1.本发明涉及检测技术领域，尤其涉及用于质谱检测的样本前处理组合物 及应用、前处理方法。
背景技术：2.他克莫司是一种免疫抑制剂，是器官移植，特别是肾脏移植患者的常用 药物，移植后合理服用他克莫司可使器官免遭排斥。剂量不足会导致机体对 移植器官产生排斥反应；而剂量过高又会引起严重的副反应，包括肾脏毒性， 肝脏毒性和其他一系列的并发症。通过检测病人全血中的他克莫司的浓度， 结合其它临床指征来合理用药，是确保器官移植接受者获得免疫抑制的最有 效方法。
3.西罗莫司是一种新型大环内酯类免疫抑制剂，早在20世纪70年代就被 研发出来，起初被作为低毒性的抗真菌药物，1977年发现具有免疫抑制作用， 现在经常作为维持移植器官免疫能力的药物(特别是肾移植)，以减缓器官 移植手术后的免疫排斥反应。西罗莫司的个体差异大，血药浓度与免疫抑制 强度及肝肾的毒性反应密切相关，中毒浓度与有效浓度很接近，治疗过程中 应进行血药浓度监测。
4.他克莫司和西罗莫司常用的样品前处理方法有蛋白沉淀法(ppt)、液液 萃取法(lle)和固相萃取法(spe)，但是这些方法往往需要多步操作，复杂 的操作步骤会增加测量结果误差。对于一些细胞毒性药物的监测，复杂的操 作步骤增加分析工作者与临床样本的接触机会，存在一定的安全隐患。因此， 简化样品前处理的操作步骤，对于减少样品暴露机会,提高分析结果的准确性 具有重要的意义。
5.现有检测他克莫司、西罗莫司的方法主要是免疫分析法、荧光偏振法、 液相色谱串联质谱联用法。免疫分析法专属性差，存在交叉免疫反应,干扰 检测的准确性。而荧光偏振法的试剂主要依赖进口，费用极其昂贵。lc-ms/ m s法操作简单、快速,测试时间较短,所需样品量少,灵敏度高,专属性 强,选用内标法定量可以尽量减少人为或仪器因素带来的检测误差。
6.本技术旨在建立一种用于质谱检测的样本前处理组合物以解决上述问题。
技术实现要素：7.为了实现根据本发明的上述目的和其他优点，本发明的第一个目的是提 供一种用于质谱检测的样本前处理组合物，所述组合物包括：内标工作液、 硫酸锌溶液、乙腈或甲醇；其中，所述硫酸锌溶液与所述乙腈或甲醇的体积 比为1:3-1:1。
8.优选地，所述硫酸锌溶液与所述乙腈或甲醇的体积比为2:3。
9.优选地，所述硫酸锌溶液浓度为0.002mol/l-0.2mol/l之间。
10.优选地，所述硫酸锌溶液浓度为0.005mol/l。
11.本发明的第二个目的是提供一种用于质谱检测的样本前处理方法，包括 以下步骤：
12.使用如上所述的样本前处理组合物处理待测血清样本；
13.取处理后的待测血清样本上清液作为测试样本；
14.采用液相色谱-质谱对所述测试样本进行检测。
15.优选地，所述液相色谱中的流动相a为含有5mm乙酸铵和0.1％甲酸的水 溶液；流动相b为含有5mm乙酸铵和0.1％甲酸的甲醇溶液。
16.优选地，液相色谱中洗针液为体积分数50％甲醇水溶液。
17.优选地，所述流动相的流速为0.6ml/min。
18.优选地，所述质谱的离子源为esi源，所述质谱采用正离子、多反应监 测模式。
19.本发明的第三个目的是提供一种根据上述的用于质谱检测的样本前处理 组合物的应用。
20.相比现有技术，本发明的有益效果在于：
21.本发明提供了种用于质谱检测的样本前处理组合物，组合物包括：内标 工作液、硫酸锌溶液、乙腈或甲醇；其中，硫酸锌溶液与所述乙腈或甲醇的体 积比为1:3-1:1。本发明还涉及用于质谱检测的样本前处理方法、应用。通过 使用本发明的样本前处理组合物，可简化样本前处理的步骤，节约时间。
22.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技 术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配 合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给 出。
附图说明
23.此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本技术的一部 分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的 不当限定。在附图中：
24.图1为本发明在步骤1.1中的sir线性图；
25.图2为本发明在步骤1.1中的tac线性图；
26.图3为本发明在步骤1.2中的sir线性图；
27.图4为本发明在步骤1.2中的tac线性图；
