1.本发明属于微生物技术领域，尤其涉及褐藻寡糖在促进芽孢杆菌运动能力中的应用。
背景技术：2.在农业生产中，植物根际促生菌对作物健康和高产发挥重要影响，其应用是实现我国化学农药肥料减施、促进农业可持续发展的有效途径。目前，国内外学者已从水稻、小麦、玉米和棉花等重要作物根际分离获得大量具有防病促生效果的生防菌株，部分菌株已用于商业化生产。然而，生防菌进入土壤后面临着土著微生物的竞争及复杂的土壤环境条件，难以形成优势种群，发挥有效的生防功能，在实际应用中经常存在室内与田间防效差异大、田间防效不稳定等问题，导致其农业应用受到阻碍。高效的根际定殖是微生物发挥各种植物益生功能的重要前提，因此解决微生物菌株在植物根际定殖难的问题是破解生防菌农业应用受限的关键，而菌株在土壤或植物表面的运动能力显著影响其在作物根际的定植。
3.褐藻寡糖是一种具有较强的溶解性、易吸收、安全无毒的化合物，研究发现褐藻寡糖具有抗氧化性、抑菌活性、治疗人类疾病的作用。目前褐藻寡糖在药物研制、功能食品开发领域具有广阔的开发前景，但尚未有利用褐藻寡糖促进细菌运动能力的报道。
技术实现要素：4.有鉴于此，本发明的目的在于提供褐藻寡糖在提高芽孢杆菌运动能力，促进芽孢杆菌在植物根际定植中的应用，利用褐藻寡糖有效的提高芽孢杆菌在土壤或植物表面的运动能力，进而促进菌株在植物根际的定植，同时本发明的褐藻寡糖和芽孢杆菌联合施用还能够有效促进植物的生长。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了褐藻寡糖在促进芽孢杆菌运动中的应用。
6.本发明的另一目的是提供了褐藻寡糖在促进芽孢杆菌在植物根际定植中的应用。
7.可选的，所述芽孢杆菌包括：枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中的一种或几种。
8.可选的，所述褐藻寡糖的制备方法包括以下步骤：取褐藻酸钠溶于水，加入酶裂解，离心，取上清液冷冻干燥，即得褐藻寡糖。
9.优选的，所述褐藻寡糖的制备步骤中，所述酶为褐藻酸裂解酶，酶解温度为25-32℃，酶解时间为12-18h。
10.可选的，所述褐藻寡糖分子量为1000-4000d。
11.本发明的另一目的是提供了一种芽孢杆菌菌剂，所述菌剂中包括褐藻寡糖和芽孢杆菌。
12.可选的，所述褐藻寡糖的使用浓度为1.0-7.0g/l。
13.可选的，所述菌剂的剂型可为水剂、可湿性粉剂、水分散颗粒或水悬浮剂。
14.本发明的另一目的是提供上述芽孢杆菌菌剂在促进植物生长中的应用。
15.相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
16.本发明的褐藻寡糖分子量低，具有水溶性强、稳定性高、安全无毒的理化性质。既可以为芽孢杆菌的生长提供碳源，又能够有效提高芽孢杆菌的运动能力，并且在一定量的褐藻寡糖添加范围内，对菌株运动能力的促进作用与褐藻寡糖的浓度成正相关；目前褐藻寡糖在药物研制、功能食品开发领域具有广阔的开发前景，本发明将褐藻寡糖添加到芽孢杆菌菌剂中，提供了新的对褐藻寡糖的应用。
17.本发明提供的芽孢杆菌菌剂包括褐藻寡糖和芽孢杆菌，菌剂中的褐藻寡糖能够显著促进芽孢杆菌的运动能力，进而能够促进芽孢杆菌菌株在作物根际的有效定植，从而达到进一步改良生防菌剂产品的目的。本发明的芽孢杆菌菌剂中添加的芽孢杆菌是土壤和植物微生态优势微生物种群之一，能够通过营养竞争、促进植物生长、诱导植物抗性、分泌抗菌物质的方式发挥作用，褐藻寡糖和芽孢杆菌联合施用，促进菌株在土壤或植物表面的运动能力，能够使得芽孢杆菌在植株根际快速有效定植，形成优势菌种，进而可以显著促进植物的生长。
18.生物保藏说明
19.本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌em-1(拉丁名bacillus velezensis em-1)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：cgmcc no.21131，保藏日期：2020年11月09日。
附图说明
