将汇合度为75％的罗非鱼脑细胞用hbss清洗后，加入gibco减血清培养基和本发明第二个方面所述的pigr过表达载体，混匀后培养5～7h，换入含血清的m199培养基，得到转染后的tibc细胞。使用含有g418l的m199培养基进行筛选，直至出现细胞克隆，即得。
31.本发明的第七个方面，提供本发明第五个方面所述永生化pigr过表达细胞株在如下(1) ～(4)中任意一项或多项中的应用；
32.(1)制备罗非鱼湖病毒载体或细胞模型；
33.(2)筛选和/或评价罗非鱼湖病毒治疗药物；
34.(3)制备罗非鱼湖病毒诊断产品；
35.(4)罗非鱼湖病毒产品开发。
36.发明人发现tilv感染tibc细胞时可引起pigr蛋白上调表达，并且细胞适应性好的tilv 毒株感染时诱导的pigr蛋白上调表达量更高，这说明tilv感染时pigr发挥着重要的作用。罗非鱼pigr过表达后也促进了tilv的增殖，那么过表达pigr蛋白的细胞系在罗非鱼湖病毒的培养中具有很好的应用前景，使用本发明中的过表达pigr蛋白的tibc细胞系培养罗非鱼湖病毒可显著影响病毒增殖滴度，这对罗非鱼湖病毒的高效培养及其灭活疫苗的生产意义重大。
37.本发明的有益效果是：
38.(1)本发明中构建得到的细胞系可永久化的高量表达pigr蛋白，且易培养，增殖速
度快，可无限扩大，性质稳定，易保存，方法技术成熟，重复性强，一般研究人员即可完成，具有遗传稳定性。
39.(2)本发明中的过表达pigr蛋白的细胞系及其制备方法具有深远的研究性和广泛的应用性，包括研究宿主细胞免疫反应具有稳定性以及可表达所需蛋白的水生动物细胞的永生化，以及细胞和pigr蛋白对罗非鱼湖病毒增殖的影响。
附图说明
40.图1为本发明实施例中的pcr扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道m为 dlmaker 5000，泳道1和2均为pigr的扩增产物。
41.图2为本发明实施例中的重组质粒鉴定结果，其中，a为重组质粒阳性克隆pcr鉴定结果，m：dna分子量标准marker，1-2：pegfp-pigr阳性克隆；b为重组质粒酶切验证结果， m：dna分子量标准marker，1：重组载体pegfp-pigr，2：pegfp-n1空载体；c为wb 检测结果，m：蛋白分子量标准marker，1：转染pegfp-pigr细胞，2：转染pegfp-n1空载细胞，3：tibc无转染细胞。
42.图3为本发明实施例中转染后的tibc细胞荧光图，a为转染pegfp-n1空载的细胞，b 为转染pegfp-pigr的细胞。
43.图4为本发明实施例中经g418筛选获得过表达细胞系图像，其中，a为g418筛选 pegfp-n1空载转染细胞明场；b为g418筛选pegfp-n1空载转染细胞荧光图；c为g418 筛选pegfp-pigr转染细胞明场；d为g418筛选pegfp-pigr转染细胞荧光图。
44.图5为本发明实施例中tibc-pigr+连续传代后荧光图，a为传代1次荧光图；b为传代 3次荧光图；c为传代5次荧光图；d为传代10次荧光图。
45.图6为pigr过表达对tilv增殖的影响，其中，a为tilv s8基因表达水平对比图；b 为tilv s10基因表达水平对比图；c为tilv拷贝数对比图。
46.图7为过表达pigr细胞和空载细胞在tilv感染48h蛋白水平变化对比。
47.图8为过表达pigr细胞和空载细胞在tilv感染48h后的ifa结果对比。
具体实施方式
48.为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
49.所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
50.重组pmd18t-onpigr克隆载体的构建和测序
51.(1)寡核苷酸引物的设计与合成：
52.根据ncbi genbank(mk061423.1)数据库中的罗非鱼pigr核苷酸序列设计得到罗非鱼 pigr特异性引物，引物的具体核苷酸序列为：
53.上游引物pigr-f:5
’‑
