1.本发明涉及纳米材料和纳米生物医药领域，具体涉及一种基于载药囊泡的突破血脑屏障组合物及其应用。
背景技术：2.血脑屏障(bbb)是指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障，这些屏障能够阻止某些物质(多半是有害的)由血液进入脑组织。血液中多种溶质从脑毛细血管进入脑组织，有难有易；有些很快通过，有些较慢，有些则完全不能通过，这种有选择性的通透现象使人们设想可能有限制溶质透过的某种结构存在，这种结构可使脑组织少受甚至不受循环血液中有害物质的损害，从而保持脑组织内环境的基本稳定，对维持中枢神经系统正常生理状态具有重要的生物学意义。
3.脑胶质瘤是由于大脑和脊髓胶质细胞癌变所产生的、最常见的原发性颅脑肿瘤。年发病率约为3-8人/10万人口。如同其他肿瘤(疾病)一样，胶质瘤也是由于先天的遗传高危因素和环境的致癌因素相互作用所导致的。一些已知的遗传疾病，例如神经纤维瘤病(i型)以及结核性硬化疾病等，为脑胶质瘤的遗传易感因素。目前，化疗是脑胶质瘤的重要辅助治疗手段，但疗效不佳，这主要与药物通过脑组织所特有的血脑屏障(bbb)受限有关，大分子化疗药物很难通过bbb进入颅脑内肿瘤部位。为了解决这些限制，亟需开发出可以有效通过血脑屏障进入颅脑中肿瘤部位，对肿瘤进行有效杀伤的生物材料。
技术实现要素：4.为解决上述技术问题，本发明提出了一种基于载药囊泡的突破血脑屏障组合物及其应用，其目的是为了构建一种可以有效通过血脑屏障(bbb)进入颅脑内，并能主动高效靶向颅脑内肿瘤细胞的组合物，该组合物具有较高生物安全性，防止发生颅脑内感染。
5.为了实现上述目的，本发明提供了一种基于载药囊泡的突破血脑屏障组合物，包括载药囊泡纳米粒和减毒沙门氏菌，所述载药囊泡纳米粒是由细菌外膜囊泡和多柔比星通过自组装形成的球形纳米粒。
6.作为优选，所述组合物的使用方法为：先注射所述减毒沙门氏菌，24～48h后再注射所述载药囊泡纳米粒。
7.作为优选，所述细菌纳米囊泡为革兰氏阴性菌自然释放的纳米级蛋白脂质体。
8.作为优选，所述革兰氏阴性菌为沙门氏菌。
9.作为优选，所述细菌外膜囊泡和多柔比星的质量比为1:1。
10.作为优选，所述载药囊泡纳米粒的制备包括以下步骤：
11.s1、革兰阴氏细菌接种培养，超速离心收集革兰阴氏细菌分泌的细菌外膜囊泡；
12.s2、将步骤s1中获得的细菌外膜囊泡与多柔比星在pbs缓冲液中室温下混合孵育4h；
13.s3、将步骤s2中的混合孵育液使用100kda的超滤管去除空载的多柔比星，然后将得到的纳米粒用pbs缓冲液洗涤，即得载药囊泡纳米粒。
14.作为优选，所述步骤s2中混合孵育时间为4～6h。
15.作为优选，所述步骤s3中超滤管为100kda。
16.基于一个总的发明构思，本发明还提供了一种基于载药囊泡的突破血脑屏障组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
17.作为优选，所述肿瘤为脑胶质瘤。
18.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
19.1、本发明提供的基于载药囊泡的突破血脑屏障组合物，该组合物基于沙门氏菌的肿瘤归巢策略，通过设计的载药囊泡纳米粒与中性粒细胞结合有效通过血脑屏障(bbb)并对脑胶质瘤进行靶向治疗。本发明的基于载药囊泡的突破血脑屏障组合物联合使用，先通过减毒沙门氏菌定植在颅内肿瘤位置；然后载药囊泡纳米粒进入体内，会在tlr4的介导下内化到中性粒细胞中；由于中性粒细胞可以被减毒沙门氏菌选择性的识别，因此携带有载药囊泡纳米粒的中性粒细胞在定植于颅内肿瘤部位的减毒沙门氏菌的招募作用下，被选择性识别从而通过血脑屏障，靶向到定植于颅内肿瘤周围的沙门氏菌，载药囊泡纳米粒以“顺风车”的形式实现通过血脑屏障并靶向到达颅内肿瘤周围；载药囊泡纳米粒在肿瘤微酸性环境释放出多柔比星，对肿瘤进行杀伤，同时可以清除定植的沙门氏菌，防止沙门氏菌感染。
