一种基因编辑工程化M1型巨噬细胞外泌体的制备方法及其应用

一种基因编辑工程化m1型巨噬细胞外泌体的制备方法及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种基因编辑工程化m1型巨噬细胞外泌体的制备方法及其应用。


背景技术：

2.近年来以car-t为代表的细胞疗法和以pd1/pd-l1阻断剂为代表的抗体疗法在肿瘤的免疫治疗中取得了突出的进展。然而，除了适应性免疫之外，先天免疫也同样重要。据报道在肿瘤组织中有接近一半是巨噬细胞，以巨噬细胞为代表的先天免疫的作用不容忽视，尤其是这些巨噬细胞往往是促进癌症发生发展的m2型肿瘤相关巨噬细胞。
3.外泌体作为细胞分泌的胞外囊泡，参与细胞间的通信。其中m1型巨噬细胞外泌体具有重编程肿瘤相关巨噬细胞为m1型巨噬细胞的能力，恢复巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤，从而增强机体的先天免疫。除了固有的生物效应之外，由于其独特的特性和优势，外泌体被认为是天然的药物载体，被广泛研究用于各类药物的递送。如中国专利公开了一种m1型巨噬细胞外泌体疫苗及其制备方法和应用，使m1型巨噬细胞摄取特定的肿瘤抗原ag，然后提取携带肿瘤抗原ag的m1型巨噬细胞的外泌体，即得到外泌体疫苗m1ag-exos。但现有技术公开的m1型巨噬细胞外泌体是携带了特定的肿瘤抗原ag制备得到，但使用肿瘤特异性抗原其表达量较低，免疫原性非常弱，难以诱发机体产生有效的抗肿瘤免疫应答，同时机体对其存在先天性免疫耐受，同样也不能有效激发机体免疫应答。此外，免疫细胞或分子可能使某些肿瘤抗原表位减少或丢失，从而逃逸免疫系统识别和杀伤。如现有技术公开了外源性ox40l基因修饰的巨噬细胞能促进其对肿瘤抗原提呈，增强淋巴细胞对肿瘤抗原的特异性应答，提高ctl的杀伤活性。由于细胞具有功能多样性，巨噬细胞也分为很多种不同功能和作用的细胞，而ox40l基因是否也能作用与其他巨噬细胞。目前有关于ox40l基因与m1型巨噬细胞的作用于机理还未见报道，也并未用于肿瘤免疫的研究中，为了开发一种能够参与细胞间的通讯，并与机体免疫激活相关作用同的递送体系，能够调节t细胞和m1型巨噬细胞，在保证稳定性和安全性的前提下，参与细胞间的通信，调节机体的免疫，用于肿瘤的免疫治疗，为癌症的免疫治疗提供一种新的见解。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供一种基因编辑工程化m1型巨噬细胞外泌体的制备方法及其应用。
5.本发明的第一个目的是提供一种基因编辑工程化m1型巨噬细胞外泌体的制备方法。
6.本发明的第二个目的是提供一种基因编辑工程化m1型巨噬细胞外泌体。
7.本发明的第三目的是提供所述工程化m1型巨噬细胞外泌体的应用。
8.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
9.本发明提供一种基因编辑工程化m1型巨噬细胞外泌体的制备方法，具体包括以下步骤：
10.s1、使用编码ox40l蛋白的慢病毒溶液感染巨噬细胞，添加嘌呤霉素进行筛选，得到稳定表达ox40l的工程化巨噬细胞；
11.s2、将步骤s1得到的稳定表达ox40l的工程化巨噬细胞诱导其定向极化为工程化m1型巨噬细胞；
12.s3、将步骤s2得到的工程化m1型巨噬细胞置于培养基中，收集上清，离心，收集沉淀，洗涤，即得工程化m1型巨噬细胞外泌体。
13.本发明利用外泌体参与细胞间的通讯及ox40/ox40l通路在机体免疫激活中的重要作用，通过使用编码ox40l蛋白的慢病毒对巨噬细胞进行基因编辑，以获得过表达ox40l蛋白的工程化巨噬细胞，再成功诱导工程化m1型巨噬细胞，最后获得过表达ox40l蛋白m1型巨噬细胞外泌体。这种新型外泌体能较好地重新编程肿瘤中的m2型巨噬细胞极化为m1型巨噬细胞，其效果比m1型巨噬细胞外泌体更加显著。所述工程化m1型巨噬细胞外泌体表达的ox40l可以激活cd8
+
t细胞，激活的cd8
+
