基于稳定基质微环境策略的新型纳米靶向配聚物的合成方法与应用

1.本发明涉及抗肿瘤转移治疗的技术领域，具体涉及基于稳定基质微环境策略的新型纳米靶向配聚物的合成方法与应用。


背景技术：

2.肿瘤转移是导致癌症患者最终死亡的主要原因。肿瘤发生转移的首要条件是降解细胞外基质和破坏基底膜，而基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，mmp)和乙酰肝素酶作为降解细胞外基质(extracellular matrix，ecm)、重塑基质微环境的关键水解酶，对肿瘤的侵袭转移具有重要的促进作用。到目前为止，已发现的mmp酶有近20种，并且每种mmp酶都可以降解ecm中几乎所有的结构蛋白成分。因此，由于其他mmp酶的补偿作用，抑制一种或几种类型的mmp酶无法有效阻止ecm的降解，研究也表明大多数mmp酶抑制剂的抗转移能力较弱。幸运的是，与mmp酶相比，目前仅发现一种乙酰肝素酶，并且ecm及基底膜破坏均需该酶的参与，其与肿瘤血管生成及肿瘤转移关系十分密切，已成为评价肿瘤患者临床预后的重要指标。研究表明，肿瘤治疗后残存的肿瘤细胞中乙酰肝素酶的合成和分泌被显著提升，诱使肿瘤部位乙酰肝素酶表达的明显上调，加速肿瘤转移的进程。因此，迫切需要开发以乙酰肝素酶为靶点的新制剂和新疗法以求高效杀灭原发肿瘤的同时，对抗治疗刺激后诱发的转移。
3.近年来，化学动力学疗法(chemodynamic therapy，cdt)作为一种新兴的肿瘤治疗手段，可通过亚铁离子的芬顿(fenton)反应将内源性过氧化氢(hydrogen peroxide，h2o2)转化为强氧化性的羟基自由基(hydroxyl radical，
·
oh)，诱导肿瘤细胞凋亡。相比于光动力疗法(photodynamic therapy，pdt)，cdt不需要额外的能量输入，因此避免了组织中光穿透深度不足的限制。然而，cdt的催化活性在很大程度上取决于肿瘤区域自由的fe
2+
离子含量。在fe
2+
离子介导fenton反应体系中，fe
3+
离子转化为fe
2+
离子的反应速率(0.002－0.01m－1s－1)非常慢，这严重限制了fenton反应的效率。目前已经提出了许多策略来加速fe
3+
/fe
2+
转化以增强fenton反应效率。例如，引入光激发的半导体材料传输电子以加快fe
3+
的还原，但该策略严重受到了紫外光穿透力差的限制。
4.因此，合理地设计无需外场激发即可高效产生
·
oh的抗转移纳米制剂，在最大程度杀伤肿瘤的基础上抑制肿瘤的转移，将具有重要科研意义和临床价值。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明旨在提供基于稳定基质微环境策略的新型纳米靶向配聚物的合成方法与应用，通过本发明的新型纳米靶向配聚物honps，一方面，在血液循环中通过表面不饱和fe
3+
离子吸附的转铁蛋白，纳米配聚物可主动靶向到肿瘤部位，显著提高肿瘤富集度；另一方面，在肿瘤细胞酸性环境内，释放出有机配体ho－nbc和金属离子fe
3+
，通过释放具有良好的电子传递性能的ho－nbc，可加速fe
3+
－fe
2+
电子传递循环，显著提高
铁基芬顿反应效率，进而极大地提升了cdt效率。再一方面，ho－nbc可显著抑制乙酰肝素酶的活性，阻止ecm崩塌降解、限制促转移细胞因子vegf等的释放，稳定肿瘤基质微环境，从而有效地抑制肿瘤血管增生和肿瘤转移。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.基于稳定基质微环境策略的新型纳米靶向配聚物的合成方法，所述合成方法包括将2，5－二羟基对苯甲酸溶解在100ml的无水乙醇与超纯水的混合溶液中，持续搅拌10min；然后，将六水三氯化铁溶解在5ml的超纯水中，使用超声分散5min；在持续搅拌的情况下，将六水三氯化铁溶液逐滴地加到2，5－二羟基对苯甲酸溶液中，并在80℃下反应4h；反应结束后，离心收集产物，使用无水乙醇洗涤三次获得所述肿瘤靶向的纳米配聚物honps。
8.需要说明的是，所述无水乙醇与超纯水的比例为2：3。
9.需要说明的是，所述离心条件为12000rpm/min，10min。
10.作为本发明的应用，一种基于稳定基质微环境策略的新型纳米靶向配聚物的合成方法的应用，可用于增强的cdt肿瘤杀伤及有效的抗肿瘤转移的治疗中。