20.图1：不同来源糖促进解淀粉芽孢杆菌cas02运动性的影响，其中，ck 为空白，cos为壳寡糖，hsg为褐藻寡糖，ht为浒苔多糖，klg为卡拉胶寡糖，klj为卡拉胶，sa为褐藻酸钠，yz为岩藻多糖，上述糖添加浓度均为5.0g/l；
21.图2：不同浓度褐藻寡糖对解淀粉芽孢杆菌cas02运动性的影响，添加浓度分别为1.0g/l，2.5g/l，5.0g/l，10.0g/l；
22.图3：褐藻寡糖促进解淀粉芽孢杆菌cas02在植物根际的有效定植，其中ck为施加无菌水，cas02为仅施加解淀粉芽孢杆菌cas02菌液， hsg+cas02为施加含有褐藻寡糖的解淀粉芽孢杆菌cas02菌液；
23.图4：不同处理烟草苗生长的农艺性状，其中ck为浇灌无菌水，hsg 为浇灌褐藻寡糖溶液，c为浇灌解淀粉芽孢杆菌cas02菌液，hsg+c为褐藻寡糖与解淀粉芽孢杆菌联合施用。
具体实施方式
24.本发明提供了褐藻寡糖在提高芽孢杆菌运动能力，促进芽孢杆菌在植物根际定植中的应用。本发明的褐藻寡糖能够为芽孢杆菌的生长提供碳源，并可以显著提高芽孢杆菌的运动能力，进而显著促进芽孢杆菌在植物根际的有效定植；本发明中的芽孢杆菌为根际促生菌，能够通过营养竞争、促进植物生长、诱导植物抗性、分泌抗菌物质的方式发挥作用，具有解磷、解钾、固氮的生物活性。
25.本发明芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中的一种或几种。芽孢杆菌优选为解淀粉芽孢杆菌，进一步优选为解淀粉芽孢杆菌cas02，该菌株为
中国专利cn108624543a中公开的菌株，并已于2018 年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏编号为cgmccno.15514。本发明中枯草芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌tpb55，该菌株为文献biocontrol potential of antagonist bacillus subtilis tpb55 against tobaccoblack shank(han,t.et.al.biocontrol,2016,61(2),195-205.)中公开的菌株，并于2008年12月29日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏编号为 cgmccno.2853。本发明中的贝莱斯芽孢杆菌优选为贝莱斯芽孢杆菌em-1，该菌株于2020年11月09日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏编号为cgmcc no.21131。本发明中添加的芽孢杆菌抗逆性强，且能够促进植物生长，抑制病原菌对植物的侵害。
26.本发明中褐藻寡糖，能够有效促进芽孢杆菌的运动能力，并且在褐藻寡糖添加范围内，对芽孢杆菌运动能力的促进作用与褐藻寡糖的浓度成正相关；并且褐藻寡糖能够显著促进芽孢杆菌菌株在作物根际的有效定殖。
27.作为一种可实施的方式，本发明褐藻寡糖的制备方法包括：取褐藻酸钠溶于水，加入酶裂解，离心，上清液真空冷冻干燥，即得褐藻寡糖。
28.本发明将褐藻酸钠按料液比2-6:100g/ml加入水，优选为料液比为 4-5.5:100g/ml；其中，本发明对所加入的水没有特殊限定，采用本领域中常规的试验用水即可，作为一种可实施的方式，本发明添加的为蒸馏水。
29.本发明加入的所述酶为褐藻酸裂解酶，褐藻酸裂解酶的添加浓度为 0.1-2.5g/l，优选为0.5-1.5g/l；酶解温度为25-32℃，优选为28-30℃；酶解时间为12-18h，优选为15-16h；酶解液离心除去未降解多糖，离心参数为： 5000-10000rpm，3-10min，优选为6000-8000rpm，5-8min。
30.本发明将离心获得的褐藻寡糖溶液进行干燥，本发明对褐藻寡糖的干燥方式没有特殊限定，采用本领域常规的干燥方式即可，作为一种可实施的方式，本发明采取真空冷冻干燥方式，干燥时间为24-72h，优选为36-48h；