ccgctcgag atgccgcgactctctatact-3’(seq id no：1)；
54.下游引物pigr-r:5
’‑
cggggtaccgtaagcacgtacgtcca-3’(seq id no：2)。
55.使用上述引物作为pcr扩增引物，用于获得目的片段。
56.(2)tibc细胞总rna的提取：
57.取100代的永生化tibc细胞(罗非鱼脑细胞，tilapia brain cell)接种于底面积为25cm2细胞培养瓶，培养24h后，加1ml trizol，室温放置5min，使其充分裂解。12 000r/min离心5min，取上清。按200μl氯仿/ml trizol的量加入氯仿，振荡混匀室温放置15min。4℃条件下12 000r/min离心15min。吸取上清至另一离心管中，按0.5ml异丙醇/ml trizol的量加入异丙醇混匀，室温放置5～10min。4℃条件下12 000r/min离心10min，弃上清，rna沉于管底。
58.按1ml 75％乙醇/ml trizol的量向管中加入75％乙醇，温和振荡离心管，4℃条件下12 000r/min离心10min。弃上清，室温干燥。加入20μl rnase-free水溶解，－80℃保存备用。
59.(3)pigr基因片段全长cdna合成：
60.取5μl步骤(2)中获得的总rna，70℃加热10min，冰浴5min。按照表1所示反应体系加入其他反应试剂。其中，上游引物f、下游引物r分别为上游引物pigr-f和下游引物 pigr-r。
61.表1反转录体系
62.组分含量200u反转录酶m-mlv1μl25pmol/μl上游引物f1μl25pmol/μl下游引物r1μl10mmol/l dntps1μl步骤(2)中获得的总rna5μlddh2o1μl
63.42℃反应60min，得到cdna(反转录产物)。70℃水浴10min，灭活反转录酶。
64.取10μl制备得到的cdna，按照表2所示构建pcr扩增体系。其中，下述pcr buffer 购自南京诺唯赞科技股份有限公司。
65.表2 pcr扩增体系
66.组分含量10
×
pcr buffer4μl25mmol/l mgcl24μl25pmol/μl上游引物pigr-f0.5μl25pmol/μl下游引物pigr-r0.5μl10mmol/l dntps0.5μlcdna模板10μlddh2o30μl
67.煮沸变性10min，冰浴5min。然后加入0.25μl taqplus dna聚合酶(5u/μl)混匀。然后进行下述反应程序：94℃变性30sec，57℃退火40sec、72℃延伸90sec，25个循环；72℃再延伸10min。pcr产物通过1％琼脂糖凝胶进行核酸电泳验证。
68.结果如图1所示。
69.1％琼脂糖凝胶电泳显示出与预期大小相符合的约1023bp的目的条带。进一步将
其纯化后送至生物公司进行测序，测序结果经blast搜索比对发现与ncbi数据库中的罗非鱼pigr 序列相似度为100％，因此，可以确定扩增的片段为罗非鱼的pigr orf(onpigr)序列。
70.(4)真核表达载体pegfp-pigr的构建：
71.使用限制性内切酶ecori和kpni对(3)扩增获得的onpigr基因以及pegfp-n1载体进行酶切，酶切体系如表3所示。其中，下述酶切buffer购自南京诺唯赞科技股份有限公司。反应条件为：37℃反应1h。得到酶切后的pegfp-n1载体和酶切后的pigr基因片段。
72.表3酶切体系
73.组分含量10
×
酶切buffer5μlecorⅰ/kpnⅰ5μl载体/基因片段2μg无酶水补足至50μl
74.然后基于市售试剂盒操作说明，使用thermo fisher的t4连接酶对酶切产物进行连接，具体反应体系如下：
75.表4连接体系
[0076][0077][0078]
反应条件为：22℃反应10min。得到连接产物。
[0079]
