1.本发明属于单细胞建库领域，具体涉及一种功能序列、包含其的标签群以及应用。
背景技术：2.现有的微珠设计大部分偶联有逆转录引物，由此，可以直接完成逆转录以及对应的细胞标签标记。但是，由于建库需求多样化，比如需要满足特定的样本要求，需要构建达到不同测序要求的文库，比如3’转录组文库、5’转录组文库和全长转录组文库等等。
3.对应地，需要设计不同序列偶联至微珠上才能完成对应文库构建，不可实现随意定制化，不仅增强的建库的复杂性，还降低了建库的效率。
技术实现要素：4.为达到上述目的，本发明提供一种功能序列、包含其的标签群以及应用，旨在可以提供适用于实现定制转录引物，以此，满足不同建库需求，提高建库效率。
5.为达到上述目的一种功能序列，所述功能序列包括：
6.标签体以及连接在所述标签体一端的接头1；其中，所述标签体包括细胞标签。
7.可选地，所述标签体还包括分子标签；和/或，
8.所述功能序列还包括引物结合序列，所述引物结合序列连接在所述标签体的另一端。
9.此外，本发明还包括一种标签群，所述标签群包括多个细胞标签群，各所述细胞标签群包括多条上述的功能序列，同一所述细胞标签群的多条所述功能序列的所述细胞标签相同，且不同所述细胞标签群的多条所述功能序列的所述细胞标签不同。
10.可选地，各所述细胞标签群包括105～10
10
条功能序列；和/或，
11.所述功能序列还包括分子标签，各所述功能序列的所述分子标签不同；和/或，
12.各所述细胞标签群还包括一个微珠本体，各所述细胞标签群的多条所述功能序列与对应的所述微珠本体连接，且各所述功能序列与所述微珠本体可条件性断开。
13.此外，本发明还包括一种单细胞rna建库方法，所述单细胞rna建库方法包括以下步骤：
14.将多个细胞的目标rna、逆转录体系、连接体系和如权利要求3所述的标签群采用封闭体系封闭，形成多个封闭反应体系，其中，各所述封闭反应体系中包含同一细胞的多个目标rna和一个所述细胞标签群，不同所述封闭反应体系中包含不同的所述细胞标签群和不同细胞的多个的所述目标rna；
15.在各所述封闭反应体系中，在所述逆转录体系作用下进行逆转录反应得到多条cdna，且各所述cdna具有接头1’；
16.将各所述封闭反应体系中的得到的多条所述cdna在所述连接体系作用下，所述接头1’与各功能序列的所述接头1一一对应形成双链后，得到标记cdna；
17.将所述标记cdna进行富集，并引入文库标签，得到单细胞rna测序文库。
18.可选地，各所述细胞标签群还包括一个微珠本体，各所述细胞标签群的多条所述功能序列与对应的所述微珠本体连接，且各所述功能序列与所述微珠本体可条件性断开；
19.所述将各所述封闭反应体系中的得到的多条所述cdna在所述连接体系作用下，所述接头1’与各所述功能序列的所述接头1一一对应形成双链后，得到所述标记cdna的步骤包括：
20.将各所述功能序列与所述微珠本体条件性断裂，裂解微珠本体后，将各所述封闭反应体系中的得到的多条所述cdna的所述接头1’与各所述功能序列的所述接头1一一对应形成双链后，得到所述标记cdna。
21.可选地，所述逆转录体系包括逆转录引物和逆转录酶，所述逆转录引物包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物包括逆转录序列以及第一序列，所述逆转录引物可对所述目标rna进行逆转录，所述反向引物包括第二序列以及第三序列，所述第一序列与所述第二序列互补，所述第三序列与所述接头1’的序列一致；和/或，
22.所述连接体系包括dna连接酶。
23.可选地，所述逆转录序列包括随机序列和/或固定序列，所述功能序列包括分子标签，所述分子标签与所述细胞标签共同构成标签体；和/或，
24.所述逆转录酶具有模板转换功能，所述逆转录体系还包括模板转换序列；和/或，
25.所述逆转录引物还包括第一链合成引物，所述第一链合成引物用于cdna第一链的合成。
26.可选地，所述将多个细胞的目标rna、逆转录体系、连接体系和所述标签群采用封闭体系封闭，形成多个封闭反应体系的步骤包括：
27.制备多个细胞相体系，各所述细胞相体系包括一个细胞、所述逆转录体系以及所述连接体系；
28.准备多个标签相，所述标签相包含一个细胞标签群及表面活性剂；
29.所述封闭体系为油相，将各个所述细胞相体系及标签相分别采用所述封闭体系进行封闭，待所述细胞裂解，释放出对应细胞的多个所述目标rna，形成多个油包水的封闭反应体系。
30.此外，本发明提供一种单细胞rna建库试剂盒，所述单细胞rna建库试剂盒包括：
31.上述标签群；
32.逆转录体系，所述逆转录体系用于将目标rna进行逆转录得到cdna，所述cdna具有接头1’，所述接头1’可与所述接头1形成双链；
