1.本发明涉及蒙药提取技术领域，具体涉及一种绿色磁性双模板分子印迹聚合物的制备方法及应用。
背景技术：2.短瓣金莲花(trollius ledebouri reichb.)是毛莨科金莲花属多年生草本植物，主要分布于内蒙古东北部和黑龙江地区。短瓣金莲花含有丰富的黄酮、有机酸和甾醇等生物活性物质。在短瓣金莲花前期研究中发现，黄酮类化合物为其主要活性成分，且具有显著的抑菌及抗炎作用。荭草苷和牡荆苷作为黄酮类化合物，是短瓣金莲花的指标性活性物质。现代药理研究表明，荭草苷具有抗菌抗病毒、抗炎镇痛、神经保护和心脏保护等作用，在临床上也有广泛的应用。牡荆苷在保护心脑血管、抑制神经炎症、抑制骨溶解和抗肿瘤等多种药理作用。由于短瓣金莲花成分的复杂性，目前常使用高效液相色谱(hplc)法分离并测定其含量，但其受基质内源性干扰物的影响，检出限较差，灵敏度较低，而且其操作繁琐、费时。目前，选择性分离的方法有高速逆流色谱(hsccc)、大孔树脂(mr)、膜过滤(mf)、尺寸排阻色谱(sec)、模拟移动床色谱法(smbc)和超临界流体萃取co2(sfe-co2)等。然而，虽然这些可以有效分离活性物质，但也存在选择性低、处理能力有限、仪器昂贵、分离过程复杂等缺点。因此开发高选择性、操作简便、实用经济的分离短瓣金莲花中荭草苷和牡荆苷的方法是亟需解决的关键技术难题。
3.分子印迹技术使用分子印迹聚合物(molecularly imprintedpolymers，mips)来模拟抗原-抗体或酶-底物的相互作用，可以特异性地识别印印迹分子。mips依靠两个或更多的分子相互作用的结合，形成具有相对完整性和组织性的复杂聚合体，具有一定的宏观特征和微观结构。mips制备过程包括预聚合、聚合、模板洗脱、吸附等四个主要阶段。分子印迹聚合物是一种化学合成的受体，具有预先设计的结合位点和对靶分子的刚性，在形状、大小和结合基团上与印迹分子互补，具有高特异性、低成本、优异的物理化学稳定性和对最恶劣环境的耐受性等优点。mips在许多重要的领域都有应用，如分离、催化、传感器等方面。在学术界和工业界，分子印迹聚合物已经被大规模生产。
4.近年来，低共熔溶剂逐渐进入人们的视野。abbott等人发现季铵盐和酰胺类化合物在低温下可以形成透明均匀的液体，并首次提出了共晶溶剂的概念。天然低共熔溶剂(natural deep eutectic solvents，nadess)作为一种绿色、可持续的溶剂在dess之后应运而生。它们通常是液体或固体化合物，由两种或两种以上的细胞初级代谢物组成，在相对较低的温度下通过简单的搅拌和混合形成，是一种透明均匀的液体共晶盐。nadess主要通过分子间氢键结合。通过调节分子的种类和摩尔比，可以得到具有不同物理化学性质的nadess。由于存在大量氢键，nadess熔点极低，原料为绿色无毒试剂，克服了传统有机试剂挥发性大、毒性高的缺点。另外，nadess还具有易于制备、易于储存、可持续性和可生物降解性的优点。可选择nadess作为mips的功能单体制备绿色的mips。因此，本发明设计可选择性分离荭草苷和牡荆苷的分子印迹聚合物以实现对短瓣金莲花中黄酮类成分的特异性分离
与富集。
技术实现要素：5.基于此，本发明的目的之一是提供一种绿色磁性双模板分子印迹聚合物的制备方法，以绿色、高效、低成本及特异性分离短瓣金莲花中的荭草苷和牡荆苷。
6.为了实现上述发明目的，具体技术方案如下：
7.一种绿色磁性双模板分子印迹聚合物的制备方法，包括如下步骤：
8.s1：天然低共熔溶剂的制备
