一种可变形态的喜树碱多肽纳米制剂及其制备方法和应用

1.本发明属于抗肿瘤药物领域，特别涉及一种可变形态的喜树碱多肽纳米制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.癌症是目前全世界范围内主要死亡原因之一，其新发病例和死亡人数逐年上升。化疗一直都是治疗癌症常用手段，其中化疗药物喜树碱是一种细胞毒性喹啉类生物碱，是中药喜树的活性成分之一。研究表明，喜树碱抗肿瘤主要作用机制是在癌细胞dna复制的s期，通过抑制拓扑异构酶i 的活性使其dna合成受阻，从而介导癌细胞凋亡，对抗肿瘤具有良好的效果。然而，由于喜树碱存在溶解性低的缺点，导致在病灶部位的浓度难以达到治疗浓度，而高给药浓度又导致毒副作用大。因此，提高喜树碱在病灶部位的浓度，以减少给药浓度，降低毒副作用具有重要意义。
3.随着纳米技术的发展，传统型喜树碱纳米制剂在提高药物递送效率方面得到了改善。中国发明专利cn109172527a公开了一种基于阳离子氨基酸修饰的喜树碱前药及其制备方法和纳米载药颗粒及其应用，喜树碱前药含有正电荷的氨基酸，能够与带负电的聚合物通过静电相互作用得到尺寸均一且粒径小的纳米载药颗粒，具有较高的载药量和优异的稳定性，对癌细胞具有良好的杀伤效果。另一篇中国发明专利cn107714641a公开了一种用于联合用药的喜树碱前药负载双药物超分子水凝胶的制备方法，喜树碱前药通过疏水聚合和基于α－cd与peg链的主－客体作用自组装交联形成超分子水凝胶，再负载水溶性抗癌药物，可通过注射的方式植入到病灶部位，具有良好的生物相容性。
4.然而，纳米制剂的尺寸大小会影响其物理或化学性质，从而决定其在生物系统中的作用。传统型球形喜树碱纳米制剂在肿瘤部位易于渗透，滞留性却不佳，而纤维状喜树碱纳米制剂具有长滞留效果，但难以渗透到肿瘤内部。由于肿瘤异质性的影响，虽然球形纳米制剂易于穿透肿瘤和快速分布，但在病灶部位滞留性差，而高横纵比的纳米纤维尽管具有良好的肿瘤滞留效果，但往往难以深入靶向到肿瘤内部。这导致传统型喜树碱纳米制剂在临床应用中受到了一定的限制。
5.因此，在本领域中亟需提供一种具有可变形态性质的喜树碱多肽纳米制剂，既能保障纳米制剂的高渗透性，同时又能使喜树碱具有长滞留性，增加其在肿瘤部位的浓度，减少给药浓度，降低毒副作用，通过形态转变策略以达到高效抗肿瘤效果的目的。


技术实现要素：

6.针对上述问题，本发明提出了一种可变形态的喜树碱多肽纳米制剂，所述喜树碱纳米制剂包括两亲性多肽和喜树碱衍生物；
7.所述喜树碱衍生物通过二硫键共价连接到两亲性多肽上。
8.所述两亲性多肽的氨基酸序列中包括交替连接的亲水性氨基酸、疏水性氨基酸和中间的半胱氨酸；
9.其中，亲水性氨基酸和疏水性氨基酸数量相同，均小于等于六个。
10.进一步地，所述亲水性氨基酸包括侧链基团带正电荷和负电荷的氨基酸，且带正电荷的亲水性氨基酸个数和带负电荷的亲水性氨基酸个数相等，均小于等于三个。
11.进一步地，所述侧链基团带正电荷的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸或组氨酸中的任意一种，所述侧链基团带负电荷的氨基酸包括谷氨酸或天冬氨酸中的任意一种；
12.所述疏水性氨基酸包括色氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、脯氨酸或甲硫氨酸中的任意一种。
13.进一步地，所述两亲性多肽的氨基酸序列包括包括如seq id no1～18 任一项所述的氨基酸序列。
14.进一步地，所述两亲性多肽的氨基酸序列如seq id no14所示。
15.进一步地，两亲性多肽序列如seq id no14所示的喜树碱纳米制剂包括如下结构式所示的化合物：
[0016][0017]
进一步地，所述可变形态的喜树碱多肽纳米制剂的形态在肿瘤微环境微酸条件下由纳米颗粒转变为纳米纤维；
[0018]
其中，微酸条件为ph为6.1～6.9的水溶液；
[0019]
所述纳米颗粒的直径为30～100nm；
[0020]
所述纳米纤维的长度大于等于500nm；
