检测sars-cov-2的组合物、试剂盒、方法及其用途
技术领域
1.本发明属于分子生物学检测领域；具体地，涉及sars-cov-2的检测；更具体地，涉及sars-cov-2变异株的检测以及分型。
背景技术：2.新型冠状病毒(2019-ncov，sars-cov-2)，在2020年2月11日国际病毒分类委员会将该病毒命名为sars-cov-2。冠状病毒是一个大型病毒家族，在此之前已知有6种可以感染到人类，如可引起感冒以及中东呼吸综合征(mers)和严重急性呼吸综合征(sars)等，而sars-cov-2是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，该病毒在分类学上属于冠状病毒科(coronaviridae)冠状病毒属(coronavirus)中的β类型冠状病毒，具有囊膜和刺突细胞学特征基因组为线性单股正链的rna((+)ssrna)病毒。
3.新冠肺炎常见体征有发热、咳嗽、气促和呼吸困难等呼吸道症状。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，进一步导致死亡。目前对于2019新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法，但许多症状可以对症进行辅助护理和支持性治疗。
4.随着传播的日益严重，越来越多的变异株不断涌现，变异株的毒力和传播能力都有很大的不同，据世界卫生组织官网显示，目前全世界已经发现数百种新冠病毒的变种，不同的变种，毒力和传播力均不一致，因此，为了节约医疗资源，减轻医疗系统负担，需要一种能够准确检测各种变异株的试剂，以便针对性采取防疫和治疗措施，使得应对更为效率。同时，检测所需时间短，灵敏度高。
5.因此，本领域需求一种能够准确检测新冠多个变异株的试剂，以便针对性采取防疫和治疗措施，使得应对更为效率。同时，检测所需时间短，灵敏度高。
技术实现要素：6.有鉴于此，第一方面，本发明提供了一种能够检测sars-cov-2变异株并分型的组合物，所述组合物同时包括：
7.第一核酸组合物：
8.如seq id no:1所示的突变q954h上游引物、如seq id no:2所示的突变q954h下游引物，和如seq id no:3所示的突变q954h探针；
9.第二核酸组合物：
10.如seq id no:4所示的突变s982a上游引物、如seq id no:5所示的突变s982a下游引物，和如seq id no:6所示的突变s982a探针；
11.如seq id no:7所示的突变k417n上游引物、如seq id no:8所示的突变k417n下游引物，和如seq id no:9所示的突变k417n探针；和
12.如seq id no:10所示的突变e484k上游引物、如seq id no:11所示的突变e484k下游引物，和如seq id no:12所示的突变e484k探针；
13.第三核酸组合物：
14.如seq id no:13所示的突变t478k上游引物、如seq id no:14所示的突变t478k下游引物，和如seq id no:15所示的突变t478k探针；
15.如seq id no:16所示的突变69-70del上游引物、如seq id no:17所示的突变69-70del下游引物，和如seq id no:18所示的突变69-70del探针；和
16.如seq id no:19所示的突变l452r上游引物、如seq id no:20所示的突变l452r下游引物，和如seq id no:21所示的突变l452r探针；以及
17.第四核酸组合物：
18.如seq id no:22所示的突变k417t上游引物、如seq id no:23所示的突变k417t下游引物，和如seq id no:24所示的突变k417t探针；和
19.如seq id no:25所示的突变t76i上游引物、如seq id no:26所示的突变t76i下游引物，和如seq id no:27所示的突变t76i探针。
20.本发明提供的检测sars-cov-2变异株并分型的试剂盒，主要利用多重荧光pcr分析方法，通过检测sars-cov-2变异株上的不同的特征功能变异位点，对变异株进行分型，从而在反应体系中同时实现sars-cov-2变异株分型的检测。使得不同毒株能够得到区别对待，从而使得治疗和预防更效率。本发明的组合物，成本低，通量高。并且操作简便，结果读取过程通过不同通道即可以判定。检测全过程均在封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染。
21.在一些具体的实施方案中，第一核酸组合物还可以包括如seq id no:28所示的orf1ab上游引物、如seq id no:29所示的orf1ab下游引物，和如seq id no:30所示的orf1ab探针。
22.在一些具体的实施方案中，第一核酸组合物还可以包括如seq id no:31所示的n基因上游引物、如seq id no:32所示的n基因下游引物，和如seq id no:33所示的n基因探针。
23.在一些具体的实施方案中，本发明所述组合物每核酸组合物均可以包括如seq id no:34所示的内参基因上游引物、如seq id no:35所示的内参基因下游引物，和如seq id no:36所示的内参基因探针。
24.进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个突变的互相匹配的上游、下游引物和探针。
25.举例来说，可以只包括第一核酸组合物；可以只包括第二核酸组合物；可以只包括第三核酸组合物；可以只包括第四核酸组合物。
26.举例来说，还可以只包括不同核酸组合物的一些引物和探针对，例如，包括如seq id no:1所示的突变q954h上游引物、如seq id no:2所示的突变q954h下游引物，和如seq id no:3所示的突变q954h探针；如seq id no:4所示的突变s982a上游引物、如seq id no:5所示的突变s982a下游引物，和如seq id no:6所示的突变s982a探针；以及如seq id no:13所示的突变t478k上游引物、如seq id no:14所示的突变t478k下游引物，和如seq id no:15所示的突变t478k探针。