9.将氯化胆碱、咖啡酸和甲酸按照预定比例混合均匀，在温度为80℃下加热至透明均匀的液体，且在室温下没有晶体析出，即可制得天然低共熔溶剂；
10.s2：凹凸棒纯化
11.将六氟偏磷酸钠、凹凸棒粘土按照预定比例混合均匀，加入纯水连续搅拌洗涤24h，静置30min，取上层悬浮液，15000r/min离心3min，超纯水搅拌溶解洗涤离心沉淀，重复洗涤三次，离心得到膏状凹凸棒纯化产物，真空40℃干燥；
12.s3：凹凸棒酸化
13.取s2中膏状凹凸棒纯化产物加入1mol/l的盐酸混合，连续搅拌24h，用纯水洗涤酸化后的膏状凹凸棒纯化产物直至无氯离子，15000r/min离心3min得到膏状产物，真空40℃干燥12h，经研磨粉碎，用100目筛子过筛，密封保存备用，得到h-atp(改性凹凸棒粘土)；
14.s4：fe3o4@h-atp的制备
15.将fecl3·
6h2o固体23.35g与feso4·
7h2o固体12.01g于250ml三颈圆底烧瓶中，加入适量超纯水超声至完全溶解，加入s2中10g酸化凹凸棒，超声分散30min，机械搅拌，油浴加热，待温度上升至75℃，缓慢加入50ml氨水，在氮气保护下，继续机械搅拌3.5h，反应完成后用磁铁分离产物，依次使用纯水、无水乙醇各洗涤三次，在40℃真空干燥箱中干燥，过夜，研磨、粉碎、过筛，密封保存；
16.s5：硅烷偶联剂改性fe3o4@h-atp的制备
17.将fe3o4@h-atp、3-氨基三甲氧基硅烷各5g，及20倍质量的乙醇-水混合于三颈圆底烧瓶中，50℃条件下超声40min，再于50℃下机械搅拌8h，反应完成后用磁铁分离产物，用乙醇-水洗涤三次，40℃真空干燥箱干燥，过夜，研磨、粉碎、过筛，密封保存，制得硅烷偶联剂改性fe3o4@h-atp；
18.s6：制备绿色磁性双模板分子印迹聚合物
19.称取红荭草苷和牡荆苷标准品各0.0125mmol溶于20ml甲醇-乙腈中，加入6mmol天然低共熔溶剂、30mg硅烷偶联剂改性fe3o4@h-atp，在50℃下预聚12h，将0.9ml乙二醇二甲基丙烯酸酯、30mg 2,2'-偶氮双(异丁腈)与预聚物混合后超声溶解，n2鼓泡10min后，在65℃继续氮气保护，机械搅拌24h，用磁铁辅助分离产物，用甲醇清洗3-4次，40℃真空干燥，过夜，研磨，粉碎，反应结束后采用甲醇-乙酸溶液索式提取，直至模板全部洗脱，用磁铁辅助分离产物，甲醇清洗至无乙酸味道，40℃真空干燥，研磨待用，即可制备绿色磁性双模板分子印迹聚合物。
20.进一步地，所述s1中氯化胆碱、咖啡酸和甲酸的摩尔比为3：1：1.5。
21.进一步地，所述s2中六氟偏磷酸钠、凹凸棒粘土的质量比为1:50。
22.进一步地，所述s3中膏状凹凸棒纯化产物与盐酸的固液比为1:5。
23.进一步地，所述s5中fe3o4@h-atp、3-氨基三甲氧基硅烷、乙醇-水的质量比为1:1:20，其中，乙醇-水的体积比为9:1。
24.进一步地，所述s6中甲醇-乙腈的体积比为1:1。
25.进一步地，所述s6中甲醇-乙酸的体积比为9:1。
26.本发明的另一目的是提供一种绿色磁性双模板分子印迹聚合物的应用，所述绿色磁性双模板分子印迹聚合物用于对短瓣金莲花中荭草苷和牡荆苷进行选择性分离。
27.本发明上述一个或多个技术方案具有如下技术效果：
28.本发明提供一种绿色磁性双模板分子印迹聚合物的制备方法，采用绿色低共熔溶剂代替传统有机功能单体，并以无毒无害且廉价的凹凸棒粘土作为载体，以合成可选择性吸附短瓣金莲花提取液中荭草苷和牡荆苷的绿色磁性双模板分子印迹聚合物。并对制备的条件进行调控以提高其吸附性能和选择性能。由于制备的方法结合了天然低共熔溶剂的绿色安全性、四氧化三铁的可回收性、凹凸棒的低成本性以及高吸附容量和较强的靶向吸附的优点，因此可适用于快速分离短瓣金莲花中的荭草苷和牡荆苷，并可循环使用。