[0021]
所述纳米纤维的宽度为10～60nm；
[0022]
所述纳米纤维的构象包括α－螺旋、β－折叠或β－发夹中的任意一种或两种的组合。
[0023]
另一方面本发明还提出了一种可变形态的喜树碱多肽纳米制剂的制备方法，所述制备方法包括：
[0024]
合成喜树碱衍生物和亲疏水交替的两亲性多肽；
[0025]
将喜树碱衍生物与两亲性多肽进行偶联，得到喜树碱多肽；
[0026]
在中性条件下将所述喜树碱多肽进行自组装，得到可变形态的喜树碱多肽纳米制剂。
[0027]
进一步地，两亲性多肽分子采用固相合成技术合成；
[0028]
喜树碱衍生物以喜树碱为基础反应物，在有机碱存在下与三光气反应生成酰氯中间体，酰氯中间体再与2－[2－(吡啶基)连硫基]乙醇反应得到喜树碱衍生物。
[0029]
进一步地，采用巯基－二巯基交换反应技术将喜树碱衍生物与两亲性多肽分子进行偶联，具体包括以下步骤：
[0030]
以无水dmso为溶剂，在氮气氛围下喜树碱衍生物与两亲性多肽混合，室温搅拌反应，反应完全后过滤除去固体杂质，再加入冷乙醚沉析出产物，洗涤并干燥，得到喜树碱多肽。
[0031]
进一步地，喜树碱多肽进行自组装的非共价键相互作用力包括氢键、疏水相互作用、π－π相互作用或范德华力中的任意一种或至少两种的组合，将所述喜树碱多肽进行自组装通过在中性条件下对喜树碱多肽进行退火、自然降温至室温和静置后得到；
[0032]
其中，
[0033]
中性条件的ph为7.3～7.6的水溶液；
[0034]
退火温度为75～85℃，退火时间为25～35min；
[0035]
静置时间为10～15h。
[0036]
另一方面，本发明提出的喜树碱多肽纳米制剂可在制备抗癌细胞药物上的应用；所述喜树碱多肽纳米制剂的给药方式包括尾静脉给药、皮下给药或腹腔给药中的任意一种。
[0037]
本发明的有益效果：
[0038]
(1)本发明提出的可变形态的喜树碱多肽纳米制剂包括亲疏水交替的两亲性多肽和喜树碱，通过二硫键将喜树碱共价连接到两亲性多肽上，制备得到可变形态的喜树碱多肽纳米制剂，该喜树碱多肽纳米制剂具有酸响应性和形态转变性。在正常生理条件下维持纳米颗粒结构，保障其在肿瘤部位的渗透性；在肿瘤微环境微酸条件下，该制剂形态由纳米颗粒转变为长度不小于200nm的纳米纤维，可以提高喜树碱的滞留能力，增加其在肿瘤部位的浓度，以降低给药浓度，实现高效杀伤癌细胞；
[0039]
(2)本发明提出的可变形态的喜树碱多肽纳米制剂具有特异性，癌细胞过表达的gsh还原二硫键释放喜树碱原药，可以降低喜树碱在血液循环中对正常细胞的毒副作用，实现特异性杀伤癌细胞；
[0040]
(3)本发明提出的可变形态的喜树碱多肽纳米制剂的制备方法成熟，可实现批量化生产，促进了产品的推广与使用，具有广阔的应用前景。
[0041]
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。
附图说明
[0042]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0043]
图1为本发明所述可变形态的喜树碱多肽纳米制剂的工作原理图；
[0044]
图2示出了本发明实施例1中制备的如seq id no1所示的两亲性多肽的esi－ms表征图片；
[0045]
图3示出了本发明实施例1中制备的如seq id no6所示的两亲性多肽的esi－ms表征图片；
[0046]
图4示出了本发明实施例1中制备的如seq id no15所示的两亲性多肽的esi－ms表征图片；
[0047]
图5示出了本发明实施例2中制备的喜树碱衍生物的mnr表征图片；
[0048]
图6示出了本发明实施例3中制备的喜树碱多肽的esi－ms表征图片；
[0049]
图7示出了为本发明实施例4中所述可变形态的喜树碱多肽纳米制剂在ph为6.5和7.4条件下的傅里叶变换红外光谱表征图片；
[0050]
图8示出了本发明实施例4中所述可变形态的喜树碱多肽纳米制剂在 ph为6.5和7.4条件下的圆二色光谱表征图片；
[0051]
