1.本发明涉及免疫细胞效能评价领域，具体涉及一种免疫细胞治疗制剂体外 杀伤效力评价方法及其应用。
背景技术：2.免疫细胞治疗是被认为最有希望攻克肿瘤的创新疗法之一。免疫治疗也称 为过继细胞(act)治疗，是基于免疫学原理与方法，采集人体免疫细胞，进 行体外培养和扩增，以增强靶向性杀伤功能，再输回人体内，通过调动机体免 疫系统杀伤血液与组织中的病原体、癌细胞及突变细胞，抑制肿瘤生长，增强 机体免疫能力。这种个性化治疗方案对应的治疗成本较为昂贵，但免疫细胞治 疗所具备的诸多优势仍让全球肿瘤患者心向往之。免疫细胞治疗是一个复杂的 过程，包括细胞提取、细胞分离、细胞培养、质量管控、细胞回输及疗效评估 六大环节，每个环节对技术与实验环境均有较高要求。其中，杀伤效力质量控 制是难点之一。
3.常用的细胞杀伤检测方法有镉51释放实验、乳酸脱氢酶(ldh)释放法、 batda法、cam法、cytotox-glo法和pkh法等。其中经典的方法是镉51释 放实验，该方法可重复性好，但是，因其使用同位素标记靶细胞，从而存在半 衰期短、同位素废弃物处理及实验防护要求高等多种限制因素，尤其是放射性 同位素的使用对健康以及环境具有巨大威胁，其他放射性同位素标记靶细胞如 h3亦具有此类缺陷，使该类方法的应用受到局限，因此，很多研究者会采用其 它替代方法进行生物学效力检测。传统的ldh法灵敏度及可重复性不稳定，且 所需时间较长，批间变异较大，不能适应免疫细胞效期短的特点。
4.镉51释放实验、ldh法、batda法和cytotox-glo法都属于间接法，即 先用某一试剂对靶细胞进行标记，然后和不同浓度的免疫细胞进行孵育，当靶 细胞受到免疫细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，这些物质会释放到上 清中，通过测定释放物质的含量可以测定免疫细胞的活性。但是，上述方法的 标记试剂对靶细胞标记后，靶细胞会出现自发释放标记试剂的现象，标记试剂 从靶细胞自发释放至上清液中，自发释放的标记试剂以及细胞损伤后释放到上 清中的标记物质，无法区分，导致检测结果偏大。
5.cam法及pkh法是通过流式细胞仪检测活细胞标记及死亡标记双信号来 反映其杀伤效率，与前述方法相比，这两种方法所反映的信号还包括处于凋亡 状态的细胞。其中，流式细胞术(flow cytometry，fcm)是一种在液流系统中快 速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加 以分类收集的技术。鉴于其在单细胞水平上高效准确的定量分析优势，目前涌 现出多种以流式细胞术为基础的nk细胞杀伤活性的测定方法，基于流式细胞 术的荧光染料标记细胞的方法中，常用csfe、mtg、dio以及cam四种染料 评价nk细胞的细胞毒活性，但是荧光染料标记细胞后，标记的活细胞会出现 对上述染料的自发释放现象，对于效细胞与靶细胞区分是不利的，会导致很大 的检测偏差。
技术实现要素：6.本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种免疫细胞治疗 制剂体外杀伤效力评价方法及其应用。
7.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种免疫细胞治疗制剂体外 杀伤效力评价方法，所述方法包括以下步骤：
8.(1)采用电穿孔技术将吲哚七甲川花菁染料导入靶细胞对靶细胞进行标 记；
9.(2)将标记吲哚七甲川花菁染料的靶细胞与免疫细胞共培养，作为体系a； 将标记吲哚七甲川花菁染料的靶细胞单独培养，作为体系b；体系b与体系a 相比，除不含有免疫细胞外，其余保持一致；
10.(3)培养后收集体系a的上清液a并检测荧光信号强度ia；
11.(4)将体系b中的靶细胞破坏后收集上清液b检测荧光信号强度ib；
12.(5)免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力以靶细胞死亡率w进行评价，即 w＝ia/ib
×
100％。
13.上述的免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力评价方法以吲哚七甲川花菁染料对 靶细胞进行标记，吲哚七甲川花菁染料为大分子染料，无法自由穿过细胞膜， 通过电穿孔技术将吲哚七甲川花菁染料导入靶细胞对靶细胞进行标记，七甲川 花菁染料无法自由穿过细胞膜，经标记导入后不会发生自发释放标记物的现象， 避免了自发释放的标记试剂以及细胞损伤后释放到上清中的标记物质无法区分 导致检测结果偏大的问题，作为免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力评价方法具有 更好的准确性。
