1.本发明属于药物领域，具体涉及一种多功能水凝胶及其制备方法。
背景技术：2.骨肉瘤(osteosarcoma)是一种青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤，恶性程度高，进展快，且易发生远端转移，其常见特征是肿瘤细胞形成不成熟骨或骨样组织，占所有骨肿瘤的20-40％。骨肉瘤全球发病率约为3/100万，存在两个高峰，第一个高峰发生在骨骼快速生长的青春期，发病率约为4.4/100万，第二个高峰则发生在65岁以上的老年人中，发病率约为4.2/100万。骨肉瘤最常发生在靠近生长板的长骨干骺端，2/3的肿瘤出现在股骨远端膝关节周围，其次是胫骨近端，肱骨近端是第三常见的肿瘤部位，占肿瘤总数的10％，骨肉瘤患者通常表现为发病部位局部肿胀或疼痛，给患者带来巨大的疼痛和生活的不便，特别是发生在膝关节附近的肿瘤，肿胀和疼痛使患者无法正常行走。目前治疗骨肉瘤的给药方案因为静脉给药的方式，会带来全身的毒性，不利于对患者的治疗。
3.水凝胶作为一种可以原位注射的生物材料，具有优异的生物相容性，不仅可以实现在肿瘤部位的持续给药，还因其结构与细胞外基质相似，可以为细胞生长提供适宜的生长环境，满足骨肉瘤治疗过程中对消除肿瘤的需要。因此，水凝胶体系在骨肉瘤的治疗中受到越来越多的关注。考虑到生物相容性，聚乙烯醇(pva)是一个合适的制备水凝胶的材料，物理交联法不添加化学交联剂，更加安全，但是其制备工艺耗时长，需要改善。大黄酸(rh)作为一种中药成分，具有较好的抗炎和抗肿瘤功能，其自组装可形成水凝胶，但是稳定性较差。
4.为了能够应对骨肉瘤目前的治疗瓶颈，设计一种能缓慢释放药物，有效杀伤肿瘤细胞、对正常组织无害、不依赖于成胶时间的剪切变稀性多功能水凝胶体系是很有必要的。
技术实现要素：5.为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种多功能水凝胶，该水凝胶通过将pva与大黄酸按质量比进行复合，形成pva与大黄酸交联的网络体系，克服现有治疗骨肉瘤的制剂所存在的不足，具有制备工艺简单，可注射性、单次注射缓释性、优良载药性的多功能水凝胶体系，能够在手术前，通过原位单次注射载药水凝胶，使得药物在肿瘤附近有效蓄积，并在长达两周的时间内缓慢释放，有效抑制肿瘤的生长，减少肿瘤的体积。
6.本发明的第二个目的是提供一种多功能水凝胶的制备方法，本发明提高了水凝胶的机械强度，并且载药范围广，载入不同的药物就可以起到不同的治疗效果。因此，应用此方法制备的多功能水凝胶体系，可以有效减少肿瘤大小，降低对患者的伤害，对患者的治疗具有显著的意义。
7.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
8.第一方面，本发明保护一种多功能水凝胶，主要由pva和大黄酸(rh)组成，按照质量比pva：大黄酸＝0.2～2g：10～100mg，优选为0.48～1.5g：36～72mg，更优选为0.64～
1.2g：36～72mg。
9.本发明将pva与大黄酸交联形成的pva/rh水凝胶具有三维网状结构，可以高效负载药物分子、控制药物分子的释放速度，进而达到在较长一段时间内抑制肿瘤复发的效果。
10.作为本技术的优选技术方案，所述水凝胶中还添加有化疗药物和/或促进骨修复的材料；
11.当水凝胶中仅添加有化疗药物时，按照质量比pva：大黄酸：化疗药物＝0.2～2g：10～100mg：5～35mg，优选为0.64～1.2g：36～72mg：10～25mg；
12.当水凝胶中仅添加有促进骨支撑的材料时，按照质量比pva：大黄酸：促进骨支撑的材料＝0.2～2g：10～100mg：2～20mg；优选为0.64～1.2g：36～72mg：5～15mg。
13.当水凝胶中添加有化疗药物和促进骨支撑的材料时，按照质量比pva：大黄酸：化疗药物：促进骨支撑的材料＝0.2～2g：10～100mg：5～35mg：2～20mg；优选为0.64～1.2g：36～72mg：10～25mg：5～15mg。
14.本发明保护一种用于骨肉瘤治疗的可注射水凝胶，包括：pva与大黄酸水凝胶以及化疗药物；其中，按照质量比pva：大黄酸：化疗药物＝0.2～2g：10～100mg：5～35mg，优选为0.64～1.2g：36～72mg：10～25mg。
15.本发明保护一种用于骨肉瘤治疗和促进骨修复的骨支撑性水凝胶，包括：pva与大黄酸水凝胶、化疗药物、以及促进骨支撑的材料；其中，按照质量比pva：大黄酸：化疗药物：促进骨支撑的材料＝0.2～2g：10～100mg：5～35mg：2～20mg；优选为0.64～1.2g：36～72mg：10～25mg：5～15mg。
16.作为本技术的优选技术方案，所述化疗药物为盐酸阿霉素，阿霉素，阿苯达唑中的任意一种或多种，优选为盐酸阿霉素。
17.作为本技术的优选技术方案，所述促进骨支撑的材料为纳米羟基磷灰石。
18.作为本技术的优选技术方案，所述pva分子量为：89000-98000，如89000，90000，91000，92000，93000，94000，95000，96000，97000，98000等等。