图9a示出了本发明实施例4中所述可变形态的喜树碱多肽纳米制剂在 ph 7.4条件下的透射电子显微镜图片(比例尺＝200nm)；
[0052]
图9b示出了本发明实施例4中所述可变形态的喜树碱多肽纳米制剂在 ph 6.5条件下的透射电子显微镜图片(比例尺＝200nm)；
[0053]
图10a示出了本发明实施例1中seq id no6序列的两亲性多肽在ph 7.4条件下的透射电子显微镜图片(比例尺＝200nm)；
[0054]
图10b示出了本发明实施例1中seq id no6序列的两亲性多肽在ph 7.4条件下的透射电子显微镜图片(比例尺＝200nm)；
[0055]
图11a示出了本发明实施例1中seq id no15序列的两亲性多肽在ph 7.4条件下的透射电子显微镜图片(比例尺＝200nm)；
[0056]
图11b示出了本发明实施例1中seq id no15序列的两亲性多肽在ph 7.4条件下的透射电子显微镜图片(比例尺＝200nm)；
[0057]
图12示出了本发明实施例5中所述可变形态的喜树碱多肽纳米制剂在不同浓度gsh下药物释放曲线图片；
[0058]
图13示出了本发明实施例6中所述可变形态的喜树碱多肽纳米制剂与 a549细胞共孵育后的细胞活性检测实验的结果图片；
[0059]
图14示出了本发明实施例6中所述可变形态的喜树碱多肽纳米制剂与 a549细胞共孵育后的细胞活死染色实验的结果图片；
[0060]
图15示出了本发明实施例7中所述可变形态的喜树碱多肽纳米制剂在活体内的抑制肿瘤生长的结果图片。
具体实施方式
[0061]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0062]
本发明利用形态转变策略，使喜树碱纳米制剂在未到达肿瘤部位时呈无规则卷曲的纳米颗粒，保障其高渗透性。到达肿瘤部位后，在微酸性环境下喜树碱纳米制剂由纳米颗粒转变至纳米纤维，增强药物在肿瘤部位滞留能力，实现药物递送过程中纳米制剂的形态转变，使喜树碱纳米制剂兼顾高渗透性和长滞留性，以减少给药浓度，降低毒副作用，增强抗肿瘤效果，可应用于肿瘤药物治疗中。
[0063]
可变形态的喜树碱多肽纳米制剂的工作原理如图1所示，在人体正常生理环境下由于亲水性氨基酸侧链基团静电排斥作用，使其构象为无规则卷曲，自组装成纳米颗粒结构，保障可变形态的喜树碱多肽纳米制剂在肿瘤部位高渗透性。当递送到达肿瘤部位后，在肿瘤微环境微酸条件下，亲水性氨基酸侧链基团质子化，使得增强两亲性多肽分子间静电相互作用力，构象由无规则卷曲转变为β－折叠，并进一步由小尺寸的颗粒结构转变为高纵横比的纤维结构，从而可以达到提高药物在肿瘤部位的滞留能力，增加药物在肿瘤部位的浓度，以减少给药浓度，降低毒副作用的目的。
[0064]
以下结合实施例对本发明提出的可变形态的喜树碱多肽纳米制剂进行进一步说明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
[0065]
本发明实施例所用到的材由以下渠道获得但不仅限于以下渠道，正规渠道获得均可：
[0066]
rink酰胺4－甲基苯胺(mbha)树脂、fmoc－val－oh、fmoc－glu(otbu) －oh、fmoc－cys(trt)－oh和fmoc－lys(boc)－oh购自毕得医药科技有限公司；
[0067]
三氟乙酸、2－(7－氧化苯并三氮唑)－n，n，n＇，n＇－四甲基脲六氟磷酸酯、甲基苯基硫醚和喜树碱购自萨恩化学技术有限公司；
[0068]
n，n－二异丙基乙胺、还原性谷胱甘肽(gsh)、2，2＇－二硫二吡啶、2－巯基乙醇、苯甲醚、三光气和4－二甲氨基吡啶购自百灵威科技有限公司；
[0069]
钙黄绿素－am和乙二胺均二聚体－1购自默克公司；
[0070]
a549细胞购自购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
[0071]
实施例1合成两亲性多肽序列
[0072]
本实施例对两亲性多肽序列进行选择。
[0073]