33.连接体系，所述连接体系用于dna连接；
34.封闭体系，所述封闭体系用于将多个细胞的目标rna、所述逆转录体系、所述连接体系和所述标签群封闭，形成多个封闭反应体系，同一所述封闭反应体系中包含同个细胞的多个目标rna和一个细胞标签群，不同封闭反应体系中包含不同的细胞标签群和不同细胞的多个的目标rna；以及，
35.富集建库体系，所述富集建库体系用于将所述cdna进行扩增并通过index pcr加上样品文库标签。
36.本发明中，通过在细胞标签上连接上接头，可以使其进行组合成标签群后，配合游离的逆转录引物，即可对于不同的细胞的cdna进行细胞标记，以此可以进行单细胞检测。通
用性强，不仅可实现3’、5’及全序列单细胞转录组的检测，也可以适用于各种目标rna的设计。
附图说明
37.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
38.图1为本发明一实施例的一标签群的具体结构；
39.图2为本发明一实施例一标签群上的功能序列的具体结构；
40.图3为本发明一实施例的单细胞rna建库方法具体流程；
41.图4为本发明一实施例的标记cdna具体结构；
42.图5为本发明一实施例的封闭反应体系的形成原理图；
43.图6为本发明实施例1获得文库片段大小测试图；
44.图7为本发明实施例及对比例核酸序列测试图；
45.图8为本发明实施例1～3核酸序列测试图。
46.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
47.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
48.需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“a和/或b”为例，包括a方案、或b方案、或a和b同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
49.鉴于现有的高通量单细胞检测需要采用在固定载体上偶联上不同的特定的引物，才可完成不同目的的单细胞检测，因此无法做到各个目标mrna上的通用检测。因此，本发明提供一种功能序列，所述功能序列包括：
50.标签体以及连接在所述标签体一端的接头1；其中，所述标签体包括细胞标签，形成通用标签，由此增强通用性。
51.在一些实施例中，所述标签体还包括所述分子标签，分子标签可用于对各个逆转录出的片段进行标记。
52.在一些实施例中，所述功能序列还包括引物结合序列，所述引物结合序列连接在所述标签体的另一端。所述引物结合序列用于结合扩增引物，进行扩增，富集cdna。
53.可以理解的是，可在功能序列中加入间隔序列和/或可解离基团，使其更易负载在载体上并方便的从载体上进行脱离。
54.在一些实施例中，所述功能序列还包括连接在所述引物结合序列和所述标签体之间的移码碱基，所述移码碱基作为测序中的平衡碱基。
55.所述功能序列为：
[0056]5’‑
ctacacgacgctcttccgatct(gtca)jjjjjjjjactggtgajjjjjjjjggtagtgacajjjjjjjjnnnnnnnnttggctttgctgt-3’[0057]
序列中，ctacacgacgctcttccgatct为引物结合序列，(gtca)为移码碱基，作为测序中的平衡碱基，可为g，gt，gtc，gtca中的任一种组合，jjjjjjjjactggtgajjjjjjjjggtagtgacajjjjjjjj细胞标签，nnnnnnnn分子标签，ttggctttgctgt为接头1，介导连接，其中，每个j和n均选自atcg中的任一碱基。
[0058]
此外，参见图1～2，本发明提供一种标签群，所述标签群包括多个细胞标签群，各所述细胞标签群包括多条上述功能序列，同个所述细胞群的多条所述功能序列的细胞标签相同，且不同所述细胞标签群的所述功能序列的所述细胞标签不同。
[0059]
在形成标签群后，可对于来自不同细胞的cdna进行标记，以此可以进行多个细胞进行同时建库，加大建库通量。
[0060]
需要说明的是，细胞标签群的功能序列数量可根据实际情况调节，在本发明中，各所述细胞标签群包括105～10
10
条所述功能序列。
[0061]
在一些实施例中，参见图1，各所述细胞标签群还包括微珠本体1，各所述细胞标签群的多条所述功能序列2与对应的所述微珠本体连接，且各所述功能序列与所述微珠本体可条件性断开。通过将多条功能序列与一个微珠本体连接，可以提高其功能序列的负载量，且集成在一个微珠时，更易操作。
[0062]