31.本发明中添加的褐藻寡糖的分子量优选为1000-4000d，有研究发现，褐藻寡糖分子量大小不同时在促进植物生长方面具有不同的效果，而本发明研究发现，分子量为1000-4000d的褐藻寡糖能够有效地提高褐藻寡糖的生物活性，有利于生物体的吸收利用，并提高芽孢杆菌的运动能力。
32.本发明还提供了一种芽孢杆菌菌剂，所述菌剂中包括褐藻寡糖和芽孢杆菌。
33.本发明对芽孢杆菌培养方法没有特殊限定，作为一种可实施的方式，本发明芽孢杆菌的培养包括：将菌株置于lb液体培养基中培养，培养条件为 28℃下有氧培养12h。
34.其中，所述lb培养基为本领域常规培养基，其组分(g/l)为：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，氯化钠10.0，ph7.0
±
0.2；同时，作为一种可实施的方式，本发明将接种菌株后的液体培养基置于摇床，120-160rpm振荡培养，优选为130-150rpm振荡培养。
35.在本发明中，将培养获得的菌液离心获得菌体，所述离心参数为6000 rpm，5min，将菌体使用无菌水重悬至od
600
为0.1-1.0，优选为调节od
600
为0.2-0.5；将褐藻寡糖添加入芽孢杆菌菌液中，优选菌液中的褐藻寡糖使用浓度为1.0-7.0g/l，进一步优选为1.5-5.0g/
l。
36.本发明芽孢杆菌菌剂的剂型可为水剂、可湿性粉剂、水分散颗粒或水悬浮剂。
37.本发明芽孢杆菌菌剂中还包括添加剂，所述添加剂包括分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。
38.其中，所述分散剂为阴离子性分散剂和/或非离子性分散剂，可选择木质素磺酸钠、萘磺酸钠甲醛缩合物、亚甲基双萘磺酸钠、甲醛缩合物硫酸盐、聚羧酸盐、烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯和脂肪酸聚氧乙烯酯中的一种或多种；
39.所述湿润剂可选自十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、皂角粉、无患子粉、茶枯粉和拉开粉bx中一种或多种；
40.所述崩解剂可选自膨润土、硫酸铵、氯化铝、尿素、氯化镁和葡萄糖中的一种或多种；
41.所述粘结剂可选自，淀粉、硅藻土、环糊精、松香、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素和羧甲基纤维素盐中的一种或多种；
42.所述消泡剂可选自c8-c20脂肪醇类化合物、c10-c20饱和脂肪酸类化合物、环氧大豆油、乙醇、硅酮类化合物和有机硅油中的一种或多种；
43.所述抗冻剂可选自山梨醇、乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、丙三醇、尿素和氯化钠中的一种或多种；
44.所述增稠剂可选自明胶、黄原胶、聚乙二醇和聚乙烯醇中的一种或多种；
45.所述填料可选自轻质碳酸钙、硅藻土、膨润土、凹凸棒土和白炭黑中的一种或多种；
46.所述溶剂可选自去离子水或油酸甲酯。
47.如无特殊说明，本发明根据所需制备的芽孢杆菌菌剂的剂型，可常规选择上述添加剂，制成所需剂型。
48.如无特殊说明，本发明涉及的试剂、耗材等均可从商业途径获得，如未注明实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件进行。
49.本发明还提供了芽孢杆菌菌剂在促进植物生长中的应用。本发明提供的芽孢杆菌菌剂中褐藻寡糖和芽孢杆菌联合施用，褐藻寡糖能够为芽孢杆菌提供营养，使得菌剂施用后芽孢杆菌在营养充分的情况下保持生物活性，存活能力高，并且褐藻寡糖能够显著促进芽孢杆菌的运动能力，使其在土壤或植物表面的运动能力显著提高，进而能够在植物根际快速有效定植，发挥功效，实现显著促进植物生长的效果。
50.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
51.实施例1
52.褐藻寡糖促进芽孢杆菌的运动能力
53.1、制备褐藻寡糖：
54.(1)取5g褐藻酸钠，加入100ml蒸馏水；
55.(1)添加褐藻酸裂解酶，使其在溶液中浓度为0.5g/l，酶解温度为30℃，酶解时间为16h；