两亲性多肽序列中需要含有亲水性氨基酸、疏水性氨基酸和半胱氨酸，疏水性氨基酸包括色氨酸(w)、苯丙氨酸(f)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、丙氨酸(a)、脯氨酸(p)或甲硫氨酸(m)中的任意一种，而疏水性过强或过弱均不利于多肽自组装的形态调控性质，由于缬氨酸的疏水性较强于色氨酸、丙氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸，但弱于苯丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，故优选缬氨酸；亲水性氨基酸包括侧链基团带正电荷的和负电荷的氨基酸，侧链带正电荷的氨基酸的氨基酸包括精氨酸(r)、赖氨酸(k)或组氨酸(h)中的任意一种，侧链基团带负电荷的氨基酸包括谷氨酸(e)或天冬氨酸(d)中的任意一种；在两亲性多肽序列的选择过程中，选择亲水性氨基酸和疏水性氨基酸数量相同，且各不多于六个；侧链基团带正电荷和负电荷的氨基酸数量相同，且各不多于三个；按照上述要求分别设计seq id no1～18的三组两亲性多肽序列，分别设计了在ph＝7时的净电荷为－1.8、－0.9、0.0以及1.0时的多个序列，具体序列如下表所示：
[0074][0075]
seq id no1～11的两亲性多肽在ph＝7时的净电荷均为1.0，其平均亲水性为0.4－0.6，亲水残基比例在40－46％之间；seq id no12～14两亲性多肽序列在ph＝7时的净电荷均为－1.8，平均亲水性为－0.1，亲水残基比例为23％；seq id no15～16的两亲性多肽序列ph＝7时的净电荷均为－0.9，平均亲水性为－0.2，亲水残基比例为22％；seq id no17～18的两亲性多肽序列ph＝7时的净电荷均为0.0，平均亲水性为－0.2，亲水残基比例为22％。上述组合只是示例性举出，并未穷举出所有符合条件的两亲性多肽序列。
[0076]
采用固相合成技术合成两亲性多肽，本实施例以seq id no14的两亲性多肽序列为例对合成方法进行说明；
[0077]
1.1脱保护基团
[0078]
选用0.436mmol/g修饰密度的mbha树脂，用哌啶和n，n－二甲基甲酰胺体积比为1：
3的混合溶液脱去mbha树脂n端的fmoc保护基团，取少量mbha树脂进行茚三酮显色反应。若溶液为无色，说明没有脱去α－氨基的保护基，需要重复上述脱保护步骤；若溶液显蓝紫色，说明脱去α－氨基的保护基，可以进行氨基酸的缩合反应。
[0079]
1.2缩合反应
[0080]
称取4倍摩尔质量的缬氨酸和2－(7－氧化苯并三氮唑)－n，n，n＇，n＇－四甲基脲六氟磷酸酯，称取4倍摩尔质量的n，n－二异丙基乙胺，加入n，n-二甲基甲酰胺，用搅拌器搅拌使其溶解。将溶液转移至多肽合成管中，反应1h，反应结束后，除去溶剂，分别用n，n－二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤3次，取少量mbha树脂进行茚三酮显色反应，验证酰胺缩合反应是否成功。若成功，则重复每一个氨基酸脱保护和缩合反应，将剩余的所有氨基酸依次通过酰胺缩合反应连接上去；若反应不成功，则重新投入4倍摩尔质量的氨基酸进行反应，直至反应成功后继续下一个氨基酸的缩合，直至将剩余的所有氨基酸依次通过酰胺缩合反应连接上去，得到mbha树脂肽。
[0081]
1.3切割
[0082]
向合成管中加入切割剂，切割剂由体积比为90：5：3：2的三氟乙酸：甲基苯基硫醚：苯甲醚：1，2－乙二硫醇混合而成，从mbha树脂上裂解两亲性多肽，反应2.5h，反应结束后，将裂解液过滤并用旋转蒸发仪浓缩裂解液至粘稠状，然后加入冷乙醚沉析出粗产物，洗涤并干燥，得到seq id no14 所示的两亲性多肽。
[0083]
将得到的seq id no14所示的两亲性多肽进行esi－ms(电喷雾质谱法)表征，得到的质谱图如图2所示，由图2可以看出，所得两亲性多肽的质谱为：
[0084]c45h82n12
o13s[m+h]
+
：1032.34。