28.图5为本发明在步骤1.3中的sir线性图；
29.图6为本发明在步骤1.3中的tac线性图；
30.图7为本发明在步骤1.4中的sir线性图；
31.图8为本发明在步骤1.4中的tac线性图；
32.图9为本发明在步骤1.5中的sir线性图；
33.图10为本发明在步骤1.5中的tac线性图；
34.图11为本发明在步骤1.6中的sir线性图；
35.图12为本发明在步骤1.6中的tac线性图。
具体实施方式
36.下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明 的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可 以任意组合形成新的实施例。
37.下述实施例中，所采用的试剂如下：
38.1.准备仪器与试剂
39.1.1试剂：
40.表1试剂明细表
[0041][0042][0043]
1.2仪器/耗材
[0044]
表2仪器明细表
[0045][0046]
一种用于质谱检测的样本前处理组合物，该组合物包括：内标工作液、 硫酸锌溶液、乙腈或甲醇；其中，硫酸锌溶液与乙腈或甲醇的体积比为1:3
‑ꢀ
1:1；利用本发明的样本前处理组合物，可简化样本前处理的步骤，节约时间。
[0047]
在一些实施例中，内标工作液isw包括如表3所示的组成以及浓度。
[0048]
表3内标工作液组分表
[0049]
内标工作液浓度isw sir-d31600ng/mlisw tac-d4400ng/ml
[0050]
在一些实施例中，硫酸锌溶液与乙腈或甲醇的体积比为2:3；用该比例的 溶液可提升检测时的精密度。
[0051]
在一些实施例中，硫酸锌溶液浓度为0.002mol/l-0.2mol/l之间。优选 地，硫酸锌溶液浓度为0.005mol/l，以缓解溶液分层现象，保障样本前处理 的效果。
[0052]
本发明还涉及一种用于质谱检测的样本前处理方法，包括以下步骤：
[0053]
使用如上的样本前处理组合物处理待测血清样本；
[0054]
取处理后的待测血清样本上清液作为测试样本；
[0055]
采用液相色谱-质谱对所述测试样本进行检测。本发明提供的检测人血清 中两种免疫抑制剂药物的方法，在样本处理中，通过比较几种不同蛋白沉淀 法，并配合硫酸锌乙腈为沉淀剂直接取上清进样的方案并结合高效液相色谱 串联质谱仪，极大地缩短了检测时间，检测的准确度、精密度等符合要求，同 时，需兼顾方法重现性好，方法学稳定，适用于临床大量生物样本的快速检 测。
[0056]
2.检测方案
[0057]
2.1试剂配制
[0058]
(1)配制免疫抑制剂的标准工作液组sw，精确称量1mg标准品，使用1ml 甲醇充分溶解，得到1mg/ml母液，经不断稀释后得到工作液组sw，浓度如下 表4所示：
[0059]
表4标准样品基础工作溶液浓度表
[0060][0061][0062]
(2)生物标准曲线样品的制备
[0063]
精密吸取90μl的空白基质(水溶液)，加入10μl标准品的基础工作 溶液sw1-sw8，涡旋混匀，经前处理过程，制备得到生物标准曲线样品s1-s8， 浓度如下表5所示：
[0064]
表5生物样品基础工作溶液浓度表
[0065][0066]
(3)配制内标工作液isw
[0067]
(4)将内标母液1mg/ml经稀释后得到内标工作液isw，浓度如下表3所示：
[0068]
表3内标工作液组分表
[0069]
混合内标工作储备液浓度isw sir-d31600ng/mlisw tac-d4400ng/ml
[0070]
2.2样品处理与标准曲线构建
[0071]
(1)样品制备：每个待测血清样本吸取100μl，冷冻-80℃储存备用。
[0072]
(2)样本处理：取生物标准曲线样本，取出待测样本解冻，且检测时，先检 测生物标准曲线样本，并构建出标准曲线，然后检测待测样本。
[0073]
(3)操作步骤：分别按照1.1-1.6操作；该1.1-1.6具体为：
[0074]
步骤1.1)样本处理1：取100μl待测血清样本，向其中加入10μl内标工 作液和400μ
l0.005mol/l硫酸锌溶和乙腈(1：1)，2500rpm涡旋混匀3min, 于4℃下14000rpm离心10min；取上清液100μl作为测试样本。
[0075]
步骤1.2)样本处理2：取100μl待测血清样本，向其中加入10μl内标工 作液和400μl0.005mol/l硫酸锌溶和乙腈(1：2)，2500rpm涡旋混匀3min, 于4℃下14000rpm离心10min；取上清液100μl作为测试样本。