27.进一步地，第一、第二、第三以及第四核酸组合物每组之内的探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
28.在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一
样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用fam、hex、rox和cy5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
29.在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光pcr。
30.在本发明中，荧光报告基团可以选自fam、hex、rox、vic、cy5、5-tamra、tet、cy3和joe，但不限于此。
31.在一个具体的实施方案中，seq id no:3、9、18和27荧光报告基团为rox；seq id no:6、15和24的荧光报告基团为fam；seq id no:12、21和27的荧光报告基团为cy5。
32.进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如bhq1或bhq2或mgb。
33.在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为bhq1。
34.进一步地，所述组合物中引物的用量为0.1～0.3μm；所述组合物中探针的用量为0.1～0.3μm。
35.在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各核酸组合物分别存在于单独包装中。
36.在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各核酸组合物存在于同一个包装中。
37.进一步地，本发明的组合物的每一核酸组合物中的各成分以混合的形式存在。
38.第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测sars-cov-2变异株并分型的试剂盒中的用途。
39.第三方面，本发明提供了一种检测sars-cov-2变异株并分型的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。
40.进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
41.在一个具体的实施方案中，阴性质控品是depc h2o、生理盐水、内参基因假病毒中的至少一种。阳性质控品是含新型冠状病毒s靶基因、新型冠状病毒n靶基因、新型冠状病毒各突变位点及内参基因目的片段质粒、片段rna、假病毒中的至少一种。
42.进一步地，所述试剂盒还包括dntp、pcr缓冲液以及mg
2+
中的至少一种。
43.更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、核酸提取试剂、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶以及dna聚合酶中的至少一种。
44.更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dntp、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶、dna聚合酶、pcr缓冲液以及mg
2+
中的至少一种。
45.进一步地，所述逆转录酶的浓度为5u/反应～15u/反应，例如逆转录酶可以是鼠白血病逆转录酶(mmlv)或者tth酶；所述dna聚合酶的浓度为3u/反应～15u/反应，例如dna聚合酶可以是taq酶。
46.在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括：反/逆转录酶、taq酶、尿嘧啶糖基化酶、mg
2+
、mn
2+
、rnasin、dntp、引物、探针和pcr缓冲液。
47.常见的pcr缓冲液由tris-hcl、mgcl2、kcl、triton x-100等缓冲体系构成。一般单个pcr反应管中总体积为20-100μl。
48.在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字pcr扩增体系，即可以直接用于数字pcr仪上进行扩增。
49.第四方面，提供了一种用于检测sars-cov-2变异株并分型的方法，所述方法包括
以下步骤：
50.1)提取或释放待测样本的核酸；
51.2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量pcr分析；
52.3)获得并分析结果。
53.在本发明中，用于检测的样本可以是咽拭子、口咽拭子、鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液等，但不限于此。
54.进一步地，所述荧光定量pcr的反应条件为：
55.逆转录，温度为50℃～60℃，时间5～30分钟，1次循环；cdna预变性，温度为95℃，时间1～10分钟，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55～60℃，时间为20～60秒，40～50次循环，采集荧光。
56.在一个具体的实施方案中，提供了一种用于以非诊断目的检测sars-cov-2变异株并分型的方法，所述方法包括以下步骤：
57.1)提取或释放待测样本的核酸；