19.可选的，所述水凝胶材料表面和/或内部负载有用于治疗骨肉瘤的药物。
20.第二方面，本发明还保护前述多功能水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
21.步骤1，制备pva溶液：将pva分散于水中，在加热条件下搅拌，使其完全溶解，形成均一的溶液；其中，pva水溶液中，pva的质量浓度为4-20％，优选为8-15％，可以为8％，10％，12％，15％等；
22.步骤2，制备大黄酸溶液；将大黄酸溶解在碱性溶液中，使其完全溶解，然后使用盐酸调节ph到8.0-9.4，优选为8.8-9.0；盐酸的浓度为：1mmol/l-5mmol/l；
23.步骤3，将步骤(2)的大黄酸溶液加入步骤(1)所述的pva溶液中，搅拌均匀后超声；
24.步骤4，在-80℃冰箱冷冻1小时后取出，37℃水浴锅水浴融解30min，此为一个冻融循环。
25.本发明将pva与大黄酸结合，两种物质形成凝胶网络时互穿，形成互穿网络，1次冻融即可形成水凝胶，不仅缩短了制备时间，并且使得水凝胶具有很好的机械性能。
26.本发明还保护前述用于骨肉瘤治疗的可注射水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
27.步骤1，制备pva溶液：将pva分散于水中，在加热条件下搅拌，使其完全溶解，形成均一的溶液；其中，pva水溶液中，pva的质量浓度为4-20％，优选为8-15％，可以为8％，
10％，12％，15％等；
28.步骤2，制备大黄酸溶液；将大黄酸溶解在碱性溶液中，使其完全溶解，然后使用盐酸调节ph到8.0-9.4，优选为8.8-9.0；盐酸的浓度为：1mmol/l-5mmol/l；
29.步骤3，制备盐酸阿霉素溶液：将盐酸阿霉素分散在步骤1所述的pva水溶液，搅拌或超声使其溶解；其中，盐酸阿霉素的质量浓度为0.01-3mg/ml；
30.步骤4，将步骤2所述的大黄酸溶液加入到步骤3所述的盐酸阿霉素溶液中，此过程伴随着搅拌，搅拌均匀后超声30～60min；
31.步骤5，在-20℃～-80℃冰箱冷冻1小时后取出，37℃水浴锅水浴融解30min，此为一个冻融循环；其中，此冻融循环从1次-8次，优选为1-7次，更优选为4～6次。
32.本发明还保护一种用于骨肉瘤治疗和促进骨修复的骨支撑性水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
33.步骤1，制备pva溶液：将pva分散于水中，在加热条件下搅拌，使其完全溶解，形成均一的溶液；其中，pva水溶液中，pva的质量浓度为4-20％，优选为8-15％，可以为8％，10％，12％，15％等；
34.步骤2，制备纳米羟基磷灰石溶液：取纳米羟基磷灰石，使用盐酸溶解，盐酸的浓度为：1mmol/l-5mmol/l，纳米羟基磷灰石的质量浓度为：0.1-167mg/ml；
35.步骤3，制备大黄酸溶液；将大黄酸溶解在碱性溶液中，使其完全溶解，然后使用盐酸调节ph到8.0～9.4，优选为8.8～9.0；其中，盐酸为步骤2溶解纳米羟基磷灰石后得到的盐酸溶液；
36.步骤4，制备盐酸阿霉素溶液：将盐酸阿霉素分散在步骤1所述的pva水溶液，搅拌或超声使其溶解；其中，盐酸阿霉素的质量浓度为0.01-3mg/ml；
37.步骤5，制备协同骨肉瘤治疗和骨支撑性水凝胶：将大黄酸溶液加入到盐酸阿霉素溶液中，此过程伴随着搅拌，搅拌均匀后超声30～60min；
38.步骤6，在-20～-80℃冰箱冷冻1小时后取出，37℃水浴锅水浴融解30min，此为一个冻融循环；其中，此冻融循环从1次-8次，优选为1-7次，更优选为4～6次。
39.作为本技术的优选技术方案，所述步骤1中，加热温度为：80～100℃优选为95-100℃，更优选为97℃；加热搅拌时间为：20min～1h。
40.作为本技术的优选技术方案，大黄酸溶液制备中，大黄酸的质量浓度为4-25mg/ml，优选为4～10mg/ml，所述碱性溶液中的碱为氢氧化钠，碳酸钠或碳酸氢钠的任一种。
41.作为本技术的优选技术方案，前文所述的冻融循环次数从1次-8次，优选为1-6次，可以为1次，2次，3次，4次，5次，6次。
42.本发明还保护前文所述的制备方法制备得到的水凝胶。
43.本发明还保护前文所述的水凝胶在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
44.本发明还保护前文所述的水凝胶在制备治疗肿瘤和/或促进骨修复的药物中的应用。
45.作为本技术的优选技术方案，所述肿瘤为骨肉瘤。
46.有益效果
47.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
48.(1)pva水凝胶需经过多次冻融，通过增强氢键，形成水凝胶。但是本发明将pva与
大黄酸结合，两种物质形成凝胶网络时互穿，形成互穿网络，同时大黄酸钠盐的盐析作用，减少pva分子链间的间距，增加氢键的形成，从而1次冻融即可形成水凝胶，不仅缩短了制备时间，并且使得水凝胶具有很好的机械性能；