t细胞分泌的ifn-γ一方面可以杀伤肿瘤细胞，另一方面可以作用于肿瘤相关巨噬细胞，进一步重新极化m2型巨噬细胞为m1型巨噬细胞，从而实现适应性免疫和先天免疫的协同抗肿瘤作用，从而显著抑制肿瘤的生长、有效延长小鼠的生存期。同时，工程化m1型巨噬细胞外泌体的体内生物安全性好，参与细胞间的通信，调节机体的免疫，在肿瘤的免疫治疗中有较好的效果。
14.优选地，步骤s1中为使用编码egfp-ox40l蛋白的慢病毒溶液感染巨噬细胞；通过egfp标记，便于后期观察。
15.优选地，步骤s1采用慢病毒溶液moi为5～20。
16.更优选地，慢病毒溶液moi为10。
17.优选地，步骤s1中巨噬细胞为小鼠巨噬细胞系raw 264.7细胞。
18.优选地，步骤s1采用嘌呤霉素浓度为2～5μg/ml。
19.更优选地，嘌呤霉素浓度为3.5μg/ml。
20.优选地，步骤s2中定向极化采用含有100～500ng/ml lps的完全培养基进行培养。
21.优选地，步骤s3培养基采用去外泌体血清配制的完全培养基培养。
22.本发明提供一种基因编辑工程化m1型巨噬细胞外泌体，由上述方法制备得到。
23.本发明提供所述基因编辑工程化m1型巨噬细胞外泌体在作为免疫药物载体或在肿瘤免疫治疗的药物中的应用。
24.本发明提供一种肿瘤免疫治疗药物，含上述工程化m1型巨噬细胞外泌体。
25.本发明具有以下有益效果：
26.本发明提供了一种基因编辑工程化m1型巨噬细胞外泌体，利用外泌体参与细胞间的通讯及ox40/ox40l通路在机体免疫激活中的重要作用，通过使用编码ox40l蛋白的慢病毒对巨噬细胞进行基因编辑，以获得过表达ox40l蛋白的m1型巨噬细胞外泌体。所述工程化m1型巨噬细胞外泌体可以重编程肿瘤中的m2型巨噬细胞为m1型巨噬细胞；表达的ox40l可以激活cd8
+
t细胞，激活的cd8
+
t细胞分泌的ifn-γ一方面可以杀伤肿瘤细胞，另一方面可以作用于肿瘤相关巨噬细胞，进一步重新极化m2型巨噬细胞为m1型巨噬细胞，从而实现适应性免疫和先天免疫的协同抗肿瘤作用，可显著抑制肿瘤的生长、有效延长小鼠的生存期。本
发明提供的工程化m1型巨噬细胞外泌体的体内生物安全性好，参与细胞间的通信，调节机体的免疫，在肿瘤的免疫治疗中有较好的效果，具有广阔的应用前景和临床价值。
附图说明
27.图1为实施例2中工程化巨噬细胞的荧光图片；
28.图2为实施例2中工程化巨噬细胞的流式细胞术检测结果分析图；
29.图3为实施例2中工程化巨噬细胞的激光共聚焦显微镜检测图(10μm)；
30.图4为工程化m1型巨噬细胞的流式细胞术检测cd80表达变化的分析图；
31.图5为工程化m1型巨噬细胞的流式细胞术检测cd86表达的分析图；
32.图6为工程化m1型巨噬细胞的流式细胞术检测mhc-ii表达的分析图；
33.图7为工程化m1型巨噬细胞外泌体(200nm)；
34.图8为工程化m1型巨噬细胞外泌体的动态光散射仪(dls)检测图；
35.图9为工程化m1型巨噬细胞外泌体(ox40l m1-exos)重编程m2型巨噬细胞为m1型巨噬细胞的检测图(10μm)；
36.图10为各组小鼠肿瘤体积大小随时间变化的统计图(g1：pbs对照组、g2：m1-exos、g3：ox40l m1-exos实验组)；
37.图11为各组小鼠的生存曲线(g1：pbs对照组、g2：m1-exos、g3：ox40l m1-exos实验组)；
38.图12为各组小鼠体重随时间变化的统计图(g1：pbs对照组、g2：m1-exos、g3：ox40l m1-exos实验组)。
具体实施方式
39.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
40.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
41.以下实施例中采用的编码egfp-ox40l蛋白的慢病毒溶液通过使用传统的慢病毒包装方法，即通过293t细胞包装得到；其中采用的质粒、病毒包装质粒pcmv-vsvg plasmids和pspax2 plasmids均购买自广州源井生物科技有限公司。
42.实施例1工程化m1型巨噬细胞外泌体的制备
43.1、构建工程化过表达的巨噬细胞系
44.使用编码egfp-ox40l蛋白的慢病毒溶液感染巨噬细胞raw 264.7，慢病毒溶液的moi为5。而后使用2μg/ml的嘌呤霉素进行细胞筛选，得到稳定表达ox40l的工程化巨噬细胞。