参见图2，每条功能序列依次包括连接的连接头201、断点202、引物结合序列203、细胞标签204、分子标签205和连接序列206，需要说明的是，可条件性断开可以通过在微珠本体与功能序列之间增加在特定条件下解离的断点，比如可紫外断裂的pclinker，还比如dtt的作用下进行裂解的双硫修饰。
[0063]
需要说明的是，在本发明中，所述微珠本体的材质不受限制，可以为柔性材质也可以为硬性材质。所述型微珠直径可以在40um-65um。具体至一些实施例中，其材质采用微珠，更方便后续去除。
[0064]
参见图3，本发明还提供一种单细胞rna建库方法，所述单细胞rna建库方法包括以下步骤：
[0065]
步骤s10:将多个细胞的目标rna、逆转录体系、连接体系和上述标签群采用封闭体系封闭，形成多个封闭反应体系，各封闭反应体系中包含同个细胞的多个目标rna和一个细胞标签群，不同封闭反应体系中包含不同的细胞标签群和不同细胞的多个的目标rna；
[0066]
步骤s20:在各所述封闭反应体系中在所述逆转录体系作用下进行逆转录反应得到多条cdna，且各所述cdna具有接头1’；
[0067]
步骤s30:将各所述封闭反应体系中的得到的多条所述cdna在所述连接体系作用下，所述接头1’与各所述功能序列的所述接头1一一对应形成双链后，得到所述标记cdna；
[0068]
步骤s40:将所述标记cdna进行富集，并引入文库标签，得到单细胞rna测序文库。
[0069]
采用上述步骤，可根据需要设计所需的逆转录体系，通用性强。在封闭体系中进行逆转录以及细胞标记，进一步加强细胞之间的隔离性，以此保证各个细胞之间的遗传信息不受污染，确保建库的准确性。
[0070]
在一些实施例中，各所述细胞标签群还包括微珠本体，各所述细胞标签群的多条所述功能序列与对应的所述微珠本体连接，且各所述功能序列与所述微珠本体可条件性断开；
[0071]
若采用上述含有微珠本体的细胞标签群，则步骤s30包括：
[0072]
将各所述功能序列与所述微珠本体条件性断裂，裂解微珠本体后，将各所述封闭反应体系中的得到的多条所述cdna的所述接头1’与各所述功能序列的所述接头1一一对应形成双链后，得到所述标记cdna。通过接头1’与接头1的介导，完成对逆转录产物的标记。
[0073]
在一些实施例中，所述逆转录体系包括逆转录引物和逆转录酶，所述逆转录引物包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物包括逆转录序列以及第一序列，所述逆转录序列可对所述目标rna进行逆转录，所述反向引物包括第二序列以及第三序列，所述第一序列与所述第二序列互补，所述第三序列与所述接头1’序列一致。采用上述逆转录引物设计，可以形成所述接头1’，方便后续连接细胞标签，其形成的所述标记cdna其结构如图4所示，图4中，1为第一序列，2为逆转录序列，3为cdna序列，4为第二序列，5为第三序列形成的粘性末端接头1’。
[0074]
需要说明的是，在本发明中，所述逆转录体系中，其逆转录序列可根据实际的目标rna分子或cdna方案进行调整，例如，针对真核生物的polya分子结构，可采用oligo-(dt)n，n的数量在10～100之间，以此实现单细胞3’转录组文库的构建；
[0075]
还例如，在一些实施例中，所述逆转录序列设计成模板转化序列，且所述逆转录引物还包括第一链合成引物，模板转化序列中具有特定序列1，用以实现单细胞5’转录组文库的构建；所述第一链合成引物用于逆转录合成含rna全部信息的cdna第一链，完成起始逆转录反应的同时，也利用逆转录酶在cdna的3
‘
末端添加了特定序列1’，所述特定序列1’可与所述特定序列1形成双链，以此延伸所述模板转换序列，所述正向引物中的所述接头1’与各所述功能序列的所述接头1一一对应介导正向引物与功能序列的连接反应，完成上述过程后，再进行功能序列延伸反应，以此实现5’单细胞转录组文录构建。在一些情况下，所述特定序列1’为多个c。
[0076]
可以理解是的是，在一些实施例中，所述第一链引物包括富集序列和可逆转录rna信息的固定序列，所述固定序列依据实际进行设计即可。
[0077]
在一些情况下，所述固定序列为oligo-(dt)n。
[0078]
高通量单细胞rna检测主要有基于油包水的液滴区隔技术、基于微孔板的beads标记技术以及微流控三种实现方式。以10x genomics、drop-seq平台及indrop平台为代表的油包水的液滴区隔技术，或者以bd cytoseq、seqwell及microwell-seq为代表的微孔板的beads标记技术，由于细胞标签只能标记在cdna的3’或者5’端及二代测序短读长的限制，导致以上提到的高通量单细胞技术都只能实现检测靠近rna特定3’尾巴端或者5’起始端的碱基序列检测，而不能有效的在高通量单细胞层面实现对rna全长序列的分析。