56.(3)将酶解液进行离心(6000rpm，5min)去除未降解的多糖，上清液即为褐藻寡糖
溶液；
57.(4)对褐藻寡糖溶液进行真空冷冻干燥48h，研磨获得分子量1000-4000d 的褐藻寡糖。
58.2、制备含有不同种类糖的半固体培养基，半固体培养基组分为：10g/l 蛋白胨，5g/lnacl，0.7％琼脂，ph7.0
±
0.2，添加糖种类及浓度见表1，其中添加的褐藻寡糖为步骤1中的褐藻寡糖。将制备的半固体培养基25ml倒入培养皿，在超净台中吹干，室温放置12h备用。
59.表1半固体培养基中添加的不同来源糖及其添加浓度
[0060][0061]
3、将解淀粉芽孢杆菌cas02置于lb液体培养基中培养，培养条件为 28℃，150rpm振荡培养12h，将培养的新鲜菌悬液使用无菌水调至od
600
＝0.3，吸取上述菌液1.0μl接种至步骤2中的半固体培养基。在静置状态下，37℃孵育12h，培养期间拍照并观察菌株是否有游动现象。
[0062]
由图1结果可知，当半固体培养基中未接种菌株，及在半固体培养基中分别添加5g/l的壳寡糖、浒苔多糖、卡拉胶寡糖、卡拉胶、褐藻酸钠、岩藻多糖，培养菌株12小时后，半固体培养基表面均没有明显的菌株游动现象；由图2结果可知，当半固体培养基中分别添加浓度为1.0g/l、2.5g/l和 5.0g/l的褐藻寡糖时，培养菌株的培养基表面出现明显的菌株游动现象。当褐藻寡糖添加浓度为10.0g/l时，接种菌株后经12小时培养后并无菌株生长，即高浓的褐藻寡糖抑制了菌株的正常生长。说明在一定添加量范围内，褐藻寡糖可以显著促进菌株的运动能力，且与褐藻寡糖的浓度成正相关。
[0063]
实施例2
[0064]
本实施例提供了一种芽孢杆菌水剂，其组分为解淀粉芽孢杆菌和褐藻寡糖。
[0065]
所述芽孢杆菌水剂的制备方法为：
[0066]
1、将解淀粉芽孢杆菌置于lb液体培养基中培养，培养条件为28℃， 150rpm振荡培养12h，将菌液离心(6000rpm，5min)，获得菌体，将菌体重悬于无菌水并调节od
600
＝0.3，备用；
[0067]
2、向步骤1获得的菌液中添加实施例1获得的褐藻寡糖，并调节其在菌液中浓度为5g/l，即获得芽孢杆菌水剂。
[0068]
实施例3
[0069]
与实施例2的区别仅在于菌液中褐藻寡糖浓度为2.5g/l。
[0070]
实施例4
[0071]
与实施例2的区别仅在于所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌。
[0072]
实施例5
[0073]
与实施例2的区别仅在于所述芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌。
[0074]
实施例6
[0075]
褐藻寡糖促进芽孢杆菌在植物根际的有效定植
[0076]
1、将解淀粉芽孢杆菌cas02置于lb液体培养基中培养，培养条件为 28℃，150rpm振荡培养12h，将菌液离心(6000rpm，5min)，获得菌体，将菌体重悬于无菌水并调节od
600
＝0.3，备用；
[0077]
2、将烟草种子消毒后置于灭菌的营养基质中育苗，待烟苗长到4-5片叶时，将其移入含ms的营养液中；
[0078]
3、将移栽有烟苗的营养液分为三组：
[0079]
对照组ck：向营养液中加入2ml无菌水；
[0080]
实验组cas02：向营养液中施加2ml解淀粉芽孢杆菌(od
600
＝0.3)；
[0081]
实验组hsg+cas02：向营养液中施加2ml实施例2中的芽孢杆菌水剂。
[0082]
4、烟苗在温室培养(光照条件：16h，28℃；黑暗条件：8h，20℃；相对湿度60％)，4天后将烟苗取出，用灭菌水冲洗根部，取1cm成熟区的根置于消毒的ep管中用于激光共聚焦观察菌株在根际的定殖情况。其中，激光共聚焦显微镜型号leica tcs sp8(mannheim,germany)，激发光波长 488，接受光波长505-550。
[0083]
结果如图3所示，可知，实验组hsg+cas02在烟草根际定植的芽孢杆菌数量最多，说明本发明提供的芽孢杆菌菌剂中的褐藻寡糖可以显著促进芽孢杆菌在植物根际的定植。