58.2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量pcr分析；
59.3)获得并分析结果。
60.进一步地，所述荧光定量pcr的反应条件为：
61.逆转录，温度为50℃～60℃，时间5～30分钟，1次循环；cdna预变性，温度为95℃，时间1～10分钟，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55～60℃，时间为20～60秒，40～50次循环，采集荧光。
62.在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染sars-cov-2变异株并罹患肺炎的信息。例如，该方法可以在以科研为目的的实验中的检测培养物中检测是否有sars-cov-2变异株并分型。
附图说明
63.图1～4为本发明组合物检测alpha变异株检测结果；
64.图5～8为本发明组合物检测beta变异株检测结果；
65.图9～12为本发明组合物检测gamma变异株检测结果；
66.图13～16为本发明组合物检测delta变异株检测结果；
67.图17～20为本发明组合物检测omicron ba.1变异株检测结果；
68.图21～24为本发明组合物检测omicron ba.2变异株检测结果；
69.图25～28为本发明组合物检测lambda变异株检测结果；
70.图29～32为本发明组合物检测野生型检测结果；
71.图33～40为本发明组合物的灵敏度检测结果(分别为alpha、beta、gamma、delta、omicron ba.1、omicron ba.2、lambda以及野生型)；
72.图41～42为本发明组合物的特异性检测结果；
73.图43～45为本发明对比例组合物的检测结果。
具体实施方式
74.在本发明中，表述“第一”、“第二”、“第三”，和“第四”等仅用于描述目的，用以区分所限定的物质，而不以任何方式限定次序或主次。
75.下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
76.实施例1、本发明所使用的引物及探针
77.表1
78.[0079][0080]
实施例2、检测sars-cov-2的方法
[0081]
1.标本类型：口咽拭子、鼻咽拭子。
[0082]
2.核酸提取：
[0083]
采用商品化rna提取试剂盒，如基于硅胶膜离心柱法的核酸提取试剂或基于磁珠法核酸提取的试剂，并按试剂盒说明书进行操作，最后收集到80μl rna溶液，直接进行检
测。
[0084]
或保存于-80℃。阴性质控品、阳性质控品均需进行提取。
[0085]
3.体系配置：
[0086]
根据检测所需总反应数n，每管pcr加入16.5μl rt-pcr扩增液(mgcl26mm、dntp 0.8mm，以及上游引物/下游引物浓度均为0.2μm，探针浓度为0.25μm，通用上游引物6μm，通用下游引物6μm)及3.5μl的酶混合液(热启动taq酶、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶(ung))。计算所需的总量，混匀后再分装到特制的pcr反应管中。
[0087]
4.加样：
[0088]
向已分装有试剂的pcr反应管中分别加入阴性质控品，样本rna溶液，阳性质控品，加样量均为20μl，盖紧管盖，混匀，离心收集溶液置管底。
[0089]
5.上机扩增检测：
[0090]
rt-pcr扩增程序的设定如下表2所示：
[0091]
表2
[0092][0093]
6.结果分析：
[0094]
在满足扩增有效的前提下，判定依据如表3～4所示：
[0095]
表3
[0096][0097]
*hv69-70del扩增曲线阳性[ct(+)]代表样本中没有携带hv69-70del突变，hv69-70del扩增曲线阴性[ct(-)]代表样本中携带hv69-70del突变。
[0098]
新型冠状病毒各变异株分型判定依据如下：
[0099]
表4
[0100][0101]
实施例3、本发明组合物测试样本的检测结果
[0102]
将实施例1所示的引物和探针，按照实施例2的方法对新冠野生型及新冠变异株alpha、beta、gamma、delta、omicron ba.1、omicron ba.2、lambda的假病毒样本进行验证，结果显示以上变异株分型正确，且与其他变异株无交叉反应，说明试剂盒能准确的将所检测的变异株与其他变异株进行鉴别诊断，检测见下图1～32所示。
[0103]
实施例4、本发明组合物的灵敏度
[0104]
将新冠各变异株及野生型假病毒分别用阴性样本稀释浓度至100拷贝/ml，以验证本试剂及检测方法的灵敏度。检测结果如图33～40所示，所有100拷贝/ml的假病毒模拟样本均能准确检出，表明该检测方法具较高的灵敏度。
[0105]
实施例5、本发明组合物的特异性
[0106]
将地方性人类冠状病毒(hku1，oc43，nl63和229e)、sars冠状病毒、mers冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒的假病毒稀释至1
×
106拷贝/ml作为特异性检测样本用本发明实施例1所述组合物进行检测，实验结果发现均未出现特异性扩增，部分检测结果如图41～42所示。
[0107]
检测结果表明，地方性人类冠状病毒(hku1、oc43、nl63和229e)、sars冠状病毒、mers冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒，共8种病原体，检测结果均为阴性，表明本发明组合物的特异性好。
[0108]
对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物和探针
[0109]
由于碱基互补配对原则，引物和(或)探针之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性(保守性对检测的准确性至关重要)，又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计。
