基于等温核酸扩增qpcr技术的心梗危险因素检测方法及其pcr
技术领域
1.本发明属于生物学检测技术领域，特别涉及基于等温核酸扩增qpcr技术的心梗危险因素检测方法及其pcr。
背景技术：2.等温扩增是一种不同与常规核酸扩增的方法以聚合酶链反应(pcr)为代表的基于核酸的检测技术发展迅速，为核算的精确检测诊断提供了可能。kary mtlllis博士发明的pcr技术是20世纪80年代分子生物学领域的一项革命性突，目前，pcr技术会在分子生物学、医学、法学等领域发挥如此重要的作用。经过几十年的改进，pcr方法已从定性发展为定量，能够在几个小时内，从几个拷贝或单个细胞开始扩增到数十亿特异性的核酸片段，而且特异性也有了极大的提高。然而，从pcr技术的诞生之日起，它始终无法摆脱依赖精良仪器设备的局限，使得以pcr为基础的核酸扩增检测技术无法更广泛地推广和应用。基于这种强烈的需求，以核酸等温扩增技术为基础的检测技术近年来得到了迅猛的发展。多种机制的等温技术不仅诞生，而且有些技术已经相当成熟，完成了从实验室到实际应用的过渡，特别是在临床和现场(point－of－care)快速诊断技术方面，核酸等温扩增技术显示了其突出的优越性。更为重要的是，核酸等温扩增技术由于不需要温度变化的时间过程且摆脱了对精良仪器设备的依赖，使得我们对病原体的检测诊断得以快速并高通量的实现。qpcr特异性强，灵敏度高，可以定量对病原体进行检测，并很好的实现高通量检测，但热循环过程需要热循环仪。热循环仪体积大、价格较高，时间也相对较长，使其在基层的推广和现场检测受到了极大的限制。恒温扩增技术的基本原理和反应成分各不相同，但本质上要解决的核心难题是使新合成的dna模板在恒定的温度下退火变性进而引发进一步的扩增反应，这使得恒温扩增技术具备检测快速、价格低廉等优势，而在及时现场检测(point of care)。
3.心梗和心衰生心血管病的主要死亡因素之一，在中国心血管病涉及3亿多人口，平均每个家庭1.5位，每13秒致残1人，28秒致死1人。2015年，我国心血管医药费用高达2930亿。由此可见，心脑血管疾病给人们身体健康和社会经济造成了极大损失。
4.临床上目前主要检测血浆mpo水平与心血管异常的发生情况如心梗，脑梗和死亡的关系，此外还有肌钙蛋白，肌红蛋白和肌酸激酶(ck)及肌酸激酶同工酶(ck—mb))等等，此类生物标记物主要发生在心肌受损和心学管症状的临床中晚期，对于心血管疾病的早期，目前尚无有效特异的早期心血管疾病的诊断方法和生物标记物。而且，检测的方法还是以酶联免疫标记和免疫发光技术为主，缺乏新颖的基因分子生物学方法。
5.目前酶联免疫标记和免疫发光技术的主要问题是特异性不够高，此外，肌钙蛋白，肌红蛋白和肌酸激酶(ck)及肌酸激酶同工酶(ck—mb))等标记物只能够检测到中晚期的病人，对早期心梗缺少有效性和特异性，况且检测的手断很难做到床边诊断poct。
技术实现要素：6.本发明的主要目的是提供基于等温核酸扩增qpcr技术的心梗危险因素检测方法及其pcr，为心血管疾病的早期诊断提供快速特异的新的诊断方法，减少患病人群的死亡。
7.在血液异常流变的状态下(如高血脂，高甘有三脂)，可以激活xbp-1s和旁路剪切，导致血管内皮细胞调亡和动脉粥样硬化的发展，根据我们的外显子ngs测序数据分析，我们已经确定了两个与急性心肌梗死(ami)和冠状动脉疾病(cad)相关的差异表达基因pde4dip和ahnak。
8.ahnak是基因编码的ahnak核蛋白，是一种与肿瘤相关的磷蛋白，调节心脏中的l型钙通道11。l型钙通道与β2亚单位相互作用，ahnak的结合控制β2亚单位激活心脏l型钙通道的可用性；钙离子(ca2+)通过l型ca2+通道流入将触发心脏动作电位并驱动心肌收缩12,13；心肌收缩力是心脏产生收缩力的能力。研究表明，与健康人相比，ami患者的心脏收缩力更高14；chabiniok等人通过开发生物力学猪心模型发现急性心肌梗死后心肌梗死偏远区域的心肌收缩力增加15；另一方面，l型钙通道还通过控制钙离子流入细胞以响应细胞膜上的电压差来调节冠状动脉的舒张；研究表明，这些缺乏钙通道的基因敲除小鼠的冠状动脉收缩，心脏中有纤维组织；因此，我们推测ahnak基因与急性心肌梗死(ami)和冠状动脉疾病(cad)有关。