49.(2)本发明将pva与大黄酸交联形成的pva/rh水凝胶具有三维网状结构，可以高效负载药物分子、控制药物分子的释放速度，进而达到在较长一段时间内抑制肿瘤复发的效果；
50.(3)本发明pva/rh水凝胶能够负载药物，载入化疗药物盐酸阿霉素，骨修复药物纳米羟基磷灰石，盐酸阿霉素能够有效杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长，同时大黄酸也具有抑制肿瘤生长，降低盐酸阿霉素多药耐药的效果，二者结合能够协同应用于骨肉瘤的治疗。纳米羟基磷灰石可以针对骨肉瘤造成的骨缺损过程进行治疗，通过增加冻融次数，可以使水凝胶网络机械性能增强，起到对缺损部位的支撑效果，有效防止骨折等更严重骨缺损情况的发生。
51.(4)本发明pva/rh水凝胶能够通过改变冻融次数，制备出不同的机械强度的水凝胶，从而应用于不同的治疗要求。
附图说明
52.图1为pva质量分数对水凝胶形成影响进行了验证。
53.图2为是否加入rh对形成水凝胶的影响进行验证。
54.图3为pva质量分数和rh的加入对形成水凝胶的影响。
55.图4为通过正交实验对pva/rh/dox(prd)水凝胶制备条件的筛选。
56.图5为prd水凝胶体系的正交实验结果表。
57.图6为本发明pva/rh/dox水凝胶的sem实验结果图。
58.图7为本发明pva/rh/dox/nha水凝胶支架材料的sem实验结果图。
59.图8为本发明pva/rh/dox水凝胶的图例和可注射性。
60.图9为本发明pva/rh/dox/nha水凝胶支架材料的支撑能力验证。
61.图10为pva/rh/dox/nha水凝胶支架材料的拉伸和压缩的性能测试。
62.图11为pva/rh/dox水凝胶在骨肉瘤细胞k7m2细胞上的细胞毒性实验结果图，其中，图a，b，c，d分别为pva，pva/dox，pva/rh，pva/rh/dox与k7m2细胞共孵育24h和48h后的细胞毒性。
63.图12为pva/rh/dox水凝胶在骨肉瘤细胞k7m2细胞上的流式凋亡结果图。
64.图13为pva/rh/dox水凝胶在骨肉瘤模型小鼠上的药效学结果图。
65.图14为pva/rh/dox水凝胶在骨肉瘤模型小鼠上的肿瘤体积变化结果图。
具体实施方式
66.以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
67.本发明首先提供了一种多功能水凝胶，该水凝胶通过将pva与大黄酸按质量比2～20g：10～100mg进行复合，形成pva与大黄酸交联的网络体系。
68.可选的，所述的水凝胶可以单独承载不同的药物，也可以承载不同的双药组合，和三药组合等。可选的如加载：盐酸阿霉素，纳米羟基磷灰石，盐酸阿霉素和纳米羟基磷灰石
等。
69.聚乙烯醇(pva)以其无毒性，良好生物相容性，生物降解性，高机械强度等特点已经被用于药物递送装置，人工器官，伤口敷料，隐形眼镜，抗菌，皮肤护理系统，蛋白质吸附，蛋白质控制释放等领域，且经美国食品和药物管理局批准可用于临床应用。其与大黄酸自组装交联形成的prd水凝胶具有三维网状结构，三维网状结构的表面和/或内部能够负载抗肿瘤药物，并且负载的药物能够持续释放，解决了小分子药物快速扩散的问题，缓解了化疗药物的强副作用。此外，与需要预成型的硬质支架相比，软质水凝胶可塑性好，可以填充于任何不规则形状的框架中，可以通过1ml注射器的针头，实现可注射性能。
70.大黄酸(rhein,4.5-dihydroxy anthraquinone,简称rh)属单蒽核类1,8-二羟基蒽醌衍生物，是从大黄、何首乌、虎杖等多种传统中药分离提纯出的有效成分。rh的结构式，rh含有二个羟基和一个羧基，极性较强，具有电化学氧化还原性质。国内已有报道：以中药单体大黄酸为凝胶因子，在nahco3溶液中利用π-π键、氢键、离子键、疏水作用等非共价键作用通过自组装形成具有三维网状结构的大黄酸超分子水凝胶。此述的大黄酸水凝胶的凝胶形态不够稳定，不能完成载药的性能。pva的冷冻过程中聚合物的浓缩和紧密堆积为随后盐析诱导的强烈聚集和结晶准备了聚合物链，柠檬酸的钠盐可以通过盐析相分离，强烈诱导pva的聚集和结晶以形成纳米原纤。大黄酸在合适的ph也可以形成钠盐，以大黄酸钠盐的形式促进pva分子链的聚集，帮助pva形成水凝胶。
71.盐酸阿霉素属于抗生素类，分子式为c
27h29
no
11
·
hci，它是一种橙红色疏松状块状物或粉末，易溶于水、dmso、四氢呋喃、醇，不溶于丙酮、氯仿、苯、乙醚。它是一种抗肿瘤抗生素，通过抑制癌细胞遗传物质核酸的合成，且抗瘤谱较广，对多种肿瘤细胞均有杀灭作用。
72.羟基磷灰石(hydroxyapatite，ha)是脊椎动物骨骼和牙齿的主要无机矿物成分，由六方柱状单晶构成，分子式为ca
10
(po4)6(oh)2，微溶于纯水，呈弱碱性(ph值7～9)，易溶于酸而难溶于碱。羟基磷灰石在化学上类似于自然骨，具有一定的韧性与机械强度、分布均匀的孔隙结构、比表面积大，具备良好的负载药物与生物活性因子的能力，是理想的骨组织工程支架材料，但是很难移植到不规则的骨缺损区，降解性能较差。为了克服水凝胶及羟基磷灰石的局限性，将水凝胶与羟基磷灰石混合形成稳定的支架结构，有望得到符合要求的骨组织工程支架。