将连接产物转化到e.coli dh5α细胞中。具体操作步骤为：从-80℃低温冰箱中取出dh5α感受态细胞，放置于冰中待其融化，加入连接产物，混匀后于冰上静置25分钟。42℃水浴 60秒，迅速放回冰上静置2分钟，避免晃动降低转化效率。加入700ml无抗lb肉汤培养基，放入摇床中37℃，200rpm复苏1h。4000-5000rpm离心1min。吸取上清，仅留下约100 ml左右的培养基，吹打混匀后涂布到卡那霉素抗性平板上，37℃培养过夜。挑取单克隆菌落进行菌液pcr扩增。
[0080]
反应体系如表5所示。
[0081]
表5菌液pcr体系
[0082]
组分含量pigr-f2μlpigr-r2μlpremix taq
tm
2μl
单克隆菌菌液2μl无酶水12μl
[0083]
反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环； 72℃终延伸10min。4℃保存备用。
[0084]
菌液pcr结果显示扩增片段大小为1023bp左右，与预期结果一致，将扩增产物送至生物公司进行测序，确认含有正确的pigr基因。将确认无误的菌液提取质粒后进行双酶切验证，使用1％琼脂糖凝胶电泳显示在5000bp和1000bp附近出现特异性目的条带，western blot 结果显示转染pegfp-pigr在55kda～70kda的位置出现与预期大小相符的融合蛋白条带(图 2)，进一步表明重组真核表达质粒pegfp-pigr可以在细胞内正确表达出目的蛋白。表明含 pigr基因的重组质粒构建成功。
[0085]
其中，测序得到pegfp-pigr重组质粒序列如下(下划线位置是pigr基因完整orf)：
[0086]5’‑
tagtgtcctggagggtggatccatcactgtcccgtgtcgatatgaccctaagtat gctaaccatgtcaaatactggtgtagtgggagcatgagagagttctgcaccagcttggctcgaactgacgagacctcctcgaccaatccaagtaaagacaaagtgagcatttttgatgacccggcccaggagatgttcacagtgaccatgaacaacctgaaagagacgcagtctgggtggtacttgtgtggtgtggaattaggtaacgggtggaaggccgatgatgttgcttacactaaagtgaaagtcattcacggtgtgtcagtcgtgaacagcatggtgagtggggaagaaggaagtagtgtcacggttcagtgcctttacagtgaaagattcagagaaagtgagaagaagtggtgtcggagcggaggctggagctcctgtctgtcgacgggttctgaagggagttacgaagatacttcagtggccatcagcgatgacagaactgggactttcactgtaaccttaaagaagctgcagatgagagatgctggctggtatttatgttctgcagggcagcagcaagtagccgtacaggttcaggtcagaccacgcgcctctactacgacagagcctgtgacatccccacctactccgagtcagtctgctgtgtacctccctccacccaaacccatcactaaggagtcctggaacagtcaccgttacatgttggagtctatagcggtgtgttcgtctctcctgctccttgtgggcttggctgtattggcaagaaagttgtggatactgcacaaggaggattctgaacttagacactttaaggagatgaaagagagattccctgataatccatcgggcatgagtgacctgcaatatgttcctattgctttccataacaaagctaccatggacgtacgtgcttaccaggtaccgcgggcccgggatccaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggag-3
’ꢀ
(seq id no：3)。
[0087]
过表达pigr蛋白的细胞系的建立
[0088]
(1)重组质粒pegfp-pigr的提取：
[0089]
取上述实施例获得的阳性菌液，使用无内毒素的质粒提取试剂盒(omega公司)提取重组质粒pegfp-pigr，具体步骤如下：