[0085]
按照上述方法分别合成seq id no1～16的两亲性多肽序列，并将得到的两亲性多肽进行esi－ms(电喷雾质谱法)表征，例如seq id no6和seq id no15所示的两亲性多肽的质谱结果分别如3和图4所示，质谱结果表明上述序列合成无误。
[0086]
实施例2合成喜树碱衍生物
[0087]
合成喜树碱衍生物的步骤包括：
[0088]
2.1合成中间体
[0089]
在氮气氛围下，用甲醇溶解2，2＇－二硫二吡啶(式a)，再将2－巯基乙醇滴加到溶液中，反应液颜色变为黄色后再在室温下搅拌2h，反应结束后通过柱层析分离，得到纯净的中间体2－[2－(吡啶基)连硫基]乙醇，所述2－[2－(吡啶基)连硫基]乙醇的结构式如式b所示。
[0090]
具体反应式如下：
[0091][0092]
2.2合成喜树碱衍生物
[0093]
喜树碱原药在有机碱(如4－二甲氨基吡啶)存在下，在有机溶剂中与三光气反应15min生成酰氯中间体，酰氯中间体与所述2－[2－(吡啶基)连硫基] 乙醇反应16h，反应结
束后将反应液用nacl饱和溶液洗涤2次，浓缩后用热甲醇溶解，将溶液放在4℃下储存48h，得到灰白色沉淀，过滤收集灰白色固体并用甲醇洗涤3次，制得含有二硫键的喜树碱衍生物，所述喜树碱衍生物的结构式如式c所示。
[0094]
具体反应式如下：
[0095][0096]
对所得的喜树碱衍生物进行mnr(核磁共振波谱法)表征，结果如图5所示，由图5可知，所得喜树碱衍生物的核磁谱为1h nmr(400mhz， dmso)δ8.69(s，1h)，8.39(dd，j＝4.8，0.8hz，1h)，8.14(t，j＝7.8hz，2h)，7.85(dd， j＝11.8，4.7hz，1h)，7.79
–
7.65(m，3h)，7.15(ddd，j＝7.3，4.8，0.9hz，1h)，7.10(s， 1h)，5.52(d，j＝1.2hz，2h)，5.30(s，2h)，4.33(t，j＝6.0hz，2h)，3.15(t，j＝6.1hz， 2h)，2.18(qt，j＝14.5，7.2hz，2h)，0.92(t，j＝7.4hz，3h)。
[0097]
实施例3
[0098]
采用巯基－二巯基交换反应技术将喜树碱衍生物与两亲性多肽合成可变形态的喜树碱多肽纳米制剂。
[0099]
本实施例以实施例1合成的如seq id no14所示的两亲性多肽和实施例2中合成的喜树碱衍生物为例对喜树碱多肽纳米制剂的合成过程进行说明。
[0100]
一种可变形态的喜树碱多肽纳米制剂，所述可变形态的喜树碱多肽纳米制剂包括两亲性多肽和喜树碱；
[0101]
所述两亲性多肽的氨基酸序列如seq id no14所示。
[0102]
seq id no14：vkveckvev－nh2。
[0103]
所述可变形态的喜树碱多肽纳米制剂的分子结构如式i所示：
[0104][0105]
其步骤包括：无水dmso为溶剂，在氮气氛围下喜树碱衍生物与两亲性多肽混合，室温搅拌反应24h，过滤除去固体杂质，然后加入冷乙醚沉析出产物，洗涤并干燥，得到喜树碱多肽。
[0106]
对所得喜树碱多肽进行esi－ms表征，结果如图6所示。
[0107]
由图6可知，所得喜树碱多肽的质谱为：
[0108]c45h82n12o13
s[m+h]
+
：1483.24。
[0109]
将喜树碱多肽进行自组装，自组装的非共价键相互作用力包括氢键、疏水相互作用、π－π相互作用或范德华力中的任意一种或至少两种的组合；
[0110]
将喜树碱多肽溶解在ph为7.3～7.6中性水溶液中；
[0111]
在75～85℃下退火25～35min，再自然降温至室温，并静置10～15h，得到可变形态的喜树碱多肽纳米制剂。
[0112]
本实施例中中性水溶液的ph为7.4，退火温度为80℃，退火时间为 30min，静置时间为12h。
[0113]
实施例4
[0114]
对实施例3中制得的喜树碱多肽纳米制剂在微酸条件下是否发生形态转变进行实验验证。所述喜树碱多肽纳米制剂的构象包括α－螺旋、β－折叠或β－发夹中的任意一种或两种的组合。