[0079]
将高通量单细胞建库技术与三代测序结合起来可以实现rna全长序列的分析，比如将在3’端添加了细胞标签的cdna扩增序列构建为三代文库，然后通过pacbio或者
nanopore三代测序仪可以检测到全长基因序列信息。但由于三代测序众所周知的超高rna测序成本阻止了其广泛应用。
[0080]
针对上述问题，在一些实施例中，所述接头1与所述标签体连接，所述逆转录序列包括随机序列。当然，可以理解是的时，此时的所述功能序列包括分子标签，所述分子标签与所述细胞标签共同构成标签体，在功能序列包括分子标签时，则可以对各个片段进行进行标记。
[0081]
具体地，所述逆转录序列中包含可以是完全随机引物，例如6-20个atgc四种碱基核苷酸的随机组合dn(6-20)，如nnnnnn(n代表atcg的任一碱基核苷酸)；
[0082]
也可以是半随机序列，例如包含3-12bp的随机碱基和3-5bp四种碱基其中一种的组合，例如nnnnnttt序列。
[0083]
通过上述随机引物的设计，可以将目标rna逆转录生成多个cdna片段，多个cdna片段覆盖完整的cdna信息。
[0084]
当然，可以理解的是，形成的多个cdna片段的过程可以发生在生成cdna第一链过程中，该方案直接采用所述逆转录引物对进行逆转录，生成多个cdna第一链片段，用于后续连接反应。
[0085]
同时，也可以发生在生成cdna第二链过程中，该方案可逆转录完整的cdna第一链后的引物进行逆转录反应后，再采用上述引物进行生成多个cdna第二链片段，用于后续连接反应。
[0086]
可以理解的是，所述逆转录体系还包括对应的实现逆转录反应的逆转录反应液，具体不一一阐述。
[0087]
在一些实施例中，所述连接体系包括dna连接酶。需要说明的是，在本发明中，所述dna连接酶用于连接细胞标签与cdna片段，形成标记cdna，常见的如t4 dna连接酶等。
[0088]
需要说明的是，在本发明中，所述逆转录酶是指可以进行普通逆转录反应的酶。
[0089]
在一些实施例中，所述逆转录酶具有模板转换功能，所述逆转录体系还包括模板转换序列。当采用上述逆转录酶和模板转换序列时，逆转录过程中，可以依靠逆转录酶在cdna的3’末端添加特定序列的特性，在cdna3’末端加上一段特异性引物序列，用于后续cdna的富集；其中，具有模板转换功能所述逆转录酶可以maxima
tm h minus cdna合成预混液等。
[0090]
需要说明的是，在形成单细胞隔离操作的前提下，其封闭体系与封闭方法不限，而在一些实施例，所述步骤s10包括：
[0091]
步骤s101：制备多个细胞相体系，各所述细胞相体系包括一个细胞、所述逆转录体系以及所述连接体系；
[0092]
步骤s102：准备多个标签相，所述标签相包含一个细胞标签群及表面活性剂；
[0093]
步骤s103：所述封闭体系为油相，将各个所述细胞相体系及标签相分别采用所述封闭体系进行封闭，待所述细胞裂解，释放出该细胞的多个所述目标rna，形成油包水的封闭反应体系。
[0094]
由于油包水体系是较为常见的封闭反应体系，采用上述体系，可以不用开发新的封闭设备，有利于节省成本，同时，标签相中的表面活性剂可以将细胞进行裂解，释放出目标rna。
[0095]
例如，在一些实施例中，将细胞相、微珠相及油相按照dd 3’单细胞文库构建试剂盒说明书所示加入到芯片中，后将芯片置于seekone dd仪器中，进行油包水生成；液滴生成过程如图5所示；在一定压力下，形成的每一个液滴中仅含有一个细胞和一个珠子，保证细胞与细胞标签一一对应；
[0096]
需要说明的是，在本发明中，对应不同的所述标记cdna，其步骤s40对应采用不同的方式进行，在本发明中，可以具体采用下述三种：
[0097]
在一些实施例中，步骤s40包括：
[0098]
步骤s401：加入与引物结合序列及模板转换序列结合的引物进行cdna富集；
[0099]
步骤s402:将富集后的所述标记cdna进行片段化得到标记cdna片段；
[0100]
步骤s403:将所述标记cdna片段连接上测序序列，然后采用index pcr加上样品文库标签，得到单细胞rna测序文库。
[0101]
在一些实施例中，步骤s40包括：
[0102]
将各所述标记cdna片段可根通过专利申请cn114096678a中介绍的依次经过杂交、延伸后，加入与所述引物结合序列结合的扩增引物，进行index pcr，得到所述单细胞全序列转录组文库；
[0103]
在一些实施例中，步骤s40包括：
[0104]
步骤s401：将各所述标记cdna片段经过单端接头连接后，加入与所述引物结合序列结合的扩增引物进行富集；