73.本发明将pva水凝胶与大黄酸水凝胶复合，pva/rh水凝胶能够负载药物，通过载入不同治疗用途的药物，改变冻融次数，可以制备出协同骨肉瘤治疗和骨支撑水凝胶材料(pva/rh/dox，pva/rh/dox/nha支架材料)，该材料具有三维网络的多孔结构，可以包覆药物，模拟细胞外基质，有利于细胞增殖、迁移和分化，可作为一种较为理想的组织工程支架材料。同时，本发明还进一步对pva/rh/dox水凝胶材料进行了肿瘤杀伤能力评估，结果显示该材料可以作为理想的骨肉瘤治疗材料。
74.下面结合实例对本发明作进一步的解释。应当理解的是，以下实例仅用于解释本发明，而不是限制本发明的保护范围。
75.实施例1水凝胶pva/rh的制备
76.(1)制备pva溶液：取pva0.96g，置于烧杯中，加入8ml纯水，将烧杯放置在加热搅拌装置上，在97℃加热条件下，400/min搅拌30min使其完全溶解，形成均一的溶液(质量浓度分别为4％，6％，8％，10％，12％，15％)。
77.(2)制备大黄酸溶液；取大黄酸36mg，溶解于浓度为0.5mol/l的naoh溶液中，使用2.5mmol/l盐酸调节ph到：8.8-9.0。
78.(3)将步骤(2)的大黄酸溶液加入步骤(1)所述的pva溶液中，搅拌10min，25℃超声30min。
79.(4)在-80℃冰箱冷冻1小时后取出，37℃水浴锅水浴融解30min，此为一个冻融循环。
80.对比例1
81.其他同实施例1，不同点在于，本对比例未添加大黄酸，仅制备pva空白水凝胶，且pva溶液的质量分数分别为4％，6％，8％，10％，12％，15％。
82.实验例2用于治疗骨肉瘤的原位可注射水凝胶pva/rh/dox的制备
83.(1)制备pva溶液：取pva0.96g，置于烧杯中，加入8ml纯水，将烧杯放置在加热搅拌装置上，在97℃加热条件下，400/min搅拌30min使其完全溶解，形成均一的溶液。
84.(2)制备大黄酸溶液；取大黄酸36mg，溶解于浓度为0.5mol/l的naoh溶液中，使用2.5mmol/l盐酸调节ph到：8.8-9.0。
85.(3)制备盐酸阿霉素溶液：取盐酸阿霉素25mg，溶解在8ml步骤(1)所述的pva水溶液中，搅拌15min使其溶解。
86.(4)将步骤(2)所述的大黄酸溶液加入到步骤(3)所述的盐酸阿霉素溶液中，此过程伴随着搅拌。搅拌10min，使溶液混合均匀后，25℃超声30min。
87.(5)在-80℃冰箱冷冻1小时后取出，37℃水浴锅水浴融解30min，此为一个冻融循环。完成一个冻融循环就可以得到具有通针性的可注射凝胶pva/rh/dox支架。
88.在其他的实施例中，冻融循环还可以为2次，3次，4次，5次，6次，7次，8次。
89.实验例3用于治疗骨肉瘤的原位可注射水凝胶pva/rh/dox的制备
90.(1)制备pva溶液：取pva0.96g，置于烧杯中，加入8ml纯水，将烧杯放置在加热搅拌装置上，在97℃加热条件下，400/min搅拌30min使其完全溶解，形成均一的溶液。
91.(2)制备大黄酸溶液；取大黄酸72mg，溶解于浓度为0.5mol/l的naoh溶液中，使用2.5mmol/l盐酸调节ph到：8.8-9.0。
92.(3)制备盐酸阿霉素溶液：取盐酸阿霉素20mg，溶解在8ml步骤(1)所述的pva水溶液中，搅拌15min使其溶解。
93.(4)将步骤(1)所述的大黄酸溶液加入到盐酸阿霉素溶液中，此过程伴随着搅拌。搅拌10min，使溶液混合均匀后，25℃超声30min。
94.(5)在-80℃冰箱冷冻1小时后取出，37℃水浴锅水浴融解30min，此为一个冻融循环。完成一个冻融循环就可以得到具有通针性的可注射凝胶pva/rh/dox支架。
95.在其他的实施例中，冻融循环还可以为2次，3次，4次，5次，6次，7次，8次。
96.实验例4用于治疗骨肉瘤的原位可注射水凝胶pva/rh/dox的制备
97.(1)制备pva溶液：取pva0.96g，置于烧杯中，加入8ml纯水，将烧杯放置在加热搅拌装置上，在97℃加热条件下，400/min搅拌30min使其完全溶解，形成均一的溶液。
98.(2)制备大黄酸溶液；取大黄酸36mg，溶解于浓度为0.5mol/l的naoh溶液中，使用2.5mmol/l盐酸调节ph到：8.8-9.0。
99.(3)制备盐酸阿霉素溶液：取盐酸阿霉素15mg，溶解在8ml步骤(1)所述的pva水溶
液中，搅拌15min使其溶解。
100.(4)将步骤(1)所述的大黄酸溶液加入到盐酸阿霉素溶液中，此过程伴随着搅拌。搅拌10min，使溶液混合均匀后，25℃超声30min。
101.(5)在-80℃冰箱冷冻1小时后取出，37℃水浴锅水浴融解30min，此为一个冻融循环。完成一个冻融循环就可以得到具有通针性的可注射凝胶pva/rh/dox支架。
102.在其他的实施例中，冻融循环还可以为2次，3次，4次，5次，6次，7次，8次。