[0115]
(1)傅里叶变换红外光谱进表征
[0116]
将相同浓度的喜树碱多肽纳米制剂分别溶解在ph中性条件(ph为 7.3～7.6的水溶液)和微酸条件(ph为6.1～6.9的水溶液)中，本实施例中中性条件选择ph为7.4的水溶液，微酸条件ph为6.5的水溶液，使用傅里叶变换红外光谱进表征，结果如图7所示。
[0117]
由图7可知，在ph为7.4时，喜树碱多肽纳米制剂的傅里叶变换红外光谱显示在1646cm
－1
处有一个与酰胺i键的振动吸收相关的吸收带，表明在该条件下喜树碱多肽纳米制剂是无规则卷曲结构。在ph为6.5时，相同浓度的喜树碱多肽纳米制剂的傅里叶变换红外光谱显示在1624cm
－1
和 1691cm
－1
处有两个与酰胺i键的振动吸收相关的吸收带，表明在该条件下喜树碱多肽纳米制剂形成了反平行的β－折叠结构。
[0118]
(2)圆二色光谱表征
[0119]
进一步利用圆二色光谱对所述喜树碱多肽纳米制剂在ph为7.4和6.5 水溶液中的构象进行表征，结果如图8所示。
[0120]
由图8可知，在ph为7.4时，喜树碱多肽纳米制剂的圆二色光谱在 199nm处显示出负特征峰，验证了在该条件下喜树碱多肽纳米制剂是无规则卷曲的构象。在ph为6.5时，相同浓度的喜树碱多肽纳米制剂圆二色光谱在217nm处显示出负特征峰，验证了在该条件下喜树碱多肽纳米制剂是β－折叠的构象，说明喜树碱多肽纳米制剂在微酸性条件下构象由无规则卷曲转变为β－折叠。
[0121]
(3)电镜表征
[0122]
通过透射电子显微镜观察所述喜树碱多肽纳米制剂在ph为7.4和6.5 水溶液中的纳米结构，纳米颗粒的直径为30～100nm，优选为50～70nm；转变成纳米纤维后纳米纤维的长度大于等于500nm，纳米纤维的宽度为10～ 60nm，优选为20～40nm。
[0123]
本实施例中喜树碱多肽纳米制剂的纳米结构分别如图9a和图9b所示。由图9a可知，在ph为7.4时，喜树碱多肽纳米制剂聚集形成直径为60nm 左右的纳米颗粒，也可以是50～70nm；由图9b可知，在ph为6.5的微酸条件下，喜树碱多肽纳米制剂自组装形成长度不低于500nm，宽度25nm左右的纳米纤维，证明在微酸条件下喜树碱多肽纳米制剂的纳米结构发生了转变。
[0124]
此外本实施例还对seq id no6序列和seq id no15序列的喜树碱多肽纳米制剂在不同ph环境下的纳米结构进行了电镜表征，seq id no6所示的两亲性多肽在ph为7.4的水溶液和微酸条件ph为6.5的水溶液中电镜结果分别如图10a和10b所示；seq id no15所示的两亲性多肽在ph为 7.4的水溶液和微酸条件ph为6.5的水溶液，结果分别如图11a和11b所
示；由图11a和11b可以看出，合成的喜树碱多肽纳米制剂在微酸性条件下构象纳米结构由纳米颗粒转变成了纳米纤维。
[0125]
实施例5
[0126]
本实施例验证实施例3制备的喜树碱多肽纳米制剂在gsh还原二硫键下释放喜树碱原药。
[0127]
将所述喜树碱多肽纳米制剂溶解在pbs缓冲溶液中，分别加入不同浓度的gsh，通过检测喜树碱多肽纳米制剂的剩余含量得到药物释放曲线，结果如图12所示。
[0128]
从图12可以看出，在没有gsh的情况下，经过14h后，喜树碱多肽纳米制剂释放出喜树碱原药低于5％，说明在没有gsh存在下，二硫键比较稳定，不会释放喜树碱原药。向喜树碱多肽纳米制剂中加入gsh导致喜树碱原药逐渐释放，并且随着gsh浓度增加，释放速率逐渐加快。其中，在2mm gsh存在下，最终在14h后喜树碱原药释放约53％；在4mm gsh 存在下，最终在14h后喜树碱原药释放约62％；在6mm gsh存在下，最终在14h后喜树碱原药释放约70％；在8mm gsh存在下，最终在14h后喜树碱原药释放约83％；在10mm gsh存在下，最终在14h后喜树碱原药释放约90％。
[0129]
实施例6
[0130]
本实施例验证实施例3制备的喜树碱多肽纳米制剂对癌细胞的杀伤作用。
[0131]
选用a549细胞考察喜树碱多肽纳米制剂对癌细胞的杀伤作用。将a549 细胞种于96孔培养板上，每个孔1