[0105]
步骤s402:将富集后的所述标记cdna进行片段化得到标记cdna片段；
[0106]
步骤s403:将所述标记cdna片段连接上测序序列，然后采用index pcr加上样品文库标签，得到单细胞rna测序文库。
[0107]
此外，本发明还提供一种单细胞rna建库试剂盒，所述单细胞rna建库试剂盒包括：
[0108]
逆转录体系，所述逆转录体系用于将目标rna进行逆转录得到cdna，所述cdna具有接头1’；
[0109]
连接体系，所述连接体系用于dna连接；
[0110]
上述标签群；
[0111]
封闭体系，所述封闭体系用于将多个细胞的目标rna、逆转录体系、连接体系和所述标签群封闭，形成多个封闭反应体系，各封闭反应体系中包含同个细胞的多个目标rna和一个细胞标签群，不同封闭反应体系中包含不同的细胞标签群和不同细胞的多个的目标rna；以及，
[0112]
富集建库体系，所述富集建库体系用于将所述cdna进行扩增并通过index pcr加上样品文库标签。
[0113]
通过上述试剂盒，可以实现上述方法的单细胞rna建库。
[0114]
综上所述，本发明中，采用任意感兴趣基因的正向引物与带有第三序列的反向引物对目标mrna进行逆转录，形成多个带有粘性末端的cdna片段产物，通过粘性末端在cdna片段产物5’端引入分子标签，同时在不同细胞来源的cdna片段上连接不同的细胞标签，以此将不同的细胞进行分辨，实现了高通量单细胞测序。本发明方案仅需改变逆转录引物即可实现3’或5’单细胞转录组或单细胞全序列转录组或定制化基因单细胞转录组的构建。
[0115]
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，
以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0116]
实施例1
[0117]
本实施例提供一种pbmc的单细胞3’转录组文库的构建及测序分析，具体操作如图1所示：
[0118]
一、细胞标签载体水凝胶珠的制备
[0119]
本步骤采取“分散-合并-分散”的技术方法实现多种核酸标记水凝胶珠(以下简称barcoded beads)的制备，具体制备方案可参考专利cn 114096678 a。barcoded beads上偶联序列的5’端为双硫修饰，可在dtt作用下断裂；具体序列如下：
[0120]5’‑
ctacacgacgctcttccgatct(gtca)jjjjjjjjactggtgajjjjjjjjggtagtgacajjjjjjjjnnnnnnnnttggctttgctgt-3’[0121]
二、单细胞3’转录组文库的构建
[0122]
1.抽取外周血并获得新鲜的pbmc细胞(外周血单核细胞)，重悬于pbs中，进行细胞计数，确定单位体积中的细胞个数；
[0123]
2.油包水液滴生成及细胞标记
[0124]
2.1试剂准备
[0125]
2.1.1提前将barcoded beads从-80℃中取出，平衡至室温；
[0126]
2.1.2按照下表配置反应体系
[0127][0128]
并额外加入2ul 40um逆转录引物，逆转录引物为以下两个序列的退火产物。
[0129][0130]
其中，cgtccgtcgttgctcg为第一序列，tttttttttttttttttttttttttttttttvn为逆转录引物序列；acgagcaacgacggacg为第二序列；acagcaaagccaa为第三序列；
[0131]
根据上样细胞数计算需投入细胞体积,将32.4μl的细胞悬液加入到上述mix中吹打混匀；最终单细胞混合液总体积为80μl。
[0132]
2.2按照dd3’单细胞文库构建试剂盒说明书向芯片中加入对应试剂；
[0133]
芯片通道1：吸取78μl步骤2.1中的细胞相试剂，避免产生气泡；
[0134]
芯片通道2：将室温平衡好的barcoded beads充分振荡30sec，瞬时离心5sec，确保barcoded beads液体内没有气泡，用移液器吸取40μl，吸头尖插入对应的孔位底部，缓慢注入，不要产生气泡；
[0135]
芯片通道3：吸取240μl carrier oil，插入标签3对应的孔位，缓慢注入，不要产生气泡；
[0136]
2.3将gasket挂载于芯片夹具上层，确保gasket孔和芯片孔对齐。
[0137]
2.4dd仪器运行
[0138]
按照dd3’单细胞文库构建试剂盒说明书操作流程将芯片放入dd仪器中，开始运行程序；
[0139]
2.5油包水液滴转移
[0140]
程序运行结束后，点击弹出按钮，取出芯片。使用移液器将对应孔内生成的油包水转移至新的0.2ml的pcr管中；