[0076]
步骤1.3)样本处理3：步骤：取100μl待测血清样本加入内标10μl，加入 0.2mol/l硫酸锌溶液100μl，再加入300μl甲醇，2500rpm涡旋混匀3min, 于4℃下14000rpm离心10min；转移上清液400μl至另一离心管中，60℃下 氮吹；再用100μl流动相a：b＝3：2复溶液(5mm乙酸铵，0.1％甲酸的甲醇 水溶液)复溶，进样。
[0077]
步骤1.4)样本处理4：步骤：取100μl待测血清样本加入内标10μl，加入 0.2mol/l硫酸锌溶液100μl，再加入300μl乙腈，2500rpm涡旋混匀3min； 取上清液100μl作为测试样本。
[0078]
步骤1.5)样本处理5：步骤：取100μl待测血清样本加入内标10μl，加入 0.2mol/l硫酸锌溶液100μl，再加入300μl甲醇，2500rpm涡旋混匀3min； 取上清液100μl作为测试样本。
[0079]
步骤1.6)样本处理6：取100μl待测血清样本，向其中加入10μl内标工 作液和400μl0.005mol/l硫酸锌溶和乙腈(2：3)，2500rpm涡旋混匀3min, 于4℃下14000rpm离心10min；取上清液100μl作为测试样本。
[0080]
获取测试样本后，采用lc-ms/ms设备对测试样本进行检测。在一些实施 例中，在进行实际检测时，液相色谱中的流动相a为含有5mm乙酸铵和0.1％ 甲酸的水溶液；流动相b为含有5mm乙酸铵和0.1％甲酸的甲醇溶液，以保证 检测效果；洗针液为体积分数50％甲醇水溶液，以保证检测效果。
[0081]
在一些实施例中，采用的梯度洗脱程序为：0-0.4min,75％b,0.4
‑ꢀ
0.5min,100％b；0.5-2.5min,100％b；2.5-2.6min,75％b；2.6-4min,75％b；流速为 0.6ml/min，可以使多种目标物谱峰分离度得以改善；保证目标物保留时间以 及峰型稳定的前提下，柱子也得到相应平衡的最快最佳时间；-因此选用改梯 度洗脱。
[0082]
在一些实施例中，色谱柱为inersl c18,4.6*100mm,5μm，根据目标分析 物性质以及现有色谱柱条件，发现使用该色谱柱目标物出峰时间适宜，峰形 较好，响应强度高且化学性质稳定。
[0083]
在一些实施例中，质谱条件：离子源为esi源，采用正离子模式、多反 应监测模式；选用正离子以及esi源-经多次实验验证，发现在质谱仪形成正 离子，而且对比其他源，发现esi源响应值最高。电喷雾电压：4800-6000v； 涡旋离子喷雾温度：200-350℃；气帘气：20psi；碰撞池气体：中级；离子源 气体gs1：50psi；辅助气gs2：60psi；数据收集时间：3.5-4.5min。在进行 参数选择时，采用手动优化方式，混合目标物调谐溶液针泵进样后，选取适 宜的参数用于定量分析，保证两种物质在此仪器下的响应强度以及峰形最佳。
[0084]
上机操作：将待测样本在lc-20axr液相色谱仪(岛津)-串联质谱(api 4000
tm
)设备中进行检测。采用多反应监测(mrm)扫描方式，色谱测试条件 为：流动相a为含有5mm乙酸铵和0.1％甲酸的水溶液；流动相b为含有5mm 乙酸铵和0.1％甲酸的甲醇溶液；洗针液为体积分数50％甲醇水溶液；色谱柱 为inersl c18，4.6*100mm,5μm；柱温为60℃；检测时间为
4min；进样量为 20μl；梯度洗脱条件0-0.4min,75％b,0.4-0.5min,100％b；0.5-2.5min,100％ b；2.5-2.6min,75％b；2.6-4min,75％b；流速为1.3ml/min。质谱条件为正离子模 式，采用esi源；电喷雾电压：4800-6000v；涡旋离子喷雾浓度：200-350℃； 气帘气：20psi；碰撞池气体：中级；离子源气体gs1：50psi；辅助气gs2： 60psi。化合物质谱参数如下表6所示：
[0085]
表6化合物质谱参数表
[0086][0087]
检测结果：
[0088]
线性比较：
[0089]
根据步骤1.1-步骤1.6分别进行上机测试，得到的线性图如图1-12所 示；通过图1-12的对比，结合线性拟合度可知，步骤1.3、步骤1.4的前样 本处理方法效果欠佳，步骤1.6的前样本处理方法较好。
[0090]
信噪比：
[0091]