103.实验例5用于治疗骨肉瘤的原位可注射水凝胶pva/rh/dox的制备
104.(1)制备pva溶液：取pva0.96g，置于烧杯中，加入8ml纯水，将烧杯放置在加热搅拌装置上，在97℃加热条件下，400/min搅拌30min使其完全溶解，形成均一的溶液。
105.(2)制备大黄酸溶液；取大黄酸36mg，溶解于浓度为0.5mol/l的naoh溶液中，使用2.5mmol/l盐酸调节ph到：8.8-9.0。
106.(3)制备盐酸阿霉素溶液：取盐酸阿霉素10mg，溶解在8ml步骤(1)所述的pva水溶液中，搅拌15min使其溶解。
107.(4)将步骤(1)所述的大黄酸溶液加入到盐酸阿霉素溶液中，此过程伴随着搅拌。搅拌10min，使溶液混合均匀后，25℃超声30min。
108.(5)在-80℃冰箱冷冻1小时后取出，37℃水浴锅水浴融解30min，此为一个冻融循环。完成一个冻融循环就可以得到具有通针性的可注射凝胶pva/rh/dox支架。
109.在其他的实施例中，冻融循环还可以为2次，3次，4次，5次，6次，7次，8次。
110.实验例6用于治疗骨肉瘤的原位可注射水凝胶pva/rh/dox的制备
111.(1)制备pva溶液：取pva0.8g，置于烧杯中，加入8ml纯水，将烧杯放置在加热搅拌装置上，在97℃加热条件下，400/min搅拌30min使其完全溶解，形成均一的溶液。
112.(2)制备大黄酸溶液；取大黄酸36mg，溶解于浓度为0.5mol/l的naoh溶液中，使用2.5mmol/l盐酸调节ph到：8.8-9.0。
113.(3)制备盐酸阿霉素溶液：取盐酸阿霉素25mg，溶解在8ml步骤(1)所述的pva水溶液中，搅拌15min使其溶解。
114.(4)将步骤(1)所述的大黄酸溶液加入到盐酸阿霉素溶液中，此过程伴随着搅拌。搅拌10min，使溶液混合均匀后，25℃超声30min。
115.(5)在-80℃冰箱冷冻1小时后取出，37℃水浴锅水浴融解30min，此为一个冻融循环。完成一个冻融循环就可以得到具有通针性的可注射凝胶pva/rh/dox支架。
116.在其他的实施例中，冻融循环还可以为2次，3次，4次，5次，6次，7次，8次。
117.实验例7用于治疗骨肉瘤的原位可注射水凝胶pva/rh/dox的制备
118.(1)制备pva溶液：取pva0.64g，置于烧杯中，加入8ml纯水，将烧杯放置在加热搅拌装置上，在97℃加热条件下，400/min搅拌30min使其完全溶解，形成均一的溶液。
119.(2)制备大黄酸溶液；取大黄酸36mg，溶解于浓度为0.5mol/l的naoh溶液中，使用2.5mmol/l盐酸调节ph到：8.8-9.0。
120.(3)制备盐酸阿霉素溶液：取盐酸阿霉素25mg，溶解在8ml步骤(1)所述的pva水溶液中，搅拌15min使其溶解。
121.(4)将步骤(1)所述的大黄酸溶液加入到盐酸阿霉素溶液中，此过程伴随着搅拌。搅拌10min，使溶液混合均匀后，25℃超声30min。
122.(5)在-80℃冰箱冷冻1小时后取出，37℃水浴锅水浴融解30min，此为一个冻融循环。完成两个冻融循环就可以得到具有通针性的可注射凝胶pva/rh/dox支架。
123.在其他的实施例中，冻融循环还可以为3次，4次，5次，6次，7次，8次。
124.实验例8用于治疗骨肉瘤的原位可注射水凝胶pva/rh/dox的制备
125.(1)制备pva溶液：取pva1.2g，置于烧杯中，加入8ml纯水，将烧杯放置在加热搅拌装置上，在97℃加热条件下，400/min搅拌30min使其完全溶解，形成均一的溶液。
126.(2)制备大黄酸溶液；取大黄酸36mg，溶解于浓度为0.5mol/l的naoh溶液中，使用2.5mmol/l盐酸调节ph到：8.8-9.0。
127.(3)制备盐酸阿霉素溶液：取盐酸阿霉素25mg，溶解在8ml步骤(1)所述的pva水溶液中，搅拌15min使其溶解。
128.(4)将步骤(1)所述的大黄酸溶液加入到盐酸阿霉素溶液中，此过程伴随着搅拌。搅拌10min，使溶液混合均匀后，25℃超声30min。
129.(5)在-20℃冰箱冷冻12小时后取出，37℃水浴锅水浴融解30min，此为一个冻融循环。完成一个冻融循环就可以得到具有通针性的可注射凝胶pva/rh/dox支架。
130.在其他的实施例中，冻融循环还可以为2次，3次，4次，5次，6次，7次，8次。
131.实验例9用于骨支撑的骨修复水凝胶pva/rh/dox/nha的制备
132.(1)制备pva溶液：取pva0.96g，置于烧杯中，加入8ml纯水，将烧杯放置在加热搅拌装置上，在97℃加热条件下，400/min搅拌30min使其完全溶解，形成均一的溶液。
133.(2)制备纳米羟基磷灰石溶液：取15mg的纳米羟基磷灰石，使用的2.5mmol/l的盐酸溶解。
134.(3)制备大黄酸溶液；取大黄酸36mg，溶解于浓度为0.5mol/l的naoh溶液中，使用2.5mmol/l盐酸调节ph到：8.8-9.0。其中的盐酸为上述的步骤(2)中的溶解纳米羟基磷灰石后得到的盐酸溶液。