[0090]
将阳性菌液按照1：100的比例加入到配置好的卡那霉素抗性的lb培养基中，37℃，200 rmp/min培养12h。室温条件下4000
×
g离心10min，收集菌体。弃去培养基留下菌体沉淀，加入10ml的solution i(来自上述质粒提取试剂盒)，涡旋，使沉淀菌体彻底悬浮。加入10 ml的solutionⅱ，盖紧离心管盖后，轻柔地颠倒混匀后，室温静置2-3分钟(不超过5分钟)，以获得澄清的细胞裂解液。将5ml冰上预冷的n3 buffer加至细胞裂解液中，混匀直至白色絮状沉淀形成，室温孵育2分钟(需确保溶液完全中和)。使用针筒过滤器进行过滤。滤液中加入0.1倍体积的etr solution，冰上孵育10分钟。水浴5分钟后，室温4000
×
g离心5min。将上清液转移到新的离心管中，加入二分之一体积的无水乙醇，混匀后室温孵育2分钟。转移到结合柱中，4000
×
g离心3min。弃掉滤液，直至所有的混合液全部结合到柱子上。向结合柱中加入10ml的hbc buffer(按照说明书使用要求事先加入异丙醇稀释)，4000
×g离心3min。弃滤液，吸取15ml dna wash buffer加入到结合柱中，4000
×
g离心3min。弃滤液，使用dnawash buffer重复洗涤1次。离心去滤液。6000
×
g，结合柱空离心10min，甩干结合柱基膜。将结合柱转移到新的50ml离心管中。向结合柱基膜中央加入1ml的endo-free elution buffer，室温静置5分钟。4000
×
g离心5min，洗脱质粒。
[0091]
(2)pegfp-pigr真核表达载体转染永生化tibc细胞：
[0092]
a.转染细胞的准备：在27℃、5％co2条件下在六孔细胞培养板中培养100代的永生化 tibc细胞12-18h，待细胞汇合度为75％时，开始转染。
[0093]
b.脂质体/dna复合物的制备：将六孔板平均分为两组，参照lipofectamine2000说明书，其中一组每孔转染2g的pegfp-n1空载(pegfp-n1经苯酚/氯仿反复抽提纯化，紫外分光光度计测其od260/od280为1.8～2.0，使用前经过过滤除菌)，另一组则相应的每孔转染2g的上述实施例中得到的重组真核表达载体pegfp-pigr。轻微震荡，使质粒与转染试剂充分混匀，室温放置25min，获得脂质体/dna复合物，此时如果溶液浑浊，不影响转染。但如果出现沉淀，则停止转染，重新制备。
[0094]
c.将步骤a中汇合度为75％的细胞用hbss清洗3次，然后每孔加入1.5ml gibco减血清培养基。然后加入步骤b中得到的dna/脂质体混合物，轻晃摇匀，27℃，5％co2饱和湿度培养6h后，换入含5％(v/v)血清的m199培养基，得到转染后的tibc细胞。
[0095]
(2)g418抗性细胞的筛选：
[0096]
将转染后的tibc细胞在27℃，5％co2培养36小时。在荧光显微镜下观察荧光情况(如图3所示)。当可见较强荧光时，加入含有1000g/ml浓度g418l的m199培养基继续培养，每三天换一次液，直至出现细胞克隆。
[0097]
(3)获得永生化过表达pigr蛋白的细胞系：
[0098]
每孔加入含5％血清的m199培养基，将长出细胞克隆的孔在灯光下观察，可见单个细胞克隆呈明显的不透明状，用记号笔画圈标记克隆的位置，在超净工作台上用无菌枪头挑取细胞克隆。打入96孔板，进行极限稀释法，依次传入24孔板，6孔板，30ml细胞培养瓶，50ml 细胞培养瓶，逐步扩大培养，扩大培养时，保持g418的浓度，血清添加量为5％(v/v)。经 g418筛选后即得永生化过表达pigr蛋白的细胞系，命名为tibc-pigr
+
(图4)。
[0099]
构建得到的永生化过表达pigr蛋白的细胞于2022年6月3日保藏于中国典型培养物保藏中心cctcc，保藏编号c2022162。
[0100]
(4)永生化验证：
[0101]
将上述步骤获得的tibc-pigr+连续传代10代，仍可见较强绿色荧光(图5)，说明永生化过表达细胞系构建成功。
[0102]