9.pde4dip是一种基因编码的肌球蛋白，主要表达于心肌16。肌巨蛋白是一种高尔基体相关蛋白，与pde4d相互作用，pde4d是磷酸水解酶家族的成员，通过磷酸化心肌肌球蛋白结合蛋白-c(cmybpc)和心肌肌钙蛋白(ctni)17,18来调节心肌收缩力；正如gao等人所报道的，急性心肌梗死后的心肌收缩力远高于对照心脏19，因为pde4dip是心肌收缩力的关键基因，因此我们推测pde4dip与急性心肌梗死(ami)有关。
10.本发明针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物(包括2条内引物和2条外引物)，利用一种具有链置换特性的bst dna聚合酶，在等温条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列，其反应过程包括哑铃状模板合成阶段、循环扩增阶段、伸长和再循环阶段。其基本原理是靶dna变性后，内外引物在bst dna聚合酶作用下延伸，随后外引物进行延伸，同时其延伸产物将内引物的延伸产物置换出来，形成一个哑铃状的dna，然后进入循环扩增阶段，不断延伸和扩增，最终形成茎环结构和多环花椰菜样结构的dna片段混合物。
11.本发明设计和实验了ahnak和pde4d核酸探针能够在很短的时间内的检测心血管疾病疾病状态下基因心梗心衰标志物，以此项技术设计的试剂盒可以用于心血管疾病的早期快速诊断，当血管内皮细胞获心肌细胞处于异常血流压力，高血脂蛋白或心肌细胞受损细胞紧张时，通过检测血液中心肌肌钙蛋白的磷酸化情况和心肌细报钙离子通道的情况，以及联合检测其他传通的心梗心衰诊断标志物如肌红蛋白通路上分子的变化，可以早期诊断和预测心学管疾病特别是心梗和脑梗的风险。
附图说明
12.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
13.图1为本发明实施例提供的lamp技术原理示意图；
14.图2为本发明实施例提供的核酸等温扩增的曲线图；
15.图3为本发明实施例提供的核酸扩增结果图。
16.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
17.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
18.另外，在本发明中涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
19.本发明通过第一批45例心梗心衰患者的外周血样本与正常对照人群样本外显子测序，总共发现5个与急性心梗和心衰相关的基因其中两个基因，通过对这两个高表达基因设计核酸基因探针和荧光标记物，来检测这两个新的潜在的急性心梗和心衰的基因标志物。
20.我们团队通过对我们用急性心梗和心衰外显子测序实验筛选出来的同时在心梗和心衰方面差异化表达出的pde4dip基因和ahnak基因为全新的心梗和心衰基因，是基于中国人群患者发现的，我们的发现不是基于染色体片段相关，而是基因外显资全序列测序得到的，在转化应用上更具有应用价值，我们设计了序列设计的探针，做为心梗和心衰早期诊断的探索性的方法。
21.在血液异常流变的状态下(如高血脂，高甘有三脂)，可以激活xbp-1s和旁路剪切，导致血管内皮细胞调亡和动脉粥样硬化的发展，根据我们的外显子ngs测序数据分析，我们已经确定了两个与急性心肌梗死(ami)和冠状动脉疾病(cad)相关的差异表达基因pde4dip和ahnak。其中ahnak与调节心脏中的l型钙通道相关,而pde4dip基因通过磷酸化心肌肌球蛋白结合蛋白-c(cmybpc)和心肌肌钙蛋白(ctni)来调节心肌收缩力,是心肌动力的关健调节元素之一。
22.ahnak是基因编码的ahnak核蛋白，是一种与肿瘤相关的磷蛋白，调节心脏中的l型钙通道11。l型钙通道与β2亚单位相互作用，ahnak的结合控制β2亚单位激活心脏l型钙通道的可用性；钙离子(ca2+)通过l型ca2+通道流入将触发心脏动作电位并驱动心肌收缩12,13；心肌收缩力是心脏产生收缩力的能力。研究表明，与健康人相比，ami患者的心脏收缩力更高14；chabiniok等人通过开发生物力学猪心模型发现急性心肌梗死后心肌梗死偏远区域的心肌收缩力增加15；另一方面，l型钙通道还通过控制钙离子流入细胞以响应细胞膜上的电压差来调节冠状动脉的舒张；研究表明，这些缺乏钙通道的基因敲除小鼠的冠状动脉收缩，心脏中有纤维组织；因此，我们推测ahnak基因与急性心肌梗死(ami)和冠状动脉疾病