[0110]
因此，发明人还设计了其余一些引物和探针(序列未示出)组成了不同的检测体系1、2和3，同样用于检测新冠变异株。具体检测结果如图43～45所示，从图中可以看出检测只出现部分扩增曲线，且扩增曲线增幅低重复性差，而其他靶标甚至无扩增曲线，因此，整体检测效果差。
技术特征：1.一种能够检测sars-cov-2变异株并分型的组合物，所述组合物同时包括：第一核酸组合物：如seq id no:1所示的突变q954h上游引物、如seq id no:2所示的突变q954h下游引物，和如seq id no:3所示的突变q954h探针；第二核酸组合物：如seq id no:4所示的突变s982a上游引物、如seq id no:5所示的突变s982a下游引物，和如seq id no:6所示的突变s982a探针；如seq id no:7所示的突变k417n上游引物、如seq id no:8所示的突变k417n下游引物，和如seq id no:9所示的突变k417n探针；和如seq id no:10所示的突变e484k上游引物、如seq id no:11所示的突变e484k下游引物，和如seq id no:12所示的突变e484k探针；第三核酸组合物：如seq id no:13所示的突变t478k上游引物、如seq id no:14所示的突变t478k下游引物，和如seq id no:15所示的突变t478k探针；如seq id no:16所示的突变69-70del上游引物、如seq id no:17所示的突变69-70del下游引物，和如seq id no:18所示的突变69-70del探针；和如seq id no:19所示的突变l452r上游引物、如seq id no:20所示的突变l452r下游引物，和如seq id no:21所示的突变l452r探针；以及第四核酸组合物：如seq id no:22所示的突变k417t上游引物、如seq id no:23所示的突变k417t下游引物，和如seq id no:24所示的突变k417t探针；和如seq id no:25所示的突变t76i上游引物、如seq id no:26所示的突变t76i下游引物，和如seq id no:27所示的突变t76i探针。。2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述第一核酸组合物还可以包括如seq id no:28所示的orf1ab上游引物、如seq id no:29所示的orf1ab下游引物，和如seq id no:30所示的orf1ab探针，和/或如seq id no:31所示的n基因上游引物、如seq id no:32所示的n基因下游引物，和如seq id no:33所示的n基因探针。3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述核酸组合物均包括如seq id no:34所示的内参基因上游引物、如seq id no:35所示的内参基因下游引物，和如seq id no:36所示的内参基因探针。4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述第一、第二、第三以及第四核酸组合物每组之内的探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。5.根据权利要求4所述的组合物，其中，seq id no:3、9、18和27荧光报告基团为rox；seq id no:6、15和24的荧光报告基团为fam；seq id no:12、21和27的荧光报告基团为cy5。6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物，其中，所述组合物的各核酸组合物分别存在于单独包装中。7.权利要求1～6中任一项所述的组合物在制备检测sars-cov-2变异株并分型的试剂盒中的用途。8.一种检测sars-cov-2变异株并分型的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1～6中任一
项所述的组合物。9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dntp、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶、dna聚合酶、pcr缓冲液以及mg
2+
中的至少一种。10.一种用于以非诊断目的检测sars-cov-2变异株并分型的方法，所述方法包括以下步骤：1)提取或释放待测样本的核酸；2)使用如权利要求1～6中任一项所述的组合物或如权利要求8～9中任一项所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量pcr分析；3)获得并分析结果。
技术总结本发明属于分子生物学检测领域；具体地，涉及SARS-CoV-2的检测；更具体地，涉及SARS-CoV-2变异株的检测以及分型。本发明提供了包含所述组合物的试剂盒，所述组合物的用途，以及用于检测SARS-CoV-2变异株并分型的方法。本发明通过检测SARS-CoV-2变异株上的不同的特征功能变异位点，对变异株进行分型，从而在反应体系中同时实现SARS-CoV-2变异株分型的检测。使得不同毒株能够得到区别对待，从而使得治疗和预防更效率。本发明的组合物，成本低，通量高。并且操作简便，结果读取过程通过不同通道即可以判定。检测全过程均在封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染。污染。污染。
技术研发人员：冯铁建 何雅青 吴春利 郭永超 谭爱女 徐露
受保护的技术使用者：深圳联合医学科技有限公司
技术研发日：2022.05.27
技术公布日：2022/11/1