附图说明
29.图1.绿色磁性双模板分子印迹聚合物的制备工艺流程图；
30.图2.磁性双模板分子印迹聚合物扫描电镜图。
具体实施方式
31.下文结合实施例和图1-2，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。以下实施例中所用原料若未特别说明，均为通过商业渠道获得。
32.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
33.实施例1
34.一种绿色磁性双模板分子印迹聚合物的制备方法，包括如下步骤：
35.s1：天然低共熔溶剂的制备
36.将氯化胆碱、咖啡酸和甲酸按照摩尔比为3：1：1.5混合均匀，在温度为80℃下加热至透明均匀的液体，且在室温下没有晶体析出，即可制得天然低共熔溶剂；
37.s2：凹凸棒纯化
38.将六氟偏磷酸钠、凹凸棒粘土按照质量比为1:50混合均匀，加入纯水连续搅拌洗涤24h(六氟偏磷酸钠、凹凸棒粘土与纯水的固液比为1:5)，静置30min，取上层悬浮液，15000r/min离心3min，超纯水搅拌溶解洗涤离心沉淀，重复洗涤三次，离心得到膏状凹凸棒纯化产物，真空40℃干燥；
39.s3：凹凸棒酸化
40.取s2中膏状凹凸棒纯化产物加入1mol/l的盐酸混合(膏状凹凸棒纯化产物与盐酸的固液比为1:5)，连续搅拌24h，用纯水洗涤酸化后的膏状凹凸棒纯化产物直至无氯离子，
15000r/min离心3min得到膏状产物，真空40℃干燥12h，经研磨粉碎，用100目筛子过筛，密封保存备用，得到h-atp(改性凹凸棒粘土)；
41.s4：fe3o4@h-atp的制备
42.将fecl3·
6h2o固体23.35g与feso4·
7h2o固体12.01g于250ml三颈圆底烧瓶中，加入适量超纯水超声至完全溶解，加入s2中10g酸化凹凸棒，超声分散30min，机械搅拌，油浴加热，待温度上升至75℃，缓慢加入50ml氨水，在氮气保护下，继续机械搅拌3.5h，反应完成后用磁铁分离产物，依次使用纯水、无水乙醇各洗涤三次，在40℃真空干燥箱中干燥，过夜，研磨、粉碎、过筛，密封保存；
43.s5：硅烷偶联剂改性fe3o4@h-atp的制备
44.将fe3o4@h-atp、3-氨基三甲氧基硅烷、乙醇-水(乙醇-水的体积比为9:1)按质量比为1:1:20混合于三颈圆底烧瓶中，50℃条件下超声40min，再于50℃下机械搅拌8h，反应完成后用磁铁分离产物，用乙醇-水洗涤三次，40℃真空干燥箱干燥，过夜，研磨、粉碎、过筛，密封保存，制得硅烷偶联剂改性fe3o4@h-atp；
45.s6：制备绿色磁性双模板分子印迹聚合物
46.称取红荭草苷和牡荆苷标准品各0.0125mmol溶于20ml甲醇-乙腈(甲醇-乙腈的体积比为1:1)中，加入6mmol天然低共熔溶剂、30mg硅烷偶联剂改性fe3o4@h-atp，在50℃下预聚12h，将0.9ml乙二醇二甲基丙烯酸酯、30mg 2,2'-偶氮双(异丁腈)与预聚物混合后超声溶解，n2鼓泡10min后，在65℃继续氮气保护，机械搅拌24h，用磁铁辅助分离产物，用甲醇清洗3-4次，40℃真空干燥，过夜，研磨，粉碎，反应结束后采用甲醇-乙酸(甲醇-乙酸的体积比为9:1)溶液索式提取，直至模板全部洗脱，用磁铁辅助分离产物，甲醇清洗至无乙酸味道，40℃真空干燥，研磨待用，即可制备绿色磁性双模板分子印迹聚合物。