20.2、本发明提供的载药囊泡纳米粒，通过革兰氏阴性菌(沙门氏菌)分泌的细菌外膜囊泡(omvs)包载药物多柔比星(dox)形成纳米粒，该纳米粒为球形结构，粒径为100-200nm，电位ζ为-5～-10mv；本发明设计的载药囊泡纳米粒，omvs可以凭借天然沙门氏菌的表面病原体相关分子模式被中性粒细胞选择性识别，从而促进大分子化疗药物dox通过bbb及对神经胶质瘤靶向递送药物，与经典的被动靶向作用相比，肿瘤积聚显著增强18倍；同时，dox具有抗菌活性，可以清除定植的沙门氏菌，将沙门氏菌潜在的感染风险降至最低。
21.3、本发明提供的载药囊泡纳米粒，omvs和dox通过自组装的方式形成球形纳米粒，其制备过程简单可控，有效避免了对其他正常组织的毒副作用，载药量高；该纳米粒是纯药纳米粒，操作简单，载药量高且不经任何修饰被中性粒细胞的靶向识别纳米粒，并有效通过bbb。
22.4、本发明提供了基于载药囊泡的突破血脑屏障组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，载药囊泡纳米粒在减毒沙门氏菌的配合下，可靶向富集于肿瘤病灶部位，生物安全性高，对于脑部肿瘤的治疗具有重要应用前景。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1为本发明实验例1中omvs和omvs/dox的粒径变化图；
25.图2为本发明实验例1中omvs和omvs/dox的电位变化图；
26.图3为本发明实验例1中omvs/dox的透射电镜图；
27.图4为本发明实验例1中omvs和omvs/dox的荧光光谱图；
28.图5为本发明实验例1中omvs和omvs/dox在不同条件下释放曲线图；
29.图6为本发明实验例2中omvs/dox纳米粒对中性粒细胞靶向作用结果图；
30.图7为本发明实验例3中沙门氏菌在体内的动态荧光分布以及omvs/dox纳米粒在脑组织的分布研究，其中图7a为沙门氏菌在小鼠体内的动态荧光分布图；图7b为不同制剂的纳米粒在小鼠体内的动态荧光分布图；
31.图8为本发明实验例4中分别注射各种制剂后的肿瘤体积大小分布结果；
32.图9为本发明实验例4中为分别注射各种制剂后的裸鼠生存率曲线。
具体实施方式
33.为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
34.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
35.若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
36.以下实施例中，所采用的仪器及生产厂家的详细信息参见表1：
37.表1主要仪器名称及生产厂家
[0038][0039]
以下实施例中，所采用的主要试剂名称及生产厂家参见表2：
[0040]
表2主要试剂名称及生产厂家
[0041]
试剂名称生产厂家多柔比星(dox)上海易恩化学技术有限公司甲醇国药集团化学试剂有限公司pbs北京鼎国昌盛生物制品有限公司青链霉素混合液(100
×
双抗)北京索莱宝科技有限公司胰酶北京索莱宝科技有限公司胎牛血清美国gibco公司
dmem培养基美国gibco公司4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)美国sigma公司四甲基偶氮唑蓝(mtt)美国sigma公司