135.(4)制备盐酸阿霉素溶液：取盐酸阿霉素25mg，溶解在8ml步骤(1)所述的pva水溶液中，搅拌15min使其溶解。
136.(5)将步骤(1)所述的大黄酸溶液加入到盐酸阿霉素溶液中，此过程伴随着搅拌。搅拌10min，使溶液混合均匀后，25℃超声30min。
137.(6)在-80℃冰箱冷冻1小时后取出，37℃水浴锅水浴融解30min，此为一个冻融循环。完成5个冻融循环就可以得到具有骨支撑强度的水凝胶pva/rh/dox/nha支架。
138.在其他的实施例中，冻融循环还可以为6次，7次，8次。
139.实验例10用于骨支撑的骨修复水凝胶pva/rh/dox/nha的制备
140.(1)制备pva溶液：取pva0.8g，置于烧杯中，加入8ml纯水，将烧杯放置在加热搅拌装置上，在97℃加热条件下，400/min搅拌30min使其完全溶解，形成均一的溶液。
141.(2)制备纳米羟基磷灰石溶液：取10mg的纳米羟基磷灰石，使用的2.5mmol/l的盐酸溶解。
142.(3)制备大黄酸溶液；取大黄酸36mg，溶解于浓度为0.5mol/l的naoh溶液中，使用2.5mmol/l盐酸调节ph到：8.8-9.0。其中的盐酸为上述的步骤(2)中的溶解纳米羟基磷灰石后得到的盐酸溶液。
143.(4)制备盐酸阿霉素溶液：取盐酸阿霉素25mg，溶解在8ml步骤(1)所述的pva水溶
液中，搅拌15min使其溶解。
144.(5)将步骤(1)所述的大黄酸溶液加入到盐酸阿霉素溶液中，此过程伴随着搅拌。搅拌10min，使溶液混合均匀后，25℃超声30min。
145.(6)在-80℃冰箱冷冻1小时后取出，37℃水浴锅水浴融解30min，此为一个冻融循环。完成5个冻融循环就可以得到具有骨支撑强度的水凝胶pva/rh/dox/nha支架。
146.在其他的实施例中，冻融循环还可以为6次，7次，8次。
147.实验例11用于骨支撑的骨修复水凝胶pva/rh/dox/nha的制备
148.(1)制备pva溶液：取pva0.96g，置于烧杯中，加入8ml纯水，将烧杯放置在加热搅拌装置上，在97℃加热条件下，400/min搅拌30min使其完全溶解，形成均一的溶液。
149.(2)制备纳米羟基磷灰石溶液：取5mg的纳米羟基磷灰石，使用2.5mmol/l的盐酸溶解。
150.(3)制备大黄酸溶液；取大黄酸36mg，溶解于浓度为0.5mol/l的naoh溶液中，使用2.5mmol/l盐酸调节ph到：8.8-9.0。其中的盐酸为上述的步骤(2)中的溶解纳米羟基磷灰石后得到的盐酸溶液。
151.(4)制备盐酸阿霉素溶液：取盐酸阿霉素15mg，溶解在8ml步骤(1)所述的pva水溶液中，搅拌15min使其溶解。
152.(5)将步骤(1)所述的大黄酸溶液加入到盐酸阿霉素溶液中，此过程伴随着搅拌。搅拌10min，使溶液混合均匀后，25℃超声30min。
153.(6)在-80℃冰箱冷冻1小时后取出，37℃水浴锅水浴融解30min，此为一个冻融循环。完成6个冻融循环就可以得到具有骨支撑强度的水凝胶pva/rh/dox/nha支架。
154.在其他的实施例中，冻融循环还可以为7次，8次。
155.本发明将pva/rh/dox和pva/rh/dox/nha支架材料制备完成后，进一步对上述制备得到的水凝胶体系进行表征分析、机械性能分析等实验，验证该材料是一种较为理想的骨肉瘤治疗体系，根据骨肉瘤的治疗方案，选择的制备工艺为：pva/rh：实施例1；pva/rh/dox：实施例2；pva/rh/dox/nha：实施例9，具体方法、结果如下所示：
156.1、在制备pva空白水凝胶后，本发明首先考察了pva质量分数(4-15％)对形成水凝胶的影响，结果如图1所示，4％的pva冻融多次仍无法形成水凝胶，不具备冻融循环得到水凝胶的能力，当pva的质量分数达到8％及以上时，冻融次数只需要3次。
157.2、rh的加入对形成水凝胶的影响
158.本发明继续考察了rh的加入对形成水凝胶的影响，结果如图2所示，在10-15％的pva质量分数内加入大黄酸之后的pva，形成水凝胶的次数从单独pva需要的3次减少为1次，通过一次冻融就可以得到水凝胶的形态，所需冻融次数减少为原来的三分之一。
159.3、pva质量分数和rh的加入对形成水凝胶的影响
160.如图3所示，在6-8％的pva质量分数内，载大黄酸组与pva组对比，所需要的冻融次数减少2次。在10-15％的pva质量分数范围内，空白制剂组需要冻融3次及以上才能形成水凝胶，而载入大黄酸组减少为冻融1次即可形成水凝胶。两种水凝胶体系相互交联形成互穿网络，有效地减少了制备可注射水凝胶所需的冻融次数，是单独pva所需冻融次数的三分之一。
161.4、通过正交实验对pva/rh/dox水凝胶制备条件的筛选
162.如图4所示，设计正交试验，验证pva质量分数、冻融次数、dox载药量、rh用量变化范围等几个条件，证明该水凝胶体系的可调节性。
163.5、水凝胶体系的正交实验结果