[0084]
实施例7
[0085]
褐藻寡糖与解淀粉芽孢杆菌联合施用对植物生长的促进作用
[0086]
1、将烟草种子消毒后置于灭菌的营养基质中育苗，待烟苗长到4-5片叶时，将其移入含有约180g自然土的花盆中(直径约10cm)，烟苗在温室培养(光照条件：16h，28℃；黑暗条件：8h，20℃；相对湿度60％)，每周浇灌灭菌水60ml/株；
[0087]
2、待烟苗长到6-7片叶时，对栽种烟苗的盆栽进行不同处理，每种处理5个重复：分别在植株周围均匀浇灌20ml无菌水(h2o)、20ml褐藻寡糖(hsg)、20ml解淀粉芽孢杆菌菌液(c)、20ml实施例2中的芽孢杆菌水剂(hsg+c)；其中，褐藻寡糖为实施例1制备获得，浓度为5g/l；解淀粉芽孢杆菌菌液为使用lb培养基培养的新鲜菌液，将菌液离心(6000 rpm，5min)，获得菌体，将菌体重悬于无菌水并调节od
600
＝0.3，培养方法同实施例2；
[0088]
每7天浇灌一次，连续两次；第二次浇灌结束7天后检测芽孢杆菌对烟苗的促生效果。实验结果见图4及表2。
[0089]
表2不同试验处理农艺性状
[0090][0091]
注：数据为5次重复的平均值，不同字母代表同一性状不同处理在p﹤0.05水平下差异显著。
[0092]
由表2可知，本发明提供的芽孢杆菌菌剂中褐藻寡糖与芽孢杆菌联合施用，与仅施用褐藻寡糖、仅施用解淀粉芽孢杆菌相比，烟草株高、最大叶长、最大叶宽、有效叶数、最大
叶面积都显著增加，促进了烟草苗的生长；与浇灌无菌水的对照组相比，褐藻寡糖与芽孢杆菌联合施用使得烟草株高增加 44.44％，最大叶长增加66.23％，最大叶宽增加56.22％，有效叶数增加14.42％，最大叶面积增加47.12％。可见，褐藻寡糖与芽孢杆菌联合施用能够显著促进植物的生长。
[0093]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
技术特征：1.褐藻寡糖在促进芽孢杆菌运动中的应用。2.褐藻寡糖在促进芽孢杆菌在植物根际定植中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中的一种或几种。4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述褐藻寡糖的制备方法包括以下步骤：取褐藻酸钠溶于水，加入酶裂解，离心，取上清液冷冻干燥，即得褐藻寡糖。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述酶为褐藻酸裂解酶，酶解温度为25-32℃，酶解时间为12-18h。6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述褐藻寡糖的分子量为1000-4000d。7.一种芽孢杆菌菌剂，其特征在于，所述菌剂中包括褐藻寡糖和芽孢杆菌。8.根据权利要求7所述的芽孢杆菌菌剂，其特征在于，所述褐藻寡糖的使用浓度为1.0-7.0g/l。9.根据权利要求7-8任意一项所述的芽孢杆菌菌剂，其特征在于，所述菌剂的剂型为水剂、可湿性粉剂、水分散颗粒或水悬浮剂。10.权利要求6-9任意一项所述的芽孢杆菌菌剂在促进植物生长中的应用。
技术总结本发明提供了一种褐藻寡糖在促进芽孢杆菌运动，以及促进芽孢杆菌在植物根际定植中的应用，属于微生物技术领域。所述芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中的一种或几种，所述褐藻寡糖显著促进了芽孢杆菌的运动能力。本发明还提供了一种芽孢杆菌菌剂，所述芽孢杆菌菌剂中包括芽孢杆菌和褐藻寡糖，褐藻寡糖能够显著促进芽孢杆菌的运动能力，使其在作物根际快速有效定植，从而使得褐藻寡糖与芽孢杆菌联合制备的菌剂能够显著促进植物生长，进而为化学农药肥料减施、促进农业可持续发展提供了有效途径。农业可持续发展提供了有效途径。农业可持续发展提供了有效途径。
技术研发人员：袁源 张涵 褚德朋 张成省 王晓强
受保护的技术使用者：中国农业科学院烟草研究所（中国烟草总公司青州烟草研究所）
技术研发日：2022.07.18
技术公布日：2022/11/1