14.优选地，所述吲哚七甲川花菁染料为吲哚七甲川花菁染料ir-780、吲哚七 甲川花菁染料ir-783、吲哚七甲川花菁染料ir-808。
15.吲哚七甲川花菁染料ir-780、吲哚七甲川花菁染料ir-783、吲哚七甲川花 菁染料ir-808作为靶细胞标记物，不会发生自发释放标记物的现象，细胞毒性 极低。
16.优选地，采用电穿孔技术将吲哚七甲川花菁染料导入靶细胞包括以下步骤：
17.(ⅰ)将低导电性电穿孔缓冲液与悬浮有靶细胞的培养基混合得到混合液， 所述低导电性电穿孔缓冲液包括氯化镁、磷酸盐和吲哚七甲川花菁染料；
18.(ⅱ)在混合液中加入碘化丙啶，施加脉冲电压。
19.采用上述低导电性电穿孔缓冲液和碘化丙啶，具有更高的染色效率，有利 于提高评价方法的灵敏度。
20.优选地，脉冲电压的电场强度为0.2～2.5kv/cm。
21.优选地，施加脉冲电压时设置6～10个脉冲，所述脉冲电压的脉冲持续时间 为80～120μs，所述脉冲电压的脉冲频率为0.8～1.2hz。
22.采用上述参数的脉冲电压，具有更高的染色效率，有利于提高评价方法的 灵敏度。
23.优选地，所述低导电性电穿孔缓冲液的ph为7.3～7.5，混合液中吲哚七甲 川花菁染料的浓度为200～300mm，混合液中细胞的浓度为(0.5～1.5)
×
107个 /ml，混合液中氯化镁的浓度为0.8～1.2mm。
24.优选地，所述步骤(ⅱ)中，混合液中加入碘化丙啶至浓度为120～180μm。
25.优选地，所述步骤(4)中，靶细胞破坏的方法为蒸馏水细胞吸水涨破。
26.本发明还提供上述任一所述的评价方法在在非疾病的诊断和治疗目的、检 测细胞杀伤力或制备免疫细胞制剂中的应用。
27.本发明的有益效果在于：本发明提供了一种免疫细胞治疗制剂体外杀伤效 力评价方法及其应用，本发明的免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力评价方法以吲 哚七甲川花菁染料对靶细胞进行标记，吲哚七甲川花菁染料为大分子染料，无 法自由穿过细胞膜，通过电穿孔技术将吲哚七甲川花菁染料导入靶细胞对靶细 胞进行标记，七甲川花菁染料无法自由穿过细胞膜，经标记导入后不会发生自 发释放标记物的现象，避免了自发释放的标记试剂以及细胞损伤后释放到上清 中的标记物质无法区分导致检测结果偏大的问题，作为免疫细胞治疗制剂体外 杀伤效力评价方法具有更好的准确性。
具体实施方式
28.为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对 本发明作进一步说明。
29.实施例1
30.作为本发明实施例的一种免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力评价方法，一种 免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力评价方法，所述方法包括以下步骤：
31.(1)采用电穿孔技术将吲哚七甲川花菁染料导入靶细胞对靶细胞进行标 记；
32.(2)将标记吲哚七甲川花菁染料的靶细胞与免疫细胞共培养，作为体系a； 将标记吲哚七甲川花菁染料的靶细胞单独培养，作为体系b；体系b与体系a 相比，除不含有免疫细胞外，其余保持一致；
33.(3)培养后收集体系a的上清液a并检测荧光信号强度ia；
34.(4)将体系b中的靶细胞破坏后收集上清液b检测荧光信号强度ib；靶细 胞破坏的方法为将体系b在500g低速离心后，用蒸馏水悬浮细胞，细胞吸水涨 破，收集上清液b；
35.(5)免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力以靶细胞死亡率w进行评价，即 w＝ia/ib
×
100％；
36.其中吲哚七甲川花菁染料为吲哚七甲川花菁染料ir-780；
37.采用电穿孔技术将吲哚七甲川花菁染料导入靶细胞包括以下步骤：
38.(ⅰ)将20mm k2hpo4、20mm kh2po4、2mm氯化镁和500mm吲哚 七甲川花菁染料ir-780配置为低导电性电穿孔缓冲液，低导电性电穿孔缓冲液 的ph为7.4，与悬浮有2
×
107个/ml靶细胞的培养基按照体积比1:1混合得到 混合液；
39.(ⅱ)在混合液中加入碘化丙啶至浓度为150μm并转移至一次性电穿孔比 色皿中，施加脉冲电压，电极的距离为2mm，脉冲电压的电场强度为1.0kv/cm， 设置8个脉冲，脉冲电压的脉冲持续时间为100μs，脉冲电压的脉冲频率为1hz。
40.实施例2
41.作为本发明实施例的一种免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力评价方法，本实 施例与实施例1的唯一区别为：吲哚七甲川花菁染料ir-783。