45.2、制备工程化m1型巨噬细胞
46.使用含有100ng/ml lps的完全培养基(购自于sigma公司)培养工程化巨噬细胞24h，诱导其定向极化为工程化m1型巨噬细胞。
47.3、制备工程化m1型巨噬细胞外泌体
48.用去外泌体血清配制的完全培养基(购自于gibco)培养工程化m1型巨噬细胞，收
集培养基上清进行差速离心，具体为：200g离心5min收集上清、1000g离心5min收集上清、9000g离心25min收集上清，最后上清在90000g离心70min，收集沉淀，pbs洗2-3次，即得工程化m1型巨噬细胞外泌体。
49.实施例2工程化m1型巨噬细胞外泌体的制备
50.1、构建工程化过表达的巨噬细胞系
51.使用编码egfp-ox40l蛋白的慢病毒溶液感染巨噬细胞raw 264.7，慢病毒溶液的moi为10。而后使用3.5μg/ml的嘌呤霉素进行细胞筛选，得到稳定表达ox40l的工程化巨噬细胞。
52.2、制备工程化m1型巨噬细胞
53.使用含有300ng/ml lps的完全培养基培养工程化巨噬细胞36h，诱导其定向极化为工程化m1型巨噬细胞。
54.3、制备工程化m1型巨噬细胞外泌体
55.用去外泌体血清配制的完全培养基培养工程化m1型巨噬细胞，收集培养基上清进行差速离心，具体为：300g离心10min收集上清、2000g离心10min收集上清、10000g离心35min收集上清，最后上清在10000g离心80min，收集沉淀，pbs洗2-3次，即得工程化m1型巨噬细胞外泌体。
56.实施例3工程化m1型巨噬细胞外泌体的制备
57.1、构建工程化过表达的巨噬细胞系
58.使用编码egfp-ox40l蛋白的慢病毒溶液感染巨噬细胞raw 264.7，慢病毒溶液的moi为20。而后使用5μg/ml的嘌呤霉素进行细胞筛选，得到稳定表达ox40l的工程化巨噬细胞。
59.2、制备工程化m1型巨噬细胞
60.使用含有500ng/ml lps的完全培养基培养工程化巨噬细胞24-48h，诱导其定向极化为工程化m1型巨噬细胞。
61.3、制备工程化m1型巨噬细胞外泌体
62.用去外泌体血清配制的完全培养基培养工程化m1型巨噬细胞，收集培养基上清进行差速离心，具体为：400g离心20min收集上清、3000g离心20min收集上清、11000g离心45min收集上清，最后上清在11000g离心120min，收集沉淀，pbs洗2-3次，即得工程化m1型巨噬细胞外泌体。
63.实施例4工程化m1型巨噬细胞外泌体的性能表征
64.采用上述实施例2中得到稳定表达ox40l的工程化巨噬细胞，分别利用流式细胞术和荧光显微镜、共聚焦检测对工程化巨噬细胞上蛋白的表达情况进行分析。
65.结果如图1所示，在荧光显微镜下观察到细胞中都表达egfp-ox40l蛋白。在流式细胞术分析显示，如图2所示有90％以上的细胞表达egfp-ox40l蛋白。在共聚焦检测中，如图3所示，显示ox40l蛋白主要在细胞膜上表达。
66.然后，对上述实施例2中培养的工程化m1型巨噬细胞的表达进行分析，其中采用的cd80、cd86和mhc-ii是m1型巨噬细胞的markers(特征性蛋白)，采用流式细胞术分析进行表达分析。
67.结果如图4～6所示，在诱导之后，细胞上cd80、cd86和mhc-ii都显著表达，提示工
程化m1型巨噬细胞诱导成功。
68.将上述实施例2中制备得到的工程化m1型巨噬细胞外泌体进行透射电子显微镜观测、动态光散射仪分析，结果如图7所示，在透射电子显微镜下观测显示工程化m1型巨噬细胞外泌体为茶托状；动态光散射仪(dls)分析结果如图8所示，表明其制备的工程化m1型巨噬细胞外泌体粒径大致为169.5nm、zeta电位大致为-22.7mv。
69.此外，我们还对工程化m1型巨噬细胞外泌体(ox40l m1-exos)重编程巨噬细胞的能力进行了体外研究。分别使用pbs(control)、巨噬细胞外泌体(m0-exos)、m1型巨噬细胞外泌体(m1-exos)以及ox40l m1-exos处理m2型巨噬细胞，24h后通过检测m1型巨噬细胞标志物cd86的表达量情况，从而判断m2型巨噬细胞是否重新极化为m1型巨噬细胞。