11.需要说明的是，在血液循环中，所述honps纳米配聚物表面配位不饱和的fe
3+
离子能够吸附血清中不饱和的转铁蛋白，使其特异性地靶向到肿瘤细胞表面过表达的转铁蛋白上，进而提高纳米配聚物在肿瘤部位的富集度。
12.需要说明的是，在肿瘤细胞酸性环境内，所述honps纳米配聚物释放出有机配体2，5－二羟基对苯二甲酸(ho－nbc)和金属离子fe
3+
；其中，释放出来的ho－nbc具有良好的电子传递性能，可加速fe
3+
－fe
2+
循环，显著提升cdt疗效。
13.需要说明的是，释放的ho－nbc能够抑制乙酰肝素酶的活性，进而阻止ecm崩塌降解及限制促转移细胞因子vegf的释放，稳定肿瘤基质微环境，有效抑制肿瘤血管增生和肿瘤转移。
14.本发明的有益效果在于：
15.本发明计合成了一种具有主动靶向功能的honps纳米配聚物，提出了稳定基质微环境的调控策略，并将其用于增强的cdt抗转移治疗中。在血液循环中，honps表面不饱和的fe
3+
离子能够吸附血清中不饱和的转铁蛋白，使其能够特异性地靶向到肿瘤细胞表面过表达的转铁蛋白受体上，显著提高其肿瘤富集效率；进入肿瘤细胞后，酸降解释放出有机配体ho－nbc和金属离子fe
3+
。其中，释放出来的ho－nbc具有良好的电子传递性能，可加速fe
3+
－fe
2+
之间的电子传递，极大地提升了化学动力学疗效。更重要的是，游离的ho－nbc可显著抑制乙酰肝素酶的活性，阻止细胞外基质崩塌降解、稳定肿瘤基质微环境，从而显著抑制肿瘤血管生成和肿瘤转移。体外溶液和细胞、动物实验结果表明，制备得到的纳米配聚物具有良好的生物相容性，初步实现了乳腺癌细胞的高效cdt杀伤，同时显著限制其转移行为。本发明突破cdt催化效率低的瓶颈问题，提出稳定肿瘤基质微环境的治疗策略，为高效的cdt抗转移治疗提供了借鉴性的方法和研究思路。
附图说明
16.图1为本发明实施例中honps的透射电镜图像；
17.图2为本发明实施例中nh2nps的透射电镜图像；
18.图3为本发明实施例中honps的扫描电镜图像；
19.图4为本发明实施例中honps的粒度分布图；
20.图5为本发明实施例中honps的电位图；
21.图6为本发明实施例中honps的元素分布图；
22.图7为本发明实施例中honps的能谱图和相应的元素比；
23.图8为本发明实施例中ho－nbc和honps的傅里叶变换红外光谱图；
24.图9为本发明实施例中ho－nbc的xps全谱示意图；
25.图10为本发明实施例中honps的xps全谱示意图；
26.图11为本发明实施例中ho－nbc的o 1s xps谱示意图；
27.图12为本发明实施例中honps的o 1s xps谱示意图；
28.图13为本发明实施例中honps的fe 2p xps谱示意图；
29.图14为本发明实施例中honps和nh2nps的xrd图谱；
30.图15为本发明实施例中honps的氮气吸附脱附图；
31.图16为本发明实施例中honps的孔径分布图示意图；
32.图17为本发明实施例中不同处理后，亚甲基蓝溶液的紫外－可见吸收光谱图；
33.图18为本发明实施例中不同ph条件下honps处理后的mb紫外－可见吸收光谱图；
34.图19为本发明实施例中不同浓度的honps处理后的mb紫外－可见吸收光谱图；
35.图20、图21分别为本发明实施例中h2o2浓度依赖的和时间依赖的honps处理mb紫外－可见吸收光谱图；
36.图22为本发明实施例中honps和nh2nps的循环伏安图；
37.图23为本发明实施例中共聚焦激光扫描显微镜观察4t1细胞内吞游离fitc或honps纳米配聚物的情况；
38.图24为本发明实施例中4t1细胞经不同处理后的活死细胞染色分析，活细胞和死细胞分别被calcein－am(绿色)和pi(红色)染色；
39.图25为本发明实施例中不同处理后，hpf染色的4t1细胞在ph7.4或ph 6.5条件下的荧光成像；
40.图26为本发明实施例中流式细胞术检测pbs、nh2nps和honps处理的4t1细胞的凋亡情况。
具体实施方式
41.以下将对本发明作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