通过lc-ms/ms设备对步骤1.1-步骤1.6中的测试样本进行检测，以获 取不同方案中的信噪比，步骤1.3中西罗莫司以及他克莫司信噪比最高，则 检测灵敏度越高。
[0092]
结合线性比较中的比较结果，可排除步骤1.4-步骤1.6，仅需对步骤1.1
‑ꢀ
步骤1.3中的信噪比进行对比，如下表7所示。
[0093]
表7两种物质信噪比对照表
[0094] 信噪比 信噪比1.1-sir24.71.1-tac114.21.2-sir47.51.2-tac158.51.3-sir591.3-tac178.5
[0095]
方法验证-精密度：
[0096]
选取低、中、高三个浓度评价方法的精密度，每个批次每个浓度样本分 不少于5次进行处理，连续测定3个批次，总样本数不少于45份，分别评估 每个浓度样本的批内精密度和批间精密度以及总精密度。结果如表8、表9所 示。
[0097]
表8 sir的方法精密度
[0098][0099]
表9 tac的方法精密度
[0100][0101]
由数据结果可知，低、中、高三个浓度的批内精密度、批间精密度以及总 精密度均在15％以内，符合要求。
[0102]
方法验证-准确度
[0103]
采用真实混合人血清加标回收率来评价方法的准确度。每个浓度两个平 行样，每个样本测试三次，计算加标回收率和检测结果的变异系数。结果如 表10、表11所示。由数据结果可知，加标样品的检测值和理论值的偏差符合
ꢀ±
15％范围内。
[0104]
表10 sir的方法回收率
[0105][0106]
表11 tac的方法回收率
[0107][0108][0109]
方法验证-携带污染
[0110]
对该方法的携带污染进行评估，先重复进样低浓度样本，然后交替进样 高浓度样本和低浓度样本。结果如表12、表13所示。由数据可知，通过比较 第1次进样的低浓度样本检验结果与随后进样的低浓度样本检验结果的差异， 低于预定标准(20％)
[6]
，说明在测定该高浓度及以下浓度样本时不存在明显 的携带污染。
[0111]
表12 sir方法的携带污染
[0112][0113][0114]
表13 tac方法的携带污染
[0115][0116]
技术特征：1.一种用于质谱检测的样本前处理组合物，其特征在于，所述组合物包括：内标工作液、硫酸锌溶液、乙腈或甲醇；其中，所述硫酸锌溶液与所述乙腈或甲醇的体积比为1:3-1:1。2.如权利要求1所述的用于质谱检测的样本前处理组合物，其特征在于，所述硫酸锌溶液与所述乙腈或甲醇的体积比为2:3。3.如权利要求1所述的用于质谱检测的样本前处理组合物，其特征在于，所述硫酸锌溶液浓度为0.002mol/l-0.2mol/l之间。4.如权利要求3所述的用于质谱检测的样本前处理组合物，其特征在于，所述硫酸锌溶液浓度为0.005mol/l。5.一种用于质谱检测的样本前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：使用如权利要求1所述的样本前处理组合物处理待测血清样本；取处理后的待测血清样本上清液作为测试样本；采用液相色谱-质谱对所述测试样本进行检测。6.如权利要求5所述的用于质谱检测的样本前处理方法，其特征在于，所述液相色谱中的流动相a为含有5mm乙酸铵和0.1％甲酸的水溶液；流动相b为含有5mm乙酸铵和0.1％甲酸的甲醇溶液。7.如权利要求5或6所述的用于质谱检测的样本前处理方法，其特征在于，液相色谱中洗针液为体积分数50％甲醇水溶液。8.如权利要求6所述的用于质谱检测的样本前处理方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.6ml/min。9.如权利要求5所述的用于质谱检测的样本前处理方法，其特征在于，所述质谱的离子源为esi源，所述质谱采用正离子、多反应监测模式。10.如权利要求1所述的用于质谱检测的样本前处理组合物的应用。
技术总结本发明涉及种用于质谱检测的样本前处理组合物，组合物包括：内标工作液、硫酸锌溶液、乙腈或甲醇；其中，硫酸锌溶液与所述乙腈或甲醇的体积比为1:3-1:1。本发明还涉及该组合物的应用以及用于质谱检测的样本前处理方法。通过使用本发明的样本前处理组合物，可简化样本前处理的步骤，节约时间。节约时间。节约时间。
技术研发人员：张怡铭 楚士颖 周玉松 李艳 周传贵 李艳杰 覃素姿 王天一 胡玮 程文播
受保护的技术使用者：苏州国科医工科技发展（集团）有限公司
技术研发日：2022.05.26
技术公布日：2022/11/1