×
104个细胞，培养24h以使细胞贴壁。每个孔加入不同浓度的喜树碱原药、喜树碱多肽纳米制剂或空白培养液，再孵育48h。移除培养液，更换含有cck－8检测试剂的培养液，孵育2h。最后将96孔板置于酶标仪中检测每个孔在450nm处的吸光度。
[0132]
通过比较喜树碱多肽纳米制剂组细胞和空白细胞的吸光度得到相对细胞活性，结果如图13所示。
[0133]
由图13可知，喜树碱原药对a549细胞ic
50
(半抑制浓度)为2.79μm，而喜树碱多肽纳米制剂对a549细胞ic
50
为3.62μm。该结果显示了喜树碱多肽纳米制剂对a549细胞的杀伤效果与喜树碱原药相当，表明喜树碱多肽纳米制剂对a549细胞具有良好的杀伤作用。
[0134]
为了进一步验证喜树碱多肽纳米制剂对癌细胞的杀伤作用，进行了 a549细胞活死染色实验。
[0135]
将a549细胞种于96孔培养板上，每个孔1
×
104个细胞，每个孔加入浓度为3μm的喜树碱原药和喜树碱多肽纳米制剂，孵育48h，再加入2μm 钙黄绿素－am和4μm乙二胺均二聚体－1的混合物，孵育30min，分别染色活细胞和死细胞集落。
[0136]
利用激光共聚焦显微镜观察活细胞和死细胞。其中，钙黄绿素－am激发波长为450－490nm，乙二胺均二聚体－1激发波长为510－560nm，结果如图 14所示。
[0137]
由图14可知，喜树碱原药和喜树碱多肽纳米制剂处理后a549死细胞的荧光强度相当，充分证明了本发明所设计可变形态的喜树碱多肽纳米制剂对癌细胞具有良好的杀伤效果。
[0138]
实施例7
[0139]
本实施例验证实施例3制备的喜树碱多肽纳米制剂抗肿瘤效果。
[0140]
选用体重为18～20g、6～8周的雌性balb/c裸鼠，将小鼠随机分为三组，每组8只。在小鼠右后侧腹股沟处皮下接种5
×
104个a549细胞，待肿瘤体积约为100mm3时开始实验。
[0141]
以不具备形态转变性质但氨基酸序列相同的喜树碱多肽纳米制剂作为对照样品，将可变形态的喜树碱多肽纳米制剂、对照样品或pbs每隔2天 (第1天、4天、7天、10天、13天)采用尾静脉注射的方式注射到小鼠体内(～9mg/kg样品，给药体积为200μl)。在治疗过程中，每隔2天记录一次各个分组小鼠体重，用游标卡尺测量肿瘤体积，肿瘤体积按以下公式计算：v＝(w2×
l)/2，其中w为肿瘤的宽度，l为肿瘤的长度，连续记录24天。以肿瘤体积作为纵坐标，时间作为横坐标绘制成肿瘤生长曲线，结果如图15所示。
[0142]
由图15可知，可变形态的喜树碱多肽纳米制剂给药的小鼠肿瘤体积最小，表明可变形态的喜树碱多肽纳米制剂在肿瘤微环境微酸条件下形成的纳米纤维提高了喜树碱在癌细胞内的滞留效应，从而增强抗肿瘤效果，以达到减少给药浓度和降低毒副作用的目的，证明了通过形态转变性质可以增强喜树碱多肽纳米制剂抗肿瘤效果。
[0143]
从上述实施例的结果可知，本发明提供的可变形态的喜树碱多肽纳米制剂，具有酸响应性、特异性和形态转变性，在正常生理条件下维持纳米颗粒结构，保障其在肿瘤部位的渗透性，在肿瘤微环境微酸条件下，喜树碱多肽纳米制剂形态由纳米颗粒转变为纳米纤维，可以提高喜树碱的滞留能力，增加其在肿瘤部位的浓度，以降低给药浓度，实现高效杀伤癌细胞；制备方法成熟高效，具有广阔的应用前景。
[0144]
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种可变形态的喜树碱多肽纳米制剂，其特征在于，所述喜树碱纳米制剂包括两亲性多肽和喜树碱衍生物；所述喜树碱衍生物通过二硫键共价连接到两亲性多肽上。2.根据权利要求1所述的喜树碱多肽纳米制剂，其特征在于，所述两亲性多肽的氨基酸序列中包括交替连接的亲水性氨基酸、疏水性氨基酸和中间的半胱氨酸；其中，亲水性氨基酸和疏水性氨基酸数量相同，均小于等于六个。3.根据权利要求2所述的喜树碱多肽纳米制剂，其特征在于，所述亲水性氨基酸包括侧链基团带正电荷和负电荷的氨基酸，且带正电荷的亲水性氨基酸个数和带负电荷的亲水性氨基酸个数相等，均小于等于三个。