[0141]
2.6逆转录&连接反应
[0142]
将步骤2.5中装有油包水的pcr管，放入pcr仪中运行下列程序，pcr热盖85℃，体积100μl；
[0143][0144]
3.逆转录产物回收及cdna扩增
[0145]
3.1逆转录产物回收
[0146]
3.1.1反应结束后，向上述pcr管中加入100μl demulsion agent试剂，室温静置2min，瞬时离心；
[0147]
3.1.2从pcr管底部缓慢吸取120μl白色液体丢弃，不要吸到粉红色反应液；
[0148]
3.1.3加入180μl振荡混匀后的cleanup beads，轻轻缓慢吹打至少15次，室温孵育10min；
[0149]
3.1.4孵育结束后，将pcr管置于磁力架上吸附至溶液澄清，去除上清；
[0150]
3.1.5保持在磁力架上加入300μl 80％乙醇，约30sec后去除上清；重复此步骤一次；
[0151]
3.1.6瞬时离心，用10μl移液器去除所有残留的上清；
[0152]
3.1.7室温静置2min使乙醇挥发，加入22.5μl nuclease-free water充分悬浮磁珠，室温静置2min；
[0153]
3.1.8置于磁力架上吸附至溶液澄清，转移上清22μl至新的0.2ml pcr管中。
[0154]
3.2 cdna扩增
[0155]
按照下表配置pcr扩增体系
[0156][0157]
将配置好的27μl扩增体系加入到3.1.8步骤中的22μl cdna产物中，吹打混匀10次，瞬时离心，然后进行pcr。设置pcr程序如下：
[0158][0159]
3.3 cdna扩增产物纯化
[0160]
3.3.1反应结束后，向上述pcr管中加入30μldna cleanup beads，吹打混匀，室温孵育5min
[0161]
3.3.2孵育结束后，将pcr管置于磁力架上吸附至溶液澄清，去除上清；
[0162]
3.3.3保持在磁力架上加入300μl 80％乙醇，约30sec后去除上清；重复此步骤一次；
[0163]
3.3.4瞬时离心，用10μl移液器去除所有残留的上清；
[0164]
3.3.5室温静置2min使乙醇挥发，加入40.5μl nuclease-free water充分悬浮磁珠，室温静置5min；
[0165]
3.3.6置于磁力架上吸附至溶液澄清，转移上清40μl至新的1.5ml pcr管中。
[0166]
4.转录组文库构建
[0167]
4.1 dna片段化与末端修复
[0168]
按照下表设置程序，并运行pcr仪，pcr仪热盖65℃，体积50μl
[0169][0170]
按照下表依次加入相应试剂，振荡混匀，瞬时离心，立即置于上述pcr仪中，运行程序：
[0171][0172]
4.2片段分选
[0173]
4.2.1反应结束后瞬时离心，加入30μl dna clean beads，振荡混匀后瞬时离心；室温静置5min；
[0174]
4.2.2磁力架上吸附至溶液澄清，吸取上清到另一含有10μl dna clean beads的pcr管中,振荡混匀后瞬时离心；室温静置5min；
[0175]
4.2.3放置于磁力架吸附至溶液澄清，去除上清；
[0176]
4.2.4加入200μl 80％乙醇，约30sec后去除上清；重复此步骤一次；
[0177]
4.2.5将pcr管进行瞬时离心，用10μl移液器去除所有残留的上清；
[0178]
室温静置2min使乙醇完全挥发；
[0179]
4.2.6加入50.5μl nuclease-free water充分悬浮磁珠，室温静置2min；
[0180]
4.2.7置于磁力架上吸附至溶液澄清，转移上清50μl至新的0.2ml pcr管中。
[0181]
4.3接头连接
[0182]
按照下表配制反应体系：
[0183][0184][0185]
充分振荡混匀，瞬时离心；置于pcr仪中，20℃，15min。
[0186]
4.4连接产物纯化
[0187]
4.4.1反应结束后瞬时离心，加入80μl dna clean beads，振荡混匀后瞬时离心，室温静置10min后；
[0188]
4.4.2置于磁力架上吸附至溶液澄清，去除上清；
[0189]
4.4.3保持在磁力架上加入200μl 80％乙醇，约30sec后去除上清；重复此步骤一次；
[0190]
4.4.4去除上清后，进行瞬时离心，用移液器去除所有残留的上清；
[0191]
4.4.5室温静置3-5min使乙醇完全挥发；
[0192]
4.4.6加入23.5μl nuclease-free water充分悬浮磁珠，室温静置2min；
[0193]