过表达pigr蛋白的细胞系对tilv增殖的促进作用
[0103]
将100代的永生化的tibc细胞于转染前24h接种到底面积为25cm2的6个细胞培养瓶中，平均分为2组。一组转染50mg的pegfp-n1空载质粒，另一组转染50mg的上述 pegfp-pigr过表达重组质粒，每组设置三个平行。在转染后的36h时弃掉培养液，用hbss 清洗两遍，分别加入105copies/ul的tilv病毒液各1ml，在28℃的培养箱中孵育1.5h。离心弃去病毒液，补加5ml的含5％fbs的m199培养基，28℃培养箱中培养48h和72h。收样。采用上述实施例中的方法提取rna，制备cdna。并分别对tilv-s1基因，tilv-s8 和tilv-s10基因进行定量检测。其中，检测使用艾科瑞生物工程有限公司荧光定量试剂盒进行。
[0104]
结果如图6所示。
[0105]
与作为对照组的转染空载体的细胞相比，在转染了过表达pigr重组质粒的细胞中，tilv 感染后48h和72h的s8和s10片段的mrna水平均明显上调，拷贝数也显著增多。在过表达72h后，pigr过表达细胞系中tilv增殖量为8.08
×
107copies/ul，转染空载质粒细胞系中 tilv增殖量为6.5
×
106copies/ul，过表达细胞系中病毒增殖量是空载细胞系的12.43倍。
[0106]
同时，收集部分细胞进行wb(western blot)以及ifa(间接免疫荧光)检测，在蛋白水平上研究过表达pigr对tilv增殖的影响。
[0107]
wb检测的操作步骤如下：
[0108]
按照使用说明配制10％的下层分离胶和上层浓缩胶，将制好的蛋白凝胶置于电泳槽中，加入sds-page电泳液，去掉梳子，吸取5μl的thermo26616预染蛋白marker，然后加入20μl蛋白样至加样孔中。80v恒定电压电泳20min，待蛋白条带在浓缩胶中在同一水平线后，将电压转为120v继续电泳，等到溴酚蓝指示条带到达分离胶底部，结束电泳进行转膜。蛋白样经过sds-page电泳分离后，通过转膜仪转到硝酸纤维素膜(nc膜)上。取出 nc膜做好相应标记。用5％的脱脂奶将nc膜于室温下封闭1h，然后将gfp标签的兔抗按照1：4000比例稀释后作为一抗室温孵育2h。用pbst洗涤3次，每次10min，加入二抗(1： 4000稀释)室温孵育2h。pbst洗涤3次，10min/次。然后使用超敏ecl化学发光试剂盒显色(新赛美生物技术有限公司)，操作参考使用手册。在chemidoctmxrs+成像仪获取图像。
[0109]
western blot结果如图7所示。
[0110]
可以发现，与对照组相比，过表达细胞系中的pigr蛋白具有较明显的过表达现象，说明上述方法能够成功构建得到永生化过表达pigr蛋白的细胞系。
[0111]
ifa检测的操作步骤如下：
[0112]
使用-20℃预冷的甲醛固定细胞10min，晾干15min。pbs清洗两遍，使用5％的马血清室温封闭1h。pbs清洗两次。使用按照1：500比例稀释的抗tilv-s8片段的单克隆抗体作为一抗，室温孵育1h。弃掉孵育的一抗，使用pbst清洗3次，每次10min，使用按照1：2000比例稀释的alexa fluor 488标记的羊抗鼠抗体作为二抗，室温孵育2h。pbst清洗3次，每次10min，加入dapi染色液染色10min。激光共聚焦观察拍照记录。
[0113]
结果如图8所示。
[0114]
可以发现，pigr过表达组中，48h时tilv的红色阳性信号显著多于对照组。
[0115]
综上所述，从上述试验结果中可以表明pigr过表达能够促进tilv的增殖。在常规技术中，要获得超高表达pigr蛋白的细胞系的概率是非常低的，因为外源基因进入细胞后，仅有部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源dna得到瞬时表达。而且极少数情况下，进入细胞的外源dna通过系列非同源性分子间重组核连接，最终整合进细胞染色体，细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。此外，随着培养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少。综合来说，由于摄取、整合、表达外源基因都是小概率事件，所以获得高表达pigr蛋白的细胞系更是小概率事件，而本发明实施例中的方法能够稳定获得pigr过表达细胞系，从而实现技术的突破。