[0042]
实施例1
[0043]
omvs的提取
[0044]
本实施例提供了一种omvs的提取方法，包括如下步骤：
[0045]
将沙门氏菌接种到灭菌的lb培养基中，并在37℃下以200rpm振摇培养过夜。
[0046]
将培养基离心(4℃，5000rpm)10min获得上清液，使用0.22mm过滤器过滤以去除母体沙门氏菌碎片和其他污染物。
[0047]
然后使用100kda超滤管(millipore amicon)浓缩上清液并用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤两次以获得粗omvs。
[0048]
通过使用密度梯度离心2小时(4℃，200000g)的超速离心获得纯化的omvs，并在-80℃下储存。
[0049]
实施例2
[0050]
制备载药囊泡纳米粒omvs/dox
[0051]
本实施例提供一种纯药纳米粒omvs/dox的制备方法，包括如下步骤：
[0052]
将dox和omvs以相同的质量比在pbs缓冲液中轻轻混合，然后在37℃孵育4h。使用100kda的超滤管去除空载的dox，然后将得到的纳米粒用pbs洗涤数次，即得载药囊泡纳米粒omvs/dox。
[0053]
实验例1
[0054]
对实施例1和实施例2的纳米粒进行如下检测：
[0055]
一、粒径与电位：分别检测omvs，omvs/dox粒径与电位，测量方法为：取样品溶液置于marlven nano zs仪器，采用动态光激光散射法(dls)检测粒径，测定池温度设定为25℃，每个样品平行操作3份。图1和图2为omvs，omvs/dox的粒径及电位变化图，从图的结果可知：omvs粒径为93.99nm，电位ζ为-9.72mv，而omvs/dox纳米粒粒径增至122.8nm，电位升至-7.05mv。
[0056]
二、形态：观察omvs/dox的形态，形态的检测方法：样品滴加在覆盖碳膜的400目铜网上，置于干燥器中，待其自然干燥后置于透射电镜titan g2-f20下观察。图3为omvs/dox的透射电镜图，由图3可知：本发明的omvs/dox在透射电子显微镜下为球形结构。
[0057]
三、荧光光谱：对omvs/dox进行荧光光谱扫描。图4为omvs/dox的荧光光谱。从图4中可知dox成功的被omv包裹形成omvs/dox纳米粒。
[0058]
四、释放率检测：将omvs/dox取1ml至于截留分子量为3500的透析袋中，将装有纳米粒的透析袋分别置于装有释放介质的50ml离心管中，释放介质分别为：ph 7.4、ph 5.0。分别于0.5、1、2、4、8、12、24、36、48，60h取出透析袋的溶液，在590nm处测定吸光度a，以未进行释放的纳米粒的吸光度为a0，累计释放率＝(1-a/a0)
×
100。图5为omvs/dox在不同条件下释放曲线图。结果表明酸性可以促进omvs/dox中的药物释放。
[0059]
实验例2
[0060]
考察实施例2的omvs/dox纳米粒对中性粒细胞靶向作用：
[0061]
将中性粒细胞消化计数，适量1640完全培养基稀释至1.0
×
105个/皿的细胞悬液
接种在共聚焦培养皿中。
[0062]
用anti-tlr4预处理1h后，与dox或omvs/dox 37℃孵育1h后吸弃培基，然后用pbs洗涤3次。
[0063]
细胞用4％多聚甲醛固定20分钟，细胞核用dapi(1μg/ml)染色10分钟，然后使用共聚焦激光扫描显微镜(clsm)进行可视化。
[0064]