70.结果如图9所示，经过pbs和m0-eoxs处理的m2型巨噬细胞中cd86标志物表达较少，而m1-exos和ox40l m1-exos处理的m2型巨噬细胞中cd86标志物表达量较高。表明m0-eoxs几乎没有重编程能力，而m1-exos和ox40l m1-exos均能较好地重新编程m2型巨噬细胞极化为m1型巨噬细胞。
71.实施例5工程化m1型巨噬细胞外泌体体内抑瘤作用效果
72.本发明经中山大学动物伦理委员会审核批准(批准编号为sysu-iacuc-2021-000218)，可以在相关实验中使用实验动物。本实施例在balb/c小鼠上构建了乳腺癌的荷瘤模型，而后将荷瘤小鼠随机分为3组，并分别接受以下药物治疗：磷酸盐缓冲溶液pbs(g1，对照组)、m1型巨噬细胞外泌体(m1-exos，g2)、工程化m1型巨噬细胞外泌体ox40l m1-exos(g3，实验组)。观察并记录了各组小鼠肿瘤的生长情况，同时还对其生存状态进行了记录。
73.结果如图10所示，表明ox40l m1-exos显著抑制了肿瘤的生长，结果如图11所示，表明ox40l m1-exos显著延长了小鼠的生存期。由上述结果都显示实验组(ox40l m1-exos)具有很好的体内抑瘤效果。同时，由小鼠的体重结果图12所示，结果显示各组小鼠没有明显的体重损失，初步验证了药物的体内生物安全性。
74.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种基因编辑工程化m1型巨噬细胞外泌体的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：s1、使用编码ox40l蛋白的慢病毒溶液感染巨噬细胞，筛选，得到稳定表达ox40l的工程化巨噬细胞；s2、将步骤s1得到的稳定表达ox40l的工程化巨噬细胞诱导其定向极化为工程化m1型巨噬细胞；s3、将步骤s2得到的工程化m1型巨噬细胞置于培养基中，收集上清，离心，收集沉淀，洗涤，即得工程化m1型巨噬细胞外泌体。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤s1中采用的慢病毒溶液moi为5～20。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤s1中采用的巨噬细胞为raw 264.7细胞。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤s1中所述筛选为添加嘌呤霉素进行筛选，嘌呤霉素浓度为2～5μg/ml。5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤s2中定向极化采用含有100～500ng/ml lps的完全培养基进行培养。6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤s3中培养基采用去外泌体血清配制的完全培养基培养。7.一种基因编辑工程化m1型巨噬细胞外泌体，其特征在于，由权利要求1～6任一所述方法制备得到。8.权利要求7所述基因编辑工程化m1型巨噬细胞外泌体在作为免疫药物载体中的应用。9.权利要求7所述基因编辑工程化m1型巨噬细胞外泌体在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。10.一种肿瘤免疫治疗药物，其特征在于，含权利要求7所示工程化m1型巨噬细胞外泌体。

技术总结
本发明公开了一种基因编辑工程化M1型巨噬细胞外泌体及其制备方法与应用。本发明利用外泌体参与细胞间的通讯及OX40/OX40L通路在机体免疫激活中的重要作用，获得过表达OX40L蛋白的工程化M1型巨噬细胞外泌体；该外泌体能重新编程M2型巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞，其效果比原始的M1型巨噬细胞外泌体更加显著；能激活CD8


技术研发人员：梅林 王莹 余永康
受保护的技术使用者：中山大学
技术研发日：2022.07.20
技术公布日：2022/11/1