42.本发明为基于稳定基质微环境策略的新型纳米靶向配聚物的合成方法，所述合成方法包括将2，5－二羟基对苯甲酸溶解在100ml的无水乙醇与超纯水的混合溶液中，持续搅拌10min；然后，将六水三氯化铁溶解在5ml的超纯水中，使用超声分散5min；在持续搅拌的情况下，将六水三氯化铁溶液逐滴地加到2，5－二羟基对苯甲酸溶液中，并在80℃下反应4h；反应结束后，离心收集产物，使用无水乙醇洗涤三次获得所述肿瘤靶向的纳米配聚物honps。
43.进一步的，本发明的所述无水乙醇与超纯水的比例为2：3。
44.进一步的，本发明的所述离心条件为12000rpm/min，10min。
45.作为本发明的应用，一种基于稳定基质微环境策略的新型纳米靶向配聚物的合成方法的应用，可用于增强的cdt肿瘤杀伤及有效的抗肿瘤转移的治疗中。
46.进一步的，在血液循环中，所述honps纳米配聚物表面配位不饱和的fe
3+
离子能够吸附血清中不饱和的转铁蛋白，使其特异性地靶向到肿瘤细胞表面过表达的转铁蛋白上，进而提高纳米配聚物在肿瘤部位的富集度。
47.进一步的，在肿瘤细胞酸性环境内，所述honps纳米配聚物释放出有机配体2，5－二羟基对苯二甲酸(ho－nbc)和金属离子fe
3+
；其中，释放出来的ho－nbc具有良好的电子传递性能，可加速fe
3+
－fe
2+
循环，显著提升cdt疗效。
48.进一步的，释放的ho－nbc能够抑制乙酰肝素酶的活性，进而阻止ecm崩塌降解及限制促转移细胞因子vegf的释放，稳定肿瘤。
49.实施例1
50.1、honps纳米配聚物的制备及表征
51.honps和nh2nps(对照材料)均由简单的一锅法制备得到。透射电子显微镜(transmission electron microscope，tem)(图1)和扫描电子显微镜(scanning electron microscope，sem)(图2)图像均显示合成的honps纳米配聚物为球形结构，粒径均一且具有良好的分散性，平均粒径约为120nm。同时，tem图像(图3)显示合成的对照材料nh2nps纳米颗粒为长椭圆形结构，平均粒径约为124nm。此外，dls测试(图4)表明，honps和nh2nps的水合动力学直径分别为135.0
±
3.7nm和142.7
±
1.1nm，这是与tem图像的结果一致的。而zeta电位测试(图5)表明，nh2nps显正电，电位为9.15
±
0.46mv；honps带负电，电位为－12.30
±
0.59mv，其负电荷的粒子表面有助于其逃避网状内皮系统的非特异性清除，延长体内循环时间。
52.随后，采用元素映射测试和x射线能谱(energy dispersivespectrum，eds)分析honps的元素组成及比例。正如预期的那样，honps材料中含有c、o、fe元素(图6)，各元素比例为46.84：29.90：23.26(图7)，证实制备的配合物纳米颗粒中含有各投料组分，且元素摩尔比基本符合投料摩尔比。此外，采用傅里叶变换红外光谱(fourier transform－infrared spectrum，ft－ir)、x射线光电子能谱(x－ray photoelectron spectrum，xps)和x射线衍射(x－raydiffraction，xrd)图谱，进一步确认honps的组分状态。ft－ir谱显示(图8)，与游离ho－nbc的－oh伸缩振动峰(3080cm
－1
)和c＝o伸缩振动峰(1650cm
－1
)相比，honps的－oh伸缩振动峰(3420cm
－1
)和c＝o伸缩振动峰(1520cm
－1
)发生了明显的偏移，这表明fe
3+
可能和游离羟基及羧酸基团上的羟基发生了配位。接着，xps全谱(图9、图10)进一步证实了合成的材料中含有c、o和fe元素，这是与电镜能谱结果一致的。o 1s高分辨xps谱(图11、图12)显示，honps纳米配聚物中的o元素结合能峰位于531.88ev和533.58ev，相比于游离ho－nbc的o 1s xps谱，该数值向低结合能方向分别移动了0.9ev和0.2ev，这表明ho－nbc在honps纳米材料中并非以自由形式存在，而是发生了电子相互作用，即ho－nbc在纳米颗粒形成过程中参与了配位。fe 2p高分辨xps谱(图13)显示，honps中所有铁原子均处于三价态，这为honps吸附血清中不饱和的转铁蛋白提供了很好的前提基础。另外，在xrd图谱(图14)中，honps纳米配聚物的鼓包峰表明，honps是一类典型的非晶材料，即在honps中各组分的排列、结合方式无规律；而合成的对照材料nh2nps的晶体结构与模拟数据完美匹配，证实对照材料nh2nps已被成功制备。接下来，采用brunner-emmet-teller(bet)比表面积测