dapi通道表明细胞核染为蓝色荧光，dox为红色荧光，merged表明叠加dapi和dox。标尺＝20μm。
[0065]
图6为omvs/dox纳米粒对中性粒细胞靶向作用。从图6中可知：dox及omvs/dox与中性粒细胞孵育1h，荧光显微镜下可见omvs/dox组在中性粒细胞的胞质内有明显的红色荧光，表明omvs/dox纳米粒能被中性粒细胞摄取。有趣的是经anti-tlr4预处理的omvs/dox组荧光较omvs/dox孔明显减弱，而dox组经anti-tlr4预处理后红色荧光几乎没有改变，这表明omvs/dox纳米粒的摄取很大程度上需要tlr4的介导。相比之下，游离dox在中性粒细胞中均显示出较强荧光，这主要是由于dox的非特异性渗透而不受tlr4抗体的影响所导致。因此，omvs/dox纳米粒通过识别tlr4选择性地内化到中性粒细胞中，以“顺风车”形式，通过中性粒细胞携带药物输送到沙门氏菌定植的肿瘤区域中。
[0066]
实验例3
[0067]
考察实施例2的沙门氏菌对脑胶质瘤靶向性的研究以及omvs/dox纳米粒在脑组织的分布研究：
[0068]
建立脑胶质瘤裸鼠模型：收集对数生长的用荧光标记c6细胞分散于pbs中，使c6细胞密度为1
×
108个/ml，注射于balb/c裸鼠(雌性，6周)的前囟后1.8mm偏右1mm部位。雌性balb/c裸鼠，6周龄，购自中南大学(中国长沙)实验室动物。待小鼠肿瘤到第六天后，进行后续操作。
[0069]
脑胶质瘤模型成功后，用4％水合氯醛麻醉balb/c裸鼠后静脉注射0.2ml含有8
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106cfu的减毒的沙门氏菌。在注射减毒的沙门氏菌0、24、48和72h，使用ivis 100系统(caliper life,sciences,hopkinton,ma,usa)进行生物发光成像。
[0070]
脑胶质瘤的balb/c裸鼠经沙门氏菌处理48h后，每只小鼠接受等效剂量dox(2mg/kg)，omvs/dox(2mg/kg)处理8h后，将小鼠处死，取出肿瘤组织，用ivis 100系统(caliper life,sciences,hopkinton,ma,usa)进行激发光成像。
[0071]
图7a为沙门氏菌在体内的动态荧光分布。分别在小鼠的尾静脉注射相同剂量的沙门氏菌，在不同的时间段进行生物发光成像。从图7可知：沙门氏菌可以通过bbb靶向脑胶质瘤部位且48h时沙门氏菌的荧光强度最强，即靶向性最强。图7b为dox及omvs/dox在脑组织的分布研究。分别给裸鼠尾静脉注射游离dox及omvs/dox，注射后8h，将小鼠处死，观察脑部肿瘤的荧光分布图。如图7b可知：单独注射游离dox或omvs/dox后在脑组织未发现荧光，这主要是由于脑组织所特有的bbb结构阻止药物进入大脑中，这也是大多数抗神经胶质瘤药疗效受限的主要原因。但是，沙门氏菌s.t-δpg
flab
+omvs/dox的治疗组在脑肿瘤部位显示出显著荧光，表明在沙门氏菌的介导下使得omvs/dox纳米粒成功通过bbb到达肿瘤部位，达到肿瘤药物靶向递送的效果。相比之下，s.t-δpg
flab
+dox治疗时，大脑中的荧光显著低于s.t-δpg
flab
+omvs/dox组，进一步说明omvs载体对于dox的递送效果更好。
[0072]
实验例4
[0073]
考察实施例2的omvs/dox纳米粒的体内抗肿瘤活性：
[0074]
为了评估每组的抗肿瘤效力，按照实施例4的方法处理小鼠，将小鼠随机分成5组(n＝5)，在治疗组中，每只小鼠接受等量的沙门氏菌(8
×