42.实施例3
43.作为本发明实施例的一种免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力评价方法，本实 施例与实施例1的唯一区别为：吲哚七甲川花菁染料ir-808。
44.试验例
45.一、试样材料：
46.1、靶细胞培养：人黑色素瘤m21细胞在含10％fbs的rpmi1640培养基 培养，收集对数生长期的靶细胞，用缓冲溶液(pbs)洗涤一次后，培养基重悬 至2
×
107细胞/ml。
47.2、免疫细胞培养：nk-92细胞在含500iu/ml il-2的gh t551 h3培养基培 养，收集对数生长期的靶细胞，用缓冲溶液(pbs)洗涤一次后，培养基重悬至 1
×
106细胞/ml。
48.二、试验方法
49.1、靶细胞标记：将20mm k2hpo4、20mm kh2po4、2mm氯化镁和500 mm吲哚七甲川花菁染料ir-780配置为低导电性电穿孔缓冲液，低导电性电穿 孔缓冲液的ph为7.4，与悬浮有2
×
107个/ml靶细胞的培养基按照体积比1:1 (100μl：100μl)混合得到混合液；在混合液中加入碘化丙啶至浓度为150 μm并转移至一次性电穿孔比色皿中，施加脉冲电压，电极的距离为2mm，脉 冲电压的电场强度为1.0kv/cm，设置8个脉冲，脉冲电压的脉冲持续时间为100 μs，脉冲电压的脉冲频率为1hz。
50.脉冲结束后500g低速离心后，用含10％fbs的rpmi1640培养基重悬至细 胞浓度1
×
105个/ml。用于细胞培养。
51.同理用吲哚七甲川花菁染料ir-783、吲哚七甲川花菁染料ir-808进行标记。
52.2、免疫细胞杀伤实验：吸取100μl标记后的靶细胞于96孔板，吸取nk-92 细胞与标记细胞混合，nk-92细胞与标记靶细胞的比例为10：1；在37℃，5％co2的条件下孵育2小时，将96孔板500g下5min，收集上清液检测荧光信号强度 ia。设置6个平行。
53.吸取100μl标记后的靶细胞于96孔板，吸取与nk-92细胞等体积的磷酸 盐缓冲液与标记细胞混合，在37℃，5％co2的条件下孵育2小时，将96孔板 500g下5min，收集上清液检测荧光信号强度i1。将离心后的细胞在蒸馏水中重 悬，细胞吸水涨破，收集上清液b，检测荧光信号强度ib。设置6个平行。
54.3、空白试验：将20mm k2hpo4、20mm kh2po4、2mm氯化镁和500mm 吲哚七甲川花菁染料ir-780配置为低导电性电穿孔缓冲液，低导电性电穿孔缓 冲液的ph为7.4，与悬浮有2
×
107个/ml靶细胞的培养基按照体积比1:1(100 μl：100μl)混合得到混合液；混合液在37℃，5％co2的条件下孵育30min。 500g离心后用磷酸盐缓冲溶液冲洗细胞，清洗后再次离心，将离心后的细胞在 蒸馏水中重悬，细胞吸水涨破，收集上清液检测荧光信号强度i2。
55.4、上清液检测荧光信号强度检测：thermo酶标仪，波长范围340～850nm， 分别在波长780nm、783nm、808nm波长位置检测对应标记物标记试验的荧光信 号强度i。
56.实验结果：
57.1、标记后的人黑色素瘤m21细胞培养后的上清液中，荧光信号强度i1检 测不到信号强度，说明吲哚七甲川花菁染料ir-780、吲哚七甲川花菁染料ir-783、 吲哚七甲川花菁染料ir-808标记后的靶细胞在培养过程中，不存在自发释放标 记物质吲哚七甲川花菁染料的现象。
58.2、空白试验的上清液中，荧光信号强度i2检测不到信号强度，说明吲哚七 甲川花菁染料ir-780、吲哚七甲川花菁染料ir-783、吲哚七甲川花菁染料ir-808 不能通过细胞膜，不能自发进入靶细胞。
59.3、免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力以靶细胞死亡率w进行评价，即w＝ia/ib
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100％，结果如表1所示。
60.表1靶细胞死亡率(％)
[0061][0062][0063]
由实验结果可知，实施例1-实施例3的免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力评 价方法的rsd在2.69％至11.9％之间，精密度较好，低于15％，满足分析方法 精密度的要求。且通过空白实验，可以说明，吲哚七甲川花菁染料为大分子染 料，无法自由穿过细胞膜，通过电穿孔技术将吲哚七甲川花菁染料导入靶细胞 对靶细胞进行标记，七甲川花菁染料无法自由穿过细胞膜，经标记导入后不会 发生自发释放标记物的现象，避免了自发释放的标记试剂以及细胞损伤后释放 到上清中的标记物质无法区分导致检测结果偏大的问题。
