两株金耳新菌株及其ssr分子标记鉴定方法
技术领域
1.本发明属于食用菌技术领域，具体涉及两株金耳新菌株及其ssr分子标记鉴定方法。
背景技术：2.金耳（naematelia aurantialba (bandoni & m. zang) millanes & wedin），其隶属于真菌界fungi、担子菌门basidiomycota、银耳纲tremellomycetes、银耳目tremellales、耳包革科naemateliaceae、耳包革属naematelia。
3.金耳成熟后子实体为金黄色耳瓣状，其外形酷似大脑，又名脑耳、脑形银耳等。野生金耳多见于高山栎林带，生于高山栎或高山剌栎等树干上。并与毛韧革菌、扁韧革菌等韧革菌有寄生或部分共生关系。金耳子实体体形差别较大，野生金耳一般直径1-12厘米，厚1-7厘米，人工栽培金耳较野生金耳偏大，直径3-20厘米，厚2-11厘米。
4.毛韧革菌（stereum hirsutum (willd.) pers.）其隶属于真菌界fungi，担子菌纲basidiomycetes、多孔菌目polyporales、革菌科thelephoraceae、韧革菌属stereum。
5.金耳作为一种珍贵的食药用菌，含有大量人体所需的氨基酸、蛋白质和矿质元素，特有的金耳多糖作为目前的研究热点，是金耳的主要活性成分之一，具有降血脂、降血糖、增强免疫力等多种功效。早在《本草纲目》中就已经有记载，金耳具有止咳化痰、生津止渴的功效，可用于治疗痰多、气喘、肺结核、虚痨、咳嗽、盗汗等症状。但野生金耳产量较少，远远不足以满足市场的需求，因此人工栽培是十分必要的。但由于金耳自身生物学性状的特殊性和菌种制作的独特性导致了金耳菌种的不稳定，人工栽培金耳产量较低，产量也参差不齐。因此利用分子生物学技术开发精准有效的金耳菌株鉴定体系是极其重要的。
技术实现要素：6.本发明的第一目的在于提供两株金耳新菌株，本发明的第二目的是提供一种鉴定金耳zjje002 与zjje003菌株的方法。
7.本发明的第一目的是这样实现的，两株金耳菌株（naematelia aurantialba）zjje002与zjje003，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号为cgmcc no.40124与cgmcc no.40125，its序列如seq no.1和seq no.2所示。本发明的第二目的提供了用于鉴定金耳zjje002与zjje003菌株的ssr分子标记鉴定方法，该方法由以下步骤实现：s1、将金耳菌种转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，25℃培养15d后收集菌丝；s2、提取所述菌丝的基因组dna，紫外分光光度法检测总基因组dna浓度和质量；s3、采用权利要求2的ssr分子标记对步骤2提取的dna进行ssr标记的pcr扩增；s4、将s3得到的扩增产物进行毛细管电泳检测，分析ssr引物扩增
出的等位片段的数量及分子量大小，获得不同ssr等位片段的编号组合，符合ssr等位片段编号组合的菌株即为金耳zjje002 与zjje003菌株。
8.本发明中的ssr分子标记由以下7对ssr分子标记组成：jessr003、jessr010、jessr032、jessr075、jessr090、jessr098及jessr100。
9.本发明的有益效果是：1、本发明提供了两株金耳新菌株zjje002与zjje003，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc）；保藏编号为cgmcc no.40124与cgmcc no.40125。
10.2、本发明提供的金耳ssr分子标记在供试的7个金耳栽培菌株(包括zjje001、zjje002、zjje003、j-2、j-5、j-6、j-7）中具有金耳zjje002与zjje003菌株的专一性。用本发明提供的引物组合，可方便快速地将两个金耳菌株和其他5个区分开，实现了节约成本、提高效率、操作方便、结果准确的优势，可用于金耳zjje002与zjje003菌株的快速鉴定，具有良好的应用前景。
11.3、本发明提供的金耳zjje002 与zjje003菌株的精准鉴定方法，可以避免己选育出的金耳优良菌种在生产经营和市场流通过程中与其它同品种混杂，从而有效保护其知识产权，对金耳生产过程中品种的真实性鉴定有着重要意义。
附图说明