106cfu)，dox(2mg/kg)，omvs/dox(2mg/kg)。在整个研究中每隔一天监测荷瘤小鼠的体重。在肿瘤细胞注射后15天，使用7.0t微mri扫描仪(bruker biospec，germany)监测每个小鼠组的肿瘤大小。在实验结束时，对小鼠实施安乐死；收集肿瘤，肿瘤体积计算公式：v＝长
×
宽2/2。
[0075]
图8为分别注射各种制剂后的肿瘤体积大小；图9为分别注射各种制剂后的裸鼠生存率；其中1为pbs，2为omvs/dox，3为s.t-δpg
flab
，4为dox，5为s.t-δpg
flab
+dox，6为s.t-δpg
flab
+omvs/dox。
[0076]
从图8中可知，与pbs组相比，制剂组均具有一定的抗肿瘤效果，其中s.t-δpg
flab
+omvs/dox组肿瘤抑制效果最强，肿瘤生长明显受到抑制；图9的裸鼠生存率也反应出同样的趋势。
[0077]
以上所述实施例，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。
技术特征：1.一种基于载药囊泡的突破血脑屏障组合物，其特征在于，包括载药囊泡纳米粒和减毒沙门氏菌，所述载药囊泡纳米粒是由细菌外膜囊泡和多柔比星通过自组装形成的球形纳米粒。2.根据权利要求1所述的一种基于载药囊泡的突破血脑屏障组合物，其特征在于，所述组合物的使用方法为：先注射所述减毒沙门氏菌，24～48h后再注射所述载药囊泡纳米粒。3.根据权利要求1所述的一种基于载药囊泡的突破血脑屏障组合物，其特征在于，所述细菌纳米囊泡为革兰氏阴性菌自然释放的纳米级蛋白脂质体。4.根据权利要求3所述的一种基于载药囊泡的突破血脑屏障组合物，其特征在于，所述革兰氏阴性菌为沙门氏菌。5.根据权利要求1所述的一种基于载药囊泡的突破血脑屏障组合物，其特征在于，所述细菌外膜囊泡和多柔比星的质量比为1:1。6.根据权利要求1～5任一项所述的一种基于载药囊泡的突破血脑屏障组合物，其特征在于，所述载药囊泡纳米粒的制备包括以下步骤：s1、革兰阴氏菌接种培养，超速离心收集革兰阴氏菌分泌的细菌外膜囊泡；s2、将步骤s1中获得的细菌外膜囊泡与多柔比星在pbs缓冲液中室温下混合孵育；s3、将步骤s2中的混合孵育液使用超滤管去除空载的多柔比星，然后将得到的纳米粒用pbs缓冲液洗涤，即得载药囊泡纳米粒。7.根据权利要求6所述的一种基于载药囊泡的突破血脑屏障组合物，其特征在于，所述步骤s2中混合孵育时间为4～6h。8.根据权利要求6所述的一种基于载药囊泡的突破血脑屏障组合物，其特征在于，所述步骤s3中超滤管为100kda。9.一种如权利要求1～8任一项所述的一种基于载药囊泡的突破血脑屏障组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为脑胶质瘤。
技术总结本发明提供了一种基于载药囊泡的突破血脑屏障组合物及其应用，包括载药囊泡纳米粒和减毒沙门氏菌，载药囊泡纳米粒是由细菌外膜囊泡和多柔比星通过自组装形成的球形纳米粒。本发明的基于载药囊泡的突破血脑屏障组合物联合使用，先通过减毒沙门氏菌定植在颅内肿瘤位置；然后载药囊泡纳米粒进入体内，在TLR4的介导下内化到中性粒细胞中；携带有载药囊泡纳米粒的中性粒细胞在定植于颅内肿瘤部位的沙门氏菌招募作用下，被选择性识别从而通过血脑屏障，靶向到定植于颅内肿瘤周围的沙门氏菌，载药囊泡纳米粒以“顺风车”的形式靶向到达颅内肿瘤周围；载药囊泡纳米粒在肿瘤微酸性环境释放出多柔比星，对肿瘤进行杀伤，同时清除定植的沙门氏菌防止感染。的沙门氏菌防止感染。的沙门氏菌防止感染。
技术研发人员：齐妍 姚晴
受保护的技术使用者：湛江中心人民医院
技术研发日：2022.06.23
技术公布日：2022/11/1