47.实施例2
48.一种绿色磁性双模板分子非印迹聚合物的制备方法，包括如下步骤：
49.s1：天然低共熔溶剂的制备
50.将氯化胆碱、咖啡酸和甲酸按照摩尔比为3：1：1.5混合均匀，在温度为80℃下加热至透明均匀的液体，且在室温下没有晶体析出，即可制得天然低共熔溶剂；
51.s2：凹凸棒纯化
52.将六氟偏磷酸钠、凹凸棒粘土按照质量比为1:50混合均匀，加入纯水连续搅拌洗涤24h(六氟偏磷酸钠、凹凸棒粘土与纯水的固液比为1:5)，静置30min，取上层悬浮液，15000r/min离心3min，超纯水搅拌溶解洗涤离心沉淀，重复洗涤三次，离心得到膏状凹凸棒纯化产物，真空40℃干燥；
53.s3：凹凸棒酸化
54.取s2中膏状凹凸棒纯化产物加入1mol/l的盐酸混合(膏状凹凸棒纯化产物与盐酸的固液比为1:5)，连续搅拌24h，用纯水洗涤酸化后的膏状凹凸棒纯化产物直至无氯离子，15000r/min离心3min得到膏状产物，真空40℃干燥12h，经研磨粉碎，用100目筛子过筛，密封保存备用，得到h-atp(改性凹凸棒粘土)；
55.s4：fe3o4@h-atp的制备
56.将fecl3·
6h2o固体23.35g与feso4·
7h2o固体12.01g于250ml三颈圆底烧瓶中，加入适量超纯水超声至完全溶解，加入s2中10g酸化凹凸棒，超声分散30min，机械搅拌，油浴
加热，待温度上升至75℃，缓慢加入50ml氨水，在氮气保护下，继续机械搅拌3.5h，反应完成后用磁铁分离产物，依次使用纯水、无水乙醇各洗涤三次，在40℃真空干燥箱中干燥，过夜，研磨、粉碎、过筛，密封保存；
57.s5：硅烷偶联剂改性fe3o4@h-atp的制备
58.将fe3o4@h-atp、3-氨基三甲氧基硅烷、乙醇-水(乙醇-水的体积比为9:1)按质量比为1:1:20混合于三颈圆底烧瓶中，50℃条件下超声40min，再于50℃下机械搅拌8h，反应完成后用磁铁分离产物，用乙醇-水洗涤三次，40℃真空干燥箱干燥，过夜，研磨、粉碎、过筛，密封保存，制得硅烷偶联剂改性fe3o4@h-atp；
59.s6：制备绿色磁性双模板分子非印迹聚合物
60.取6mmol天然低共熔溶剂、30mg硅烷偶联剂改性fe3o4@h-atp，在50℃下预聚12h，将0.9ml乙二醇二甲基丙烯酸酯、30mg 2,2'-偶氮双(异丁腈)与预聚物混合后超声溶解，n2鼓泡10min后，在65℃继续氮气保护，机械搅拌24h，用磁铁辅助分离产物，用甲醇清洗3-4次，40℃真空干燥，过夜，研磨，粉碎，反应结束后采用甲醇-乙酸(甲醇-乙酸的体积比为9:1)溶液索式提取，直至模板全部洗脱，用磁铁辅助分离产物，甲醇清洗至无乙酸味道，40℃真空干燥，研磨待用，即可制备绿色磁性双模板分子非印迹聚合物。
61.对绿色磁性双模板分子印迹聚合物制备过程进行扫描电镜分析，a、b图分别为atp和h-atp，其为棒状结构，在盐酸改性后，atp表面更加粗糙。c图为h-atp负载fe3o4，可以观察到在棒上附着了小颗粒。d图是包裹偶联剂之后的图，e和f图分别为双模板分子非印迹聚合物mnips和双模板分子印迹聚合物mdmips的图，可以看出合成的mdmips更紧密的连接在一起。棒状形状明显包覆了一层聚合物。
62.绿色磁性双模板分子印迹聚合物对荭草苷和牡荆苷的吸附率分析：