4.4.7置于磁力架上吸附至溶液澄清，转移上清23μl至新的0.2ml pcr管中。
[0194]
4.5文库扩增
[0195]
按照下表配制反应体系
[0196][0197]
充分振荡混匀，瞬时离心；置于pcr仪中运行下列pcr程序：
[0198][0199]
4.6文库纯化
[0200]
4.6.1反应结束后瞬时离心，加入30μl dna clean beads，振荡混匀后瞬时离心，室温静置5min；
[0201]
4.6.2放置于磁力架上吸附至溶液澄清，吸取上清到另一含有10μl dna clean beads的pcr管中，振荡混匀后瞬时离心，室温静置5min；
[0202]
4.6.3放置于磁力架吸附至溶液澄清，去除上清；
[0203]
4.6.4加入200μl 80％乙醇，约30sec后去除上清；重复此步骤一次；
[0204]
4.6.5将pcr管进行瞬时离心，用移液器去除所有残留的上清；
[0205]
4.6.6室温静置3-5min使乙醇完全挥发；
[0206]
4.6.7加入30.5μlnuclease-free water充分悬浮磁珠，室温静置2min；
[0207]
4.6.8置于磁力架上吸附至溶液澄清，转移上清30μl至新的0.2ml pcr管中。
[0208]
4.7文库质控
[0209]
得到的文库片段大小如图6中所示，其长度主要集中在200bp～1500bp范围内。
[0210]
实施例2
[0211]
本实施例提供的是提供一种pbmc的单细胞全序列转录组文库的构建。与实施例1的差异仅在于步骤2中逆转录部分。
[0212]
其中所述步骤2中逆转录部分差异，仅为逆转录引物浓度及序列差异；引物浓度由
40um更改为100um；具体引物序列如下：
[0213]
其中cgtccgtcgttgctcg为第一序列；nnnnnnnn逆转录序列；acgagcaacgacggacg为第二序列；acagcaaagccaa第三序列用于后续连接；
[0214][0215]
实施例3
[0216]
本实施例提供的是提供一种pbmc的单细胞5’转录组文库的构建。与实施例1的差异仅在于步骤2中逆转录部分。
[0217]
其中所述步骤2中逆转录部分差异，为逆转录体系及引物序列差异；具体逆转录体系如下：
[0218][0219][0220]
其中oligo-dt30vn序列中aagcagtggtatcaacgcagagtac为cdna富集的引物结合序列；ttttttttttttttttttttttttttttttvn为逆转录引物序列，v为acg的一种，n为atcg的一种。
[0221]
引物f中cgtccgtcgttgctcg为第一序列，tttcttatat/rg//rg//rg/为模板转换序列；
[0222]
引物r中acgagcaacgacggacg为第二序列；acagcaaagccaa第三序列用于介导后续连接；
[0223]
逆转录反应程序如下：
[0224][0225][0226]
对比例1
[0227]
根据北京寻因科技公司的dd试剂盒中记载的操作方法对pbmc细胞(外周血单核细胞)进行文库构建。
[0228]
测试实施例
[0229]
illumina novaseq 6000测序，并分析测到的核酸序列在rna的位置，实施例1～2与对比例1的对比结果如图7所示，其中，实施例1的核酸序列检测结果为a，实施例2的核酸序列检测结果为b，对比例1的seekone dd 3’转录组文库检测结果为c；实施例1～2的重复实验、实施例3的检测结果如图8所示，通过实施例1检测结果与对比例1测结果比对可知，本发明方法能实现3
‘
转录组的构建，而实施例2检测结果表明，相较于seekone dd 3’转录组文库(c)，实施例2文库中的细胞标签更均匀分布在rna全长上。此外，本发明也可实现5’转录组的构建，且实施例3构建出的文库偏向于核酸序列的5’端。
[0230]
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
技术特征：1.一种功能序列，其特征在于，所述功能序列包括：标签体以及连接在所述标签体一端的接头1；其中，所述标签体包括细胞标签。2.如权利要求1所述的功能序列，其特征在于，所述标签体还包括分子标签；和/或，所述功能序列还包括引物结合序列，所述引物结合序列连接在所述标签体的另一端。3.一种标签群，其特征在于，所述标签群包括多个细胞标签群，各所述细胞标签群包括多条如权利要求1或2所述的功能序列，同一所述细胞标签群的多条所述功能序列的所述细胞标签相同，且不同所述细胞标签群的多条所述功能序列的所述细胞标签不同。4.如权利要求3所述的标签群，其特征在于，各所述细胞标签群包括105～10
10