164.如图5所示，设置的12组正交实验按照各自条件得到的水凝胶体系，通过观察每次冻融之后的结果，可以发现：(1)rh载药浓度大于6mg/ml，能参与水凝胶交联，降低冻融次数，此外，随着质量分数的增加，形成的凝胶越稳定。(2)dox载药量可达3mg/ml，说明该水凝胶体系具有优良的载药性能，载药量可根据实际需要进行调整。(3)当pva的质量分数大于10％时，形成凝胶所需的冻融次数明显减少，且质量分数越大，所需的冻融次数越少。(4)形成凝胶后的多次冻融会使水凝胶更加坚硬，具有更好的力学性能。
165.6、pva/rh/dox水凝胶的sem图像
166.如图6所示，对pva/rh/dox水凝胶进行sem成像拍摄，可以看出可注射水凝胶会形成明显的交联网络结构，且交联网络均匀，说明两种凝胶网络互传形成均一网络。
167.7、pva/rh/dox/nha水凝胶支架的sem图像
168.如图7所示，对pva/rh/dox/nha水凝胶支架进行sem成像拍摄，可以看出水凝胶会形成明显的交联网络结构。
169.8、形态与可注射性分析
170.如图8所示，本发明的pva/rh/dox可以通过一次冻融形成可注射的水凝胶，a-b图通过倒置法验证水凝胶的成功形成。c图是通过1ml注射器得到的水凝胶，通过注射器快速形成水凝胶，可以在直立状态不滑落，呈现水凝胶的性质。d图是验证水凝胶的通针性。
171.9、pva/rh/dox/nha水凝胶支架支撑性能
172.如图9所示，本发明将500g重量砝码放置在pva/rh/dox/nha水凝胶支架上，水凝胶支架能够支撑该砝码，并只发生微小形变。
173.10、机械性能分析
174.本发明对具有优良支撑性能的骨支撑pva/rh/dox/nha进行压缩与拉伸的性能分析。在型号为cmt4503的微机控制电子万能试验机上进行凝胶分析。
175.如图10所示，以50mm/min速度测试拉伸强度，pva/rh/dox/nha水凝胶支架在形变200％后发生断裂，以压缩速度：5mm/min测试压缩强度，pva/rh/dox/nha水凝胶支架在形在形变80％后发生坍塌。该机械强度性能已具有支撑骨破损结构的能力。
176.11、pva/rh/dox水凝胶能够抑制骨肉瘤细胞(k7m2)的生长
177.以1
×
104个/孔的密度将骨肉瘤细胞(k7m2)接种于96孔板中，配制一系列浓度的pva，pva/rh，pva/dox与pva/dox/rh的药液，共培养24h和48h。使用多功能酶标仪检测490nm处各孔的紫外吸收，计算不同浓度药物处理下细胞的生存率。
178.计算公式如下：
179.细胞生存率，
180.如图11所示，pva空白载体具有良好的生物相容性，pva/rh，pva/dox和pva/rh/dox都有明显的浓度依赖的肿瘤细胞杀伤能力，且最终制剂组在同样条件下具有更好的杀伤效果。
181.12、pva/rh/dox水凝胶诱导骨肉瘤细胞(k7m2)的凋亡
182.如图12所示，通过annexinv/pi双染流式凋亡验证，在24h条件下，pva/rh/dox水凝胶对骨肉瘤细胞(k7m2)具有更好的诱导凋亡效果。
183.13、pva/rh/dox水凝胶抑制骨肉瘤的发展
184.如图13所示，通过在小鼠上构建骨肉瘤模型，使用pva/rh/dox水凝胶原位单次注射给药，在观察14天后处死并解剖小鼠，得到肿瘤组织。通过此实验可以验证，本发明pva/rh/dox水凝胶能够有效抑制骨肉瘤的发展。
185.14、pva/rh/dox水凝胶抑制骨肉瘤体积的发展
186.在获得肿瘤组织的基础上，对肿瘤组织进行体积测量，用数字卡尺测量肿瘤的顶端(ap)和纵向(l)。ap测量跨越膝盖骨，l测量位于胫骨前方。根据以下公式(1)测量原发肿瘤体积(v)。
[0187][0188]
如图14所示，本发明pva/rh/dox水凝胶组与其它组别具有显著性差异，有更好的骨肉瘤抑制效果。
[0189]
综上所述，本发明在提供pva/rh水凝胶的基础上，提供了一种用于骨肉瘤治疗(pva/rh/dox)和骨支撑性水凝胶(pva/rh/dox/nha)支架材料，将pva/rh水凝胶、化疗药物dox、nha结合，其中，pva/rh水凝胶能够负载药物，化疗药物dox具有优良的肿瘤杀伤能力，nha能够增强水凝胶的机械性能。将pva/rh水凝胶、化疗药物dox结合得到pva/rh/dox水凝胶，该水凝胶制备简单，具有优良的生物相容性和通针性，通过单次注射就能得到良好的治疗效果。将pva/rh水凝胶、化疗药物dox、nha结合三者结合，制作出的pva/rh/dox/nha能够作为骨支撑材料，在体外验证具有优良的支撑性能。
[0190]
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。