63.将荭草苷与牡荆苷标准品用60％乙醇为溶剂配制为质量浓度为0.1mg/ml；取2份0.10mg/ml荭草苷与牡荆苷溶液3ml，分别添加1.0mg绿色磁性双模板分子印迹聚合物和1.0mg绿色磁性双模板分子非印迹聚合物，于30℃水浴摇床吸附180min。吸附结束后在外加磁场下使得绿色磁性双模板分子印迹聚合物分离，进行液相分析；使用dionexultimate 3000高效液相色谱对吸附前与吸附后的荭草苷与牡荆苷溶液进行定量分析并计算绿色磁性双模板分子印迹聚合物吸附率及印迹因子。色谱柱为thermo c
18
柱，流动相为1％磷酸和乙腈，梯度洗脱：0-10min，5％-20％b；10-15min，20％-25％b；15-18min，25％-30％b；18-22min，30％-35％b；22-25min，35％-5％b，柱温35℃，流速0.9ml/min，进样量20μl，检测波长235nm；
64.吸附率q(mg/g)定义为：
[0065][0066]
其中c0(mg/ml)表示分析物被吸附前的浓度，cf(mg/ml)表示分析物被吸附后的浓度，v(ml)表示被加入液体体积，m(g)表示使用的mdmip的质量；
[0067]
绿色磁性双模板分子印迹聚合物对荭草苷和牡荆苷印迹效果用印迹因子(if)来计算：
[0068]
[0069]qmdmip
和q
mnip
分别表示绿色磁性双模板分子印迹聚合物和绿色磁性双模板分子非印迹聚合物对分析物的吸附量。
[0070]
综上所述，本发明所制备的绿色磁性双模板分子印迹聚合物，采用绿色低共熔溶剂代替传统有机功能单体，并以无毒无害且廉价的凹凸棒粘土作为载体，以合成可选择性吸附短瓣金莲花提取液中荭草苷和牡荆苷的绿色磁性双模板分子印迹聚合物。并对制备的条件进行调控以提高其吸附性能和选择性能。由于制备的方法结合了天然低共熔溶剂的绿色安全性、四氧化三铁的可回收性、凹凸棒的低成本性以及高吸附容量和较强的靶向吸附的优点，因此可适用于快速分离短瓣金莲花中的荭草苷和牡荆苷，并可循环使用。
技术特征：1.一种绿色磁性双模板分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：s1：天然低共熔溶剂的制备将氯化胆碱、咖啡酸和甲酸按照预定比例混合均匀，在温度为80℃下加热至透明均匀的液体，且在室温下没有晶体析出，即可制得天然低共熔溶剂；s2：凹凸棒纯化将六氟偏磷酸钠、凹凸棒粘土按照预定比例混合均匀，加入纯水连续搅拌洗涤24h，静置30min，取上层悬浮液，15000r/min离心3min，超纯水搅拌溶解洗涤离心沉淀，重复洗涤三次，离心得到膏状凹凸棒纯化产物，真空40℃干燥；s3：凹凸棒酸化取s2中膏状凹凸棒纯化产物加入1mol/l的盐酸混合，连续搅拌24h，用纯水洗涤酸化后的膏状凹凸棒纯化产物直至无氯离子，15000r/min离心3min得到膏状产物，真空40℃干燥12h，经研磨粉碎，用100目筛子过筛，密封保存备用，得到h-atp(改性凹凸棒粘土)；s4：fe3o4@h-atp的制备将fecl3·
6h2o固体23.35g与feso4·
7h2o固体12.01g于250ml三颈圆底烧瓶中，加入适量超纯水超声至完全溶解，加入s2中10g酸化凹凸棒，超声分散30min，机械搅拌，油浴加热，待温度上升至75℃，缓慢加入50ml氨水，在氮气保护下，继续机械搅拌3.5h，反应完成后用磁铁分离产物，依次使用纯水、无水乙醇各洗涤三次，在40℃真空干燥箱中干燥，过夜，研磨、粉碎、过筛，密封保存；s5：硅烷偶联剂改性fe3o4@h-atp的制备将fe3o4@h-atp、3-氨基三甲氧基硅烷各5g，及20倍质量的乙醇-水混合于