试进一步评估honps的比表面积和孔径分布。相关结果表明，honps的bet表面积156.4323m2/g(图15)；其孔径多以介孔为主，平均孔径为13.2365nm(图16)。综上所述，这些结果均表明honps纳米配聚物已被成功制备。
53.2、纳米配聚物水溶液cdt效果评估
54.研究表明，多酚类或多羟基类药物可作为电子穿梭体，具有良好的电子传递性能，可加速fe
3+
－fe
2+
的转化效率，这有助于提高芬顿反应的效率、增大强氧化性
·
oh的产量。因此，我们采用经典的亚甲基蓝(methylene blue，mb)降解实验来评估honps在体外溶液中的
·
oh产量，其中mb可特异性地捕获
·
oh，并且其在664nm处的吸光度与
·
oh的产量呈负相关。正如图17所示，单独h2o2存在的情况下，几乎观察不到
·
oh的产生，而一旦h2o2与fe基纳米材料混合后，就显示出稳定的
·
oh产生；并且与对照材料nh2nps相比，honps显示出更高的
·
oh生成量，表明honps具有更高的催化效率。这也从侧面证明了honps纳米配聚物中ho－nbc介导的fe
3+
向fe
2+
转化可显著增强fenton反应中的
·
oh产生、提高fenton反应效率。此外，我们利用mb降解实验进一步地探讨了honps催化产生
·
oh的ph依赖性、自身浓度依赖性、h2o2浓度依赖性及时间依赖性。正如所期待的那样，honps催化的
·
oh量随溶液体系的ph值下降(图18)、自身浓度的升高(图19)、h2o2浓度的提高(图20)及时间的推移(图21)而增大，这与传统芬顿反应机制相符。为了理解honps显著提高芬顿效率的背后机制，我们采用循环伏安实验探讨了honps潜在的氧化还原活性。如图22所示，与nh2nps相比，honps具有更高的氧化还原电势，这表明honps具有更优秀的电子传递性能，有利于加速fe
3+
－fe
2+
循环。综上所述，honps可高效地催化h2o2生成强氧化性的
·
oh，并且具有自增强的特性。
55.3、细胞水平上的cdt效果评估
56.研究表明，fe基纳米材料表面不饱和的fe
3+
离子能够吸附血清中不饱和的转铁蛋白，从而使其特异性地靶向到肿瘤细胞表面过表达的转铁蛋白受体上，显著提高材料的细胞内化效率。因此，采用clsm观察honps纳米配聚物的细胞摄取情况，来间接地探究honps纳米配聚物的主动靶向行为。如图23所示，4t1肿瘤细胞可以成功吞噬fitc标记的honps(fitc－honps)纳米配聚物；并且与fitc处理组相比，fitc－honps处理组的细胞内绿色荧光明显增强，这意味着fitc－honps的内吞量要远远高于游离fitc的内吞量，从侧面证实了honps纳米配聚物的主动靶向能力。
57.在系统性评估honps介导的化学动力疗效前，首先进行了h2o2配体ho－nbc、nh2nps和honps的细胞相容性评估。4t1细胞对≤200μm的h2o2相容性良好，甚至在低浓度时呈现出增殖相容性良好。另外，在0－200μg/ml浓度范围内，ho－nbc、nh2nps及honps处理后的细胞存活率均在90％以上，这表明ho－nbc、nh2nps及honps对4t1细胞具有良好的生物相容性。随后，通过外加一定量的h2o2及调节ph来模拟肿瘤细胞内的环境，以评估honps纳米配聚物的cdt杀伤效果。在ph7.4条件下，nh2nps纳米颗粒对4t1细胞的抑制作用并不明显；honps纳米颗粒在200μm h2o2浓度下表现出较适中的细胞杀伤能力，但与对照材料nh2nps处理组相比，已具有一定的差异性。值得注意是，这种差异性在ph 6.5下被显著放大，这表明honps具有更优秀的cdt杀伤能力。同时，我们利用calcein－am和pi对各处理组中的4t1细胞进行活/死细胞染色分析后，也得到了类似的结果。calcein－am的绿色荧光代表活细胞，而pi的红色荧光代表死细胞。如图24所示，经honps+ph 6.5处理的4t1细胞中发现最弱的绿色荧光及最强红。综上所述，这些结果表明honps纳米配聚物具有高效的肿瘤抑制能力。