技术特征：1.一种多功能水凝胶，其特征在于，主要由pva和大黄酸组成，按照质量比pva：大黄酸＝0.2~2 g：10~100 mg，优选为0.48~1.5 g：36～72 mg，更优选为0.64~1.2g：36~72 mg。2.根据权利要求1所述的多功能水凝胶，其特征在于，所述水凝胶中还添加有化疗药物和/或促进骨修复的材料；当水凝胶中仅添加有化疗药物时，按照质量比pva：大黄酸：化疗药物＝0.2~2g：10～100 mg：5～35 mg，优选为0.64~1.2 g：36～72 mg：10～25 mg；当水凝胶中仅添加有促进骨支撑的材料时，按照质量比pva：大黄酸：促进骨支撑的材料＝0.2~2 g：10～100 mg：2~20 mg；优选为0.64~1.2 g：36～72 mg：5～15 mg；当水凝胶中添加有化疗药物和促进骨支撑的材料时，按照质量比pva：大黄酸：化疗药物：促进骨支撑的材料＝0.2~2 g：10～100 mg：5～35 mg：2~20 mg；优选为0.64~1.2 g：36～72 mg：10～25 mg：5～15 mg。3.一种可注射水凝胶，其特征在于，包括：pva与大黄酸水凝胶以及化疗药物；其中，按照质量比pva：大黄酸：化疗药物＝0.2~2 g：10～100 mg：5～35 mg，优选为0.64~1.2 g：36～72 mg：10～25 mg。4.一种骨支撑性水凝胶，其特征在于，包括：pva与大黄酸水凝胶、化疗药物、以及促进骨支撑的材料；其中，按照质量比pva：大黄酸：化疗药物：促进骨支撑的材料＝0.2~2 g：10～100 mg：5～35 mg：2~20 mg；优选为0.64~1.2 g：36～72 mg：10～25 mg：5～15 mg。5.根据权利要求2-4任一所述的水凝胶，其特征在于，所述化疗药物为盐酸阿霉素，阿霉素，阿苯达唑中的任意一种或多种，优选为盐酸阿霉素。6.根据权利要求2-4任一所述的水凝胶，其特征在于，所述促进骨支撑的材料为纳米羟基磷灰石；优选的，所述pva分子量为89000-98000。7.权利要求5所述的一种可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，制备pva溶液：将pva分散于水中，在加热条件下搅拌，使其完全溶解，形成均一的溶液；其中，pva水溶液中，pva的质量浓度为4-20％，优选为8-15%；步骤2，制备大黄酸溶液；将大黄酸溶解在碱性溶液中，使其完全溶解，然后使用盐酸调节ph到8.0-9.4，优选为8.8-9.0；步骤3，制备盐酸阿霉素溶液：将盐酸阿霉素分散在步骤1所述的pva水溶液，搅拌或超声使其溶解；步骤4，将步骤2所述的大黄酸溶液加入到步骤3所述的盐酸阿霉素溶液中，此过程伴随着搅拌，搅拌均匀后超声；步骤5，在-20℃~-80℃冰箱冷冻1小时后取出，37℃水浴锅水浴融解30 min，此为一个冻融循环；其中，此冻融循环从1次-8次，优选为1-7次，更优选为4~6次。8.权利要求6所述的一种骨支撑性水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，制备pva溶液：将pva分散于水中，在加热条件下搅拌，使其完全溶解，形成均一的溶液；其中，pva水溶液中，pva的质量浓度为4-20％，优选为8-15%；步骤2，制备纳米羟基磷灰石溶液：取纳米羟基磷灰石，使用盐酸溶解；步骤3，制备大黄酸溶液；将大黄酸溶解在碱性溶液中，使其完全溶解，然后使用盐酸调节ph到8.0~9.4，优选为8.8~9.0；其中，盐酸为步骤2溶解纳米羟基磷灰石后得到的盐酸溶液；
步骤4，制备盐酸阿霉素溶液：将盐酸阿霉素分散在步骤1所述的pva水溶液，搅拌或超声使其溶解；步骤5，制备协同骨肉瘤治疗和骨支撑性水凝胶：将大黄酸溶液加入到盐酸阿霉素溶液中，此过程伴随着搅拌，搅拌均匀后超声；步骤6，在-20~-80℃冰箱冷冻1小时后取出，37℃水浴锅水浴融解30min，此为一个冻融循环；其中，此冻融循环从1次-8次，优选为1-7次，更优选为4~6次。9.根据权利要求7或8的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，加热温度为：80~100℃优选为95-100℃，更优选为97℃；加热搅拌时间为：20min~1h；优选的，大黄酸溶液制备中，大黄酸的质量浓度为4-25mg/ml，优选为4-10mg/ml，所述碱性溶液中的碱为氢氧化钠，碳酸钠或碳酸氢钠的任一种，盐酸的浓度为：1 mmol/l-5 mmol/l；优选的，盐酸阿霉素溶液制备时，其质量浓度为0.1-3 mg/ml。10.权利要求1-6任一所述的水凝胶在制备治疗肿瘤和/或促进骨修复的药物中的应用；优选的，所述肿瘤为骨肉瘤。
技术总结本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种多功能水凝胶及其制备方法和应用，更具体的，涉及一种抗肿瘤可注射水凝胶和骨支撑的水凝胶体系的制备及应用。本发明的一种多功能水凝胶，主要由PVA和大黄酸组成，按照质量比PVA：大黄酸＝0.2~2 g：10~100 mg，优选为0.48~1.5 g：36～72 mg，更优选为0.64~1.2g：36~72 mg。本发明构建的抗肿瘤水凝胶具有可注射性，能通过单次给药抑制肿瘤细胞的生长，构建的骨支撑的水凝胶具有很强的支撑强度。水凝胶具有很强的支撑强度。水凝胶具有很强的支撑强度。
技术研发人员：姜虎林 刘璎萱 姚亚婷 邢磊 周天娇
受保护的技术使用者：中国药科大学
技术研发日：2022.07.25
技术公布日：2022/11/1