三颈圆底烧瓶中，50℃条件下超声40min，再于50℃下机械搅拌8h，反应完成后用磁铁分离产物，用乙醇-水洗涤三次，40℃真空干燥箱干燥，过夜，研磨、粉碎、过筛，密封保存，制得硅烷偶联剂改性fe3o4@h-atp；s6：制备绿色磁性双模板分子印迹聚合物称取红荭草苷和牡荆苷标准品各0.0125mmol溶于20ml甲醇-乙腈中，加入6mmol天然低共熔溶剂、30mg硅烷偶联剂改性fe3o4@h-atp，在50℃下预聚12h，将0.9ml乙二醇二甲基丙烯酸酯、30mg 2,2'-偶氮双(异丁腈)与预聚物混合后超声溶解，n2鼓泡10min后，在65℃继续氮气保护，机械搅拌24h，用磁铁辅助分离产物，用甲醇清洗3-4次，40℃真空干燥，过夜，研磨，粉碎，反应结束后采用甲醇-乙酸溶液索式提取，直至模板全部洗脱，用磁铁辅助分离产物，甲醇清洗至无乙酸味道，40℃真空干燥，研磨待用，即可制备绿色磁性双模板分子印迹聚合物。2.根据权利要求1所述的绿色磁性双模板分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：所述s1中氯化胆碱、咖啡酸和甲酸的摩尔比为3：1：1.5。3.根据权利要求1所述的绿色磁性双模板分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：所述s2中六氟偏磷酸钠、凹凸棒粘土的质量比为1:50。4.根据权利要求1所述的绿色磁性双模板分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：所述s3中膏状凹凸棒纯化产物与盐酸的固液比为1:5。5.根据权利要求1所述的绿色磁性双模板分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：所述s5中fe3o4@h-atp、3-氨基三甲氧基硅烷、乙醇-水的质量比为1:1:20，其中，乙醇-水的体
积比为9:1。6.根据权利要求1所述的绿色磁性双模板分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：所述s6中甲醇-乙腈的体积比为1:1。7.根据权利要求1所述的绿色磁性双模板分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：所述s6中甲醇-乙酸的体积比为9:1。8.一种绿色磁性双模板分子印迹聚合物的应用，其特征在于，所述绿色磁性双模板分子印迹聚合物用于对短瓣金莲花中荭草苷和牡荆苷进行选择性分离。
技术总结本发明提供一种绿色磁性双模板分子印迹聚合物的制备方法，包括：天然低共熔溶剂的制备、凹凸棒纯化、凹凸棒酸化、Fe3O4@H-ATP的制备、硅烷偶联剂改性Fe3O4@H-ATP的制备、绿色磁性双模板分子印迹聚合物制备。本发明所提供的绿色磁性双模板分子印迹聚合物，采用绿色低共熔溶剂代替传统有机功能单体，并以无毒无害且廉价的凹凸棒粘土作为载体，以合成可选择性吸附短瓣金莲花提取液中荭草苷和牡荆苷的绿色磁性双模板分子印迹聚合物。制备的方法结合了天然低共熔溶剂的绿色安全性、四氧化三铁的可回收性、凹凸棒的低成本性以及高吸附容量和较强的靶向吸附的优点，因此可适用于快速分离短瓣金莲花中的荭草苷和牡荆苷，并可循环使用。并可循环使用。并可循环使用。
技术研发人员：张艳玲 左佳乐 马佩荣 李政 肖豆鑫 吴海霞 董阿力德尔图
受保护的技术使用者：内蒙古大学
技术研发日：2022.05.26
技术公布日：2022/11/1