58.鉴于前述honps在体外溶液中优秀的
·
oh生成能力，我们进一步地使用hpf染料作为特异性
·
oh荧光探针，来对不同处理后4t1细胞内的
·
oh产生情况进行评估。如图25所示，与其他组相比，经honps和ph 6.5微酸性处理的细胞显示出最强的绿色荧光，说明其具备最高的
·
oh生成量，这也进一步地在细胞水平上证明了honps增强的cdt疗效。考虑到cdt产生的
·
oh可能会诱导细胞凋亡，因此我们采用流式细胞仪对不同处理后细胞的凋亡水平进行了检测。annexin v－fitc/pi染色结果(图26)显示，honps纳米颗粒在ph 6.5微酸性条件下诱导的细胞凋亡率可达53.85％，远高于其他各处理组，这表明honps可显著地诱导肿瘤细胞凋亡。根据以上的实验结果可以得出，honps可在肿瘤细胞内产生高水平的
·
oh，并进一步地引起肿瘤细胞凋亡。
59.对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。

技术特征：
1.基于稳定基质微环境策略的新型纳米靶向配聚物的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括将2，5－二羟基对苯二甲酸溶解在100ml的无水乙醇与超纯水的混合溶液中，持续搅拌10min；然后，将六水三氯化铁溶解在5ml的超纯水中，使用超声分散5min；在持续搅拌的情况下，将六水三氯化铁溶液逐滴地加到2，5－二羟基对苯甲酸溶液中，并在80℃下反应4h；反应结束后，离心收集产物，使用无水乙醇洗涤三次获得所述纳米靶向配聚物honps纳米配聚物。2.根据权利要求1所述的基于稳定基质微环境策略的新型纳米靶向配聚物的合成方法，其特征在于，所述无水乙醇与超纯水的比例为2：3。3.根据权利要求1所述的基于稳定基质微环境策略的新型纳米靶向配聚物的合成方法，其特征在于，所述离心条件为12000rpm/min，10min。4.一种利用权利要求1所述的基于稳定基质微环境策略的新型纳米靶向配聚物的合成方法的应用，其特征在于，用于增强的cdt肿瘤杀伤及有效的抗肿瘤转移的治疗中的应用。5.根据权利要求4所述的基于稳定基质微环境策略的新型纳米靶向配聚物的合成方法的应用，其特征在于，在血液循环中，所述honps纳米配聚物表面配位不饱和的fe
3+
离子能够吸附血清中不饱和的转铁蛋白，使其特异性地靶向到肿瘤细胞表面过表达的转铁蛋白上，进而提高纳米配聚物在肿瘤部位的富集度。6.根据权利要求4所述的基于稳定基质微环境策略的新型纳米靶向配聚物的合成方法的应用，其特征在于，在肿瘤细胞酸性环境内，所述honps纳米配聚物解离释放出有机配体2，5－二羟基对苯二甲酸(ho－nbc)和金属离子fe
3+
；其中，释放出来的ho－nbc具有良好的电子传递性能，可加速fe
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－fe
2+
循环，显著提升cdt疗效。7.根据权利要求6所述的基于稳定基质微环境策略的新型纳米靶向配聚物的合成方法的应用，其特征在于，释放的ho－nbc能够抑制乙酰肝素酶的活性，进而阻止ecm崩塌降解及限制促转移细胞因子vegf的释放，稳定肿瘤基质微环境，有效抑制肿瘤血管增生和肿瘤转移。

技术总结
本发明公开了基于稳定基质微环境策略的新型纳米靶向配聚物的合成方法与应用，所述合成方法包括将2，5－二羟基对苯二甲酸溶解在100mL的无水乙醇与超纯水的混合溶液中，持续搅拌10min；然后，将六水三氯化铁溶解在5mL的超纯水中，使用超声分散5min；在持续搅拌的情况下，将六水三氯化铁溶液逐滴地加到2，5－二羟基对苯二甲酸溶液中，并在80℃下反应4h；反应结束后，离心收集产物，使用无水乙醇洗涤三次获得所述肿瘤靶向的纳米配聚物HONPs。本发明突破化学动力学疗法(CDT)催化效率低的瓶颈问题，提出稳定肿瘤基质微环境的治疗策略，为高效的CDT抗转移治疗提供了借鉴性的方法和研究思路。究思路。究思路。


技术研发人员：宫腾 李艳丽 许川山 黄剑文 李凤潭
受保护的技术使用者：广州医科大学
技术研发日：2022.07.20
技术公布日：2022/11/1