[0116]
过表达pigr蛋白的细胞系的应用
[0117]
虽然目前pigr在水生动物病毒感染过程中发挥的作用的研究较少，目前较为清晰的是日本囊对虾pigr(mjpigr)与白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,wssv)。wssv 可通过与mjpigr结合后通过网格蛋白介导的内吞方式进入细胞完成自身增殖。然而这些结果也已证明pigr对病毒增殖具有重要的调控作用。
[0118]
在发明人的前期研究中，发现本发明中的tilv感染永生化tibc细胞可引起pigr蛋白上调表达，并且细胞适应性好的tilv毒株感染时诱导的pigr蛋白上调表达量更高，这说明 tilv感染时pigr发挥着关键的调节作用。罗非鱼pigr过表达后也促进了tilv的增殖，那么过表达pigr蛋白的细胞系在罗非鱼湖病毒的培养中具有很好的应用前景，使用本发明实施例中构建得到的过表达pigr蛋白的tibc细胞系培养罗非鱼湖病毒可显著影响病毒增殖滴度，这对罗非鱼湖病毒的高效培养及其灭活疫苗的生产意义重大。
[0119]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.seq id no：4或seq id no：3所示的核酸分子在制备pigr过表达载体中的应用。2.一种pigr过表达载体，其特征在于，所述载体中含有seq id no：4所示的核酸分子。3.根据权利要求2所述的过表达载体，其特征在于，所述载体的核苷酸序列如seq id no：3所示。4.权利要求2～3任一项所述的pigr过表达载体的制备方法，包括如下步骤：pcr扩增pigr蛋白的cdna序列获得目的片段，并将其插入真核表达质粒中，即得。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述pcr扩增所用的引物的核苷酸序列如下所示：上游引物pigr-f:5
’‑
ccgctcgag atgccgcgactctctatact-3’；下游引物pigr-r:5
’‑
cggggtaccgtaagcacgtacgtcca-3’。6.权利要求2～3任一项所述的pigr过表达载体在制备过表达pigr蛋白的产品中的应用。7.一种永生化pigr过表达细胞株，其特征在于，所述细胞株于2022年6月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，罗非鱼多聚免疫球蛋白过表达脑细胞系tibc-pigr
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，保藏编号为c2022162。8.权利要求7所述永生化pigr过表达细胞株的制备方法，包括如下步骤：将权利要求2～3任一项所述的pigr过表达载体转染至罗非鱼脑细胞中，使用含抗生素的培养液进筛选培养，筛选得到的阳性克隆即为永生化pigr过表达细胞株。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述抗生素包括g418。10.权利要求7所述的永生化pigr过表达细胞株在如下(1)～(4)中任意一项或多项中的应用；(1)制备罗非鱼湖病毒载体或细胞模型；(2)筛选和/或评价罗非鱼湖病毒治疗药物；(3)制备罗非鱼湖病毒诊断产品；(4)罗非鱼湖病毒产品开发。
技术总结本发明公开了一种过表达PIGR蛋白的细胞系及其制备方法和应用，所述过表达PIGR蛋白的细胞系分类学命名为罗非鱼多聚免疫球蛋白过表达脑细胞系TiBC-PIGR
技术研发人员：王英英 王庆 李波 郑树城 尹纪元 李莹莹 莫绪兵 石存斌
受保护的技术使用者：中国水产科学研究院珠江水产研究所
技术研发日：2022.06.24
技术公布日：2022/11/1