(cad)有关。
23.pde4dip是一种基因编码的肌球蛋白，主要表达于心肌16。肌巨蛋白是一种高尔基体相关蛋白，与pde4d相互作用，pde4d是磷酸水解酶家族的成员，通过磷酸化心肌肌球蛋白结合蛋白-c(cmybpc)和心肌肌钙蛋白(ctni)17,18来调节心肌收缩力；正如gao等人所报道的，急性心肌梗死后的心肌收缩力远高于对照心脏19，因为pde4dip是心肌收缩力的关键基因，因此我们推测pde4dip与急性心肌梗死(ami)有关。
24.通过对相关等数据库的搜索和分析，我们发现ahnak有一个转录异体基因ahnak2，但是这个基因在14号染色体上，可能与心梗心衰无关。我们对ahnak的全基因序列做了调去，发现基因很大，其长度达到了18761个核苷酸。根据我们对序列的分析，我们用primer3软件设计出下列4对核酸探针，用于临床样本测试。
25.ahnak核酸探针序列1
[0026][0027]
ahnak核酸探针序列2
[0028][0029][0030]
ahnak核酸扩增检测方法：
[0031]
体系1：
[0032][0033]
体系2：
[0034][0035]
将体系1在70℃水浴5min后，冰浴2min后，与体系2混合，于37℃15min，42℃60min，70℃10min。
[0036]
结果判断：ahnak基因在我们急性心梗和心衰的45例病人中有显著性差异性高表达(如图3所示)。
[0037]
我们发现的pde4dip基因是位于人类1号染色体的一个具有众多功能的一个基因，主要参与细胞微管形成和细胞内高尔基体相关的功能。通过基因组学功能分析，我们也设计了相关基因表达的核酸探针和引物。
[0038]
然后我们采用了primer3软件设计了相应的基因表达引物做临床验正,设计的2对引物如下:
[0039]
pde4dip基因核酸探针序列1
[0040][0041]
pde4dip基因核酸探针序列2
[0042][0043]
pde4dip核酸扩增检测方法：
[0044]
体系1：
[0045][0046]
体系2：
[0047][0048]
将体系1在70℃水浴5min后，冰浴2min后，与体系2混合，于37℃15min，42℃60min，70℃10min。等温扩增的具体方法我们根据实际情况实施。
[0049]
结果判断：pde4dip基因在我们急性心梗和心衰的45例病人中有显著性差异性高表达(如图3所示)。
[0050]
在上述实施例中，针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物(包括2条内引物和2条外引物)，利用一种具有链置换特性的bst dna聚合酶，在等温条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列，其反应过程包括哑铃状模板合成阶段、循环扩增阶段、伸长和再循环阶段。其基本原理(如图1所示)是靶dna变性后，内外引物在bst dna聚合酶作用下延伸，随后外引物进行延伸，同时其延伸产物将内引物的延伸产物置换出来，形成一个哑铃状的dna，然后
进入循环扩增阶段，不断延伸和扩增，最终形成茎环结构和多环花椰菜样结构的dna片段混合物。
[0051]
lamp的优点包括：(1)lamp有较高的特异性和抗干扰能力，只有当2对引物与目的片段的6个区域都匹配上时才能进行扩增；(2)lamp的反应体系稳定可靠，在室温下放置2周后仍然稳定，并且对于样品中原有或污染的无关、干扰片段依然不敏感，而其他类似技术则无法做到这一点；(3)lamp的敏感性较高，扩增快速、高效；(4)lamp结果的鉴别很简便，用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度就能判断扩增与否。因此，只要引物设计正确，并且完善各种反应条件，lamp对于样品处理、操作技术和仪器设备的要求都比较低，特别适合在基层医疗机构中应用。lamp的缺点包括由于lamp扩增时链置换合成，靶序列长度最好在300bp以内，大于500bp则较难扩增，故不能进行长链dna的扩增；由于其灵敏度高，操作过程中极易受到污染而产生假阳性结果，故实验过程中要特别注意严谨操作。
[0052][0053]