4.根据权利要求3所述的喜树碱多肽纳米制剂，其特征在于，所述侧链基团带正电荷的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸或组氨酸中的任意一种，所述侧链基团带负电荷的氨基酸包括谷氨酸或天冬氨酸中的任意一种；所述疏水性氨基酸包括色氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、脯氨酸或甲硫氨酸中的任意一种。5.根据权利要求1或2所述的喜树碱多肽纳米制剂，其特征在于，所述两亲性多肽包括如seq id no 1～18任一项所述的氨基酸序列。6.根据权利要求1或2所述的喜树碱多肽纳米制剂，其特征在于，所述两亲性多肽的氨基酸序列如seq id no 14所示。7.根据权利要求6所述的喜树碱多肽纳米制剂，其特征在于，所述喜树碱纳米制剂包括如下结构式所示的化合物：8.根据权利要求6所述的喜树碱多肽纳米制剂，其特征在于，所述可变形态的喜树碱多肽纳米制剂的形态在肿瘤微环境微酸条件下由纳米颗粒转变为纳米纤维；其中，微酸条件为ph为6.1～6.9的水溶液；所述纳米颗粒的直径为30～100nm；所述纳米纤维的长度大于等于500nm；所述纳米纤维的宽度为10～60nm；所述纳米纤维的构象包括α－螺旋、β－折叠或β－发夹中的任意一种或两种的组合。9.一种可变形态的喜树碱多肽纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：合成喜树碱衍生物和亲疏水交替的两亲性多肽；将喜树碱衍生物与两亲性多肽进行偶联，得到喜树碱多肽；
在中性条件下将所述喜树碱多肽进行自组装，得到可变形态的喜树碱多肽纳米制剂。10.根据权利要求9所述的喜树碱多肽纳米制剂的制备方法，其特征在于，两亲性多肽分子采用固相合成技术合成；喜树碱衍生物以喜树碱为基础反应物，在有机碱存在下与三光气反应生成酰氯中间体，酰氯中间体再与2－[2－(吡啶基)连硫基]乙醇反应得到喜树碱衍生物。11.根据权利要求9所述的喜树碱多肽纳米制剂的制备方法，其特征在于，采用巯基－二巯基交换反应技术将喜树碱衍生物与两亲性多肽分子进行偶联，具体包括以下步骤：以无水dmso为溶剂，在氮气氛围下喜树碱衍生物与两亲性多肽混合，室温搅拌反应，反应完全后过滤除去固体杂质，再加入冷乙醚沉析出产物，洗涤并干燥，得到喜树碱多肽。12.根据权利要求9所述的喜树碱多肽纳米制剂的制备方法，其特征在于，喜树碱多肽进行自组装的非共价键相互作用力包括氢键、疏水相互作用、π－π相互作用或范德华力中的任意一种或至少两种的组合，将所述喜树碱多肽进行自组装通过在中性条件下对喜树碱多肽进行退火、自然降温至室温和静置后得到；其中，中性条件的ph为7.3～7.6的水溶液；退火温度为75～85℃，退火时间为25～35min；静置时间为10～15h。13.一种如权利要求1－8任一项所述的喜树碱多肽纳米制剂或者采用权利要求9－12任一项所述的制备方法制备的喜树碱多肽纳米制剂在制备抗癌细胞药物上的应用；所述喜树碱多肽纳米制剂的给药方式包括尾静脉给药、皮下给药或腹腔给药中的任意一种。

技术总结
本发明公开了一种可变形态的喜树碱多肽纳米制剂及其制备方法和应用，所述喜树碱纳米制剂包括两亲性多肽和喜树碱衍生物；所述喜树碱衍生物通过二硫键共价连接到两亲性多肽上。所述喜树碱多肽纳米制剂具有酸响应性和形态转变性。在正常生理条件下维持纳米颗粒结构，保障其在肿瘤部位的渗透性；在肿瘤微环境微酸条件下，该制剂形态由纳米颗粒转变为长度不小于200nm的纳米纤维，可以提高喜树碱的滞留能力，增加其在肿瘤部位的浓度，以降低给药浓度，实现高效杀伤癌细胞；所述喜树碱多肽纳米制剂具有特异性，癌细胞过表达的GSH还原二硫键释放喜树碱原药，可以降低喜树碱在血液循环中对正常细胞的毒副作用，实现特异性杀伤癌细胞。实现特异性杀伤癌细胞。实现特异性杀伤癌细胞。


技术研发人员：程志非 桂双英 王琪 冯乙巳
受保护的技术使用者：安徽中医药大学
技术研发日：2022.05.26
技术公布日：2022/11/1