[0064]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的实质和范围。
技术特征：1.一种免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力评价方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)采用电穿孔技术将吲哚七甲川花菁染料导入靶细胞对靶细胞进行标记；(2)将标记吲哚七甲川花菁染料的靶细胞与免疫细胞共培养，作为体系a；将标记吲哚七甲川花菁染料的靶细胞单独培养，作为体系b；体系b与体系a相比，除不含有免疫细胞外，其余保持一致；(3)培养后收集体系a的上清液a并检测荧光信号强度i
a
；(4)将体系b中的靶细胞破坏后收集上清液b检测荧光信号强度i
b
；(5)免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力以靶细胞死亡率w进行评价，即w＝ia/ib
×
100％。2.根据权利要求1所述的免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力评价方法，其特征在于，所述吲哚七甲川花菁染料为吲哚七甲川花菁染料ir-780、吲哚七甲川花菁染料ir-783、吲哚七甲川花菁染料ir-808。3.根据权利要求1所述的免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力评价方法，其特征在于，采用电穿孔技术将吲哚七甲川花菁染料导入靶细胞包括以下步骤：(ⅰ)将低导电性电穿孔缓冲液与悬浮有靶细胞的培养基混合得到混合液，所述低导电性电穿孔缓冲液包括氯化镁、磷酸盐和吲哚七甲川花菁染料；(ⅱ)在混合液中加入碘化丙啶，施加脉冲电压。4.根据权利要求3所述的免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力评价方法，其特征在于，脉冲电压的电场强度为0.2～2.5kv/cm。5.根据权利要求3所述的免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力评价方法，其特征在于，施加脉冲电压时设置6～10个脉冲，所述脉冲电压的脉冲持续时间为80～120μs，所述脉冲电压的脉冲频率为0.8～1.2hz。6.根据权利要求3所述的免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力评价方法，其特征在于，所述低导电性电穿孔缓冲液的ph为7.3～7.5，混合液中吲哚七甲川花菁染料的浓度为200～300mm，混合液中细胞的浓度为(0.5～1.5)
×
107个/ml，混合液中氯化镁的浓度为0.8～1.2mm。7.根据权利要求3所述的免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力评价方法，其特征在于，所述步骤(ⅱ)中，混合液中加入碘化丙啶至浓度为120～180μm。8.根据权利要求1所述的免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力评价方法，其特征在于，所述步骤(4)中，靶细胞破坏的方法为蒸馏水细胞吸水涨破。9.如权利要求1～8任一所述的评价方法在在非疾病的诊断和治疗目的、检测细胞杀伤力或制备免疫细胞制剂中的应用。
技术总结本发明提供了一种免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力评价方法及其应用，本发明的免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力评价方法以吲哚七甲川花菁染料对靶细胞进行标记，标记后的靶细胞与免疫细胞共同培养。吲哚七甲川花菁染料为大分子染料，无法自由穿过细胞膜，本发明通过电穿孔技术将吲哚七甲川花菁染料导入靶细胞对靶细胞进行标记，七甲川花菁染料无法自由穿过细胞膜，经标记导入后不会发生自发释放标记物的现象，避免了自发释放的标记试剂以及细胞损伤后释放到上清中的标记物质无法区分导致检测结果偏大的问题，作为免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力评价方法具有更好的准确性。伤效力评价方法具有更好的准确性。
技术研发人员：徐智峰 张新 李智耀
受保护的技术使用者：广州沙艾生物科技有限公司
技术研发日：2022.07.13
技术公布日：2022/11/1