条功能序列；和/或，所述功能序列还包括分子标签，各所述功能序列的所述分子标签不同；和/或，各所述细胞标签群还包括一个微珠本体，各所述细胞标签群的多条所述功能序列与对应的所述微珠本体连接，且各所述功能序列与所述微珠本体可条件性断开。5.一种单细胞rna建库方法，其特征在于，所述单细胞rna建库方法包括以下步骤：将多个细胞的目标rna、逆转录体系、连接体系和如权利要求3所述的标签群采用封闭体系封闭，形成多个封闭反应体系，其中，各所述封闭反应体系中包含同一细胞的多个目标rna和一个所述细胞标签群，不同所述封闭反应体系中包含不同的所述细胞标签群和不同细胞的多个的所述目标rna；在各所述封闭反应体系中，在所述逆转录体系作用下进行逆转录反应得到多条cdna，且各所述cdna具有接头1’；将各所述封闭反应体系中的得到的多条所述cdna在所述连接体系作用下，所述接头1’与各功能序列的所述接头1一一对应形成双链后，得到标记cdna；将所述标记cdna进行富集，并引入文库标签，得到单细胞rna测序文库。6.如权利要求5所述的单细胞rna建库方法，其特征在于，各所述细胞标签群还包括一个微珠本体，各所述细胞标签群的多条所述功能序列与对应的所述微珠本体连接，且各所述功能序列与所述微珠本体可条件性断开；所述将各所述封闭反应体系中的得到的多条所述cdna在所述连接体系作用下，所述接头1’与各所述功能序列的所述接头1一一对应形成双链后，得到所述标记cdna的步骤包括：将各所述功能序列与所述微珠本体条件性断裂，裂解微珠本体后，将各所述封闭反应体系中的得到的多条所述cdna的所述接头1’与各所述功能序列的所述接头1一一对应形成双链后，得到所述标记cdna。7.如权利要求5所述的单细胞rna建库方法，其特征在于，所述逆转录体系包括逆转录引物和逆转录酶，所述逆转录引物包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物包括逆转录序列以及第一序列，所述逆转录引物可对所述目标rna进行逆转录，所述反向引物包括第二序列以及第三序列，所述第一序列与所述第二序列互补，所述第三序列与所述所述接头1’的序列一致；和/或，所述连接体系包括dna连接酶。8.如权利要求7所述的单细胞rna建库方法，其特征在于，所述逆转录序列包括随机序列和/或固定序列，所述功能序列包括分子标签，所述分子标签与所述细胞标签共同构成标签体；和/或，
所述逆转录酶具有模板转换功能，所述逆转录体系还包括模板转换序列；和/或，所述逆转录引物还包括第一链合成引物，所述第一链合成引物用于cdna第一链的合成。9.如权利要求8所述的单细胞rna建库方法，其特征在于，所述将多个细胞的目标rna、逆转录体系、连接体系和所述标签群采用封闭体系封闭，形成多个封闭反应体系的步骤包括：制备多个细胞相体系，各所述细胞相体系包括一个细胞、所述逆转录体系以及所述连接体系；准备多个标签相，所述标签相包含一个细胞标签群及表面活性剂；所述封闭体系为油相，将各个所述细胞相体系及标签相分别采用所述封闭体系进行封闭，待所述细胞裂解，释放出对应细胞的多个所述目标rna，形成多个油包水的封闭反应体系。10.一种单细胞rna建库试剂盒，其特征在于，所述单细胞rna建库试剂盒包括：如权利要求3所述的标签群；逆转录体系，所述逆转录体系用于将目标rna进行逆转录得到cdna，所述cdna具有接头1’，所述接头1’可与所述接头1形成双链；连接体系，所述连接体系用于dna连接；封闭体系，所述封闭体系用于将多个细胞的目标rna、所述逆转录体系、所述连接体系和所述标签群封闭，形成多个封闭反应体系，同一所述封闭反应体系中包含同个细胞的多个目标rna和一个细胞标签群，不同所述封闭反应体系中包含不同的细胞标签群和不同细胞的多个的目标rna；以及，富集建库体系，所述富集建库体系用于将所述cdna进行扩增并通过index pcr加上样品文库标签。
技术总结本发明属于单细胞建库领域，具体涉及一种功能序列、包含其的标签群以及应用，所述功能序列包括：标签体以及与所述标签体连接的接头1；其中，所述标签体包括细胞标签。本发明中，通过在细胞标签上连接上接头1，可以使其进行组合成标签群后，配合游离的逆转录引物，即可对于不同细胞的cDNA进行细胞标签标记，以此可以进行单细胞检测。通用性强，不仅可实现3’、5’及全序列单细胞转录组的检测，也可以适用于各种目标RNA的设计，同时配合使用封闭体系，进一步的避免细胞间的污染，使得可以进行高通量单细胞检测。胞检测。胞检测。
技术研发人员：桑国芹 石焕焕 韩金桓 罗云超 孙佳成 赵萌 谢莹莹 李研 关荧 韦秋霞 焦少灼 李宗文
受保护的技术使用者：北京寻因生物科技有限公司
技术研发日：2022.07.21
技术公布日：2022/11/1