我们通过核酸扩增技术转化到我们课题的心血管基因检测之中，在检测速度上可以达到15分钟检测出相应的心血管疾病的基因，其准确度也达到了要求，可以识别单个核核酸碱基的变化。
[0054]
采用2种荧光通道，对目标基因和对照基因进行扩增，扩增效果很理想，可以抗扩增过程中的杂质和干扰因素。核酸等温扩增的曲线清析，荧光标记明确，无干扰(如图2所示)。
[0055]
区别于传统的免疫荧光方法，此项分子诊断专有技术能够为早期诊断心血管疾病的异常在早期未出现临床症状之前提供一种具有临床诊断意义的检测方法。鉴于心血管疾病是全世界范围内头号死亡病种，涉及人口数非常旁大，这项诊断技术具用非常广阔的市场前景。我们设计的核酸扩增检测方法可以特异敏感的检测心肌细胞钙离子通道的早期变化，采用大多数地市级医院检验科室都有的qpcr方法,方便快捷,操作简单标准,试剂已全部能够生产,全部诊断方法可以在基层医疗单位应用,价格也在大众可以接受的范围。
[0056]
以国内目前3亿人口患有心血管疾病的患者人口数量和更多的亚健康人群，医疗服务和临床方面急需这方面的检测方法和平台，本项发明和专有技术提供了一项新颖敏感和特异的技术以期对早期心血管疾病做筛查和诊断的核酸探针标志物，具有巨大的潜在的转化应用和市场价值。
[0057]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.基于等温核酸扩增qpcr技术的心梗危险因素检测方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、计出4对ahnak核酸探针；s2、ahnak核酸扩增检测；s3、设计的2对pde4dip引物；s4、pde4dip核酸扩增检测。2.根据权利要求1所述的基于等温核酸扩增qpcr技术的心梗危险因素检测方法，其特征在于：在所述的s1中，4对ahnak核酸探针包括：ahnak核酸探针序列1ahnak核酸探针序列23.根据权利要求1所述的基于等温核酸扩增qpcr技术的心梗危险因素检测方法，其特征在于：在所述的s2中，扩增检测方法包括：体系1：体系1：体系2：将体系1在70℃水浴5min后，冰浴2min后，与体系2混合，于37℃15min，42℃60min，70℃10min。4.根据权利要求1所述的基于等温核酸扩增qpcr技术的心梗危险因素检测方法，其特征在于，在所述的s3中，包括：pde4dip基因核酸探针序列1
pde4dip基因核酸探针序列25.根据权利要求1所述的基于等温核酸扩增qpcr技术的心梗危险因素检测方法，，其特征在于，在所述的s4中，扩增检测方法包括：体系1：体系1：体系2：将体系1在70℃水浴5min后，冰浴2min后，与体系2混合，于37℃15min，42℃60min，70℃10min。等温扩增的具体方法我们根据实际情况实施。6.基于等温核酸扩增qpcr技术的心梗危险因素检测pcr，其特征在于，针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物(包括2条内引物和2条外引物)，利用一种具有链置换特性的bst dna聚合酶，在等温条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列，其反应过程包括哑铃状模板合成阶段、循环扩增阶段、伸长和再循环阶段；靶dna变性后，内外引物在bst dna聚合酶作用下延伸，随后外引物进行延伸，同时其延伸产物将内引物的延伸产物置换出来，形成一个哑铃状的dna，然后进入循环扩增阶段，不断延伸和扩增，最终形成茎环结构和多环花椰菜样结构的dna片段混合物。
技术总结本发明公开的基于等温核酸扩增qPCR技术的心梗危险因素检测方法及其PCR，本发明设计和实验验证了合适长度的核酸探针能够在很短的时间内的检测心血管疾病疾病状态下基因心梗和心衰早期发病情况，设计的核酸扩增检测方法可以特异敏感的检测心肌细胞钙离子通道的早期变化，采用大多数地市级医院检验科室都有的qPCR方法,方便快捷,操作简单标准,试剂已全部能够生产,全部诊断方法可以在基层医疗单位应用,价格也在大众可以接受的范围。应用,价格也在大众可以接受的范围。应用,价格也在大众可以接受的范围。
技术研发人员：杨海涛 廖晓星 梁誉斌
受保护的技术使用者：中山大学深圳研究院
技术研发日：2022.05.26
技术公布日：2022/11/1