12.图1为金耳zjje002与zjje003菌株的系统发育树；图2为引物jessr003分别在所选金耳zjje002、zjje003和5种金耳菌株j-2、zjje001、j-5、j-6、j-7中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；图3为引物jessr010分别在所选金耳zjje002、zjje003和5种金耳菌株j-2、zjje001、j-5、j-6、j-7中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；图4为引物jessr032分别在所选金耳zjje002、zjje003和5种金耳菌株j-2、zjje001、j-5、j-6、j-7中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；图5为引物jessr075分别在所选金耳zjje002、zjje003和5种金耳菌株j-2、zjje001、j-5、j-6、j-7中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；图6为引物jessr090分别在所选金耳zjje002、zjje003和5种金耳菌株j-2、zjje001、j-5、j-6、j-7中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；图7为引物jessr098分别在所选金耳zjje002、zjje003和5种金耳菌株j-2、zjje001、j-5、j-6、j-7中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；图8为引物jessr100分别在所选金耳zjje002、zjje003和5种金耳菌株 j-2、zjje001、j-5、j-6、j-7中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；图9为基于ssr分子标记构建的7株金耳菌株遗传距离的upgma聚类树。
具体实施方式
13.下面结合附图与实施例对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
14.本发明提供了两株金耳菌株zjje002与zjje003，使用孢子分离法采集自怒江野生金耳子实体。并于2022年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
（cgmcc）；保藏编号为cgmccno.40124与cgmccno.40125，its序列如seqno.1和seqno.2所示。本发明提供的金耳ssr分子标记组合，由以下7对ssr分子标记组合组成：jessr003、jessr010、jessr032、jessr075、jessr090、jessr098及jessr100。所述ssr分子标记的引物序列信息如表1所示。
15.表1ssr标记引物信息本发明所述ssr分子标记鉴定金耳zjje002与zjje003菌株的方法，按以下步骤实现：s1、将待测金耳菌株转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，25℃培养15d后收集菌丝；s2、提取所述菌丝的基因组dna，紫外分光光度法检测总基因组dna浓度和质量；s3、采用权利要求2的ssr分子标记对步骤2提取的dna进行ssr标记的pcr扩增；s4、将s3得到的扩增产物进行毛细管电泳检测，分析ssr引物扩增出的等位片段的数量及分子量大小，获得不同ssr等位片段的编号组合，符合ssr等位片段编号组合的菌种即为金耳zjje002与zjje003菌株。
16.符合ssr等位片段编号组合为1/1/2/1/3/1/2的菌株为金耳zjje002菌株；符合ssr等位片段编号组合为3/1/2/1/3/2/2的菌株为金耳zjje003菌株。上述7对ssr引物的等位片段数量及分子量大小信息如表4所示：表4鉴定金耳zjje003品种7对ssr标记引物扩增的等位片段信息
。
17.实施例l 金耳zjje002与zjje003菌株的获得具体步骤如下：（1）采摘金耳的子实体，清洗干净，放入超净工作台中；（2）用干净的解剖刀将子实体切成小块，使子实体的表面倒立在灭过菌的pda平皿中；（3）将平皿置于25℃恒温避光放置7d,即可获得金耳菌株。
18.实施例2 金耳zjje002与zjje003菌株的分子鉴定具体步骤如下：（1）dna提取
将供试的菌株转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，25℃培养15d后收集菌丝；采用擎科 tsp101-200试剂盒提取菌丝的基因组dna，用琼脂糖凝胶电泳法和生物分光光度计法检测dna的纯度和浓度。
19.（2）its 扩增及检测使用its 通用引物its4、its5进行pcr扩增。25μl扩增体系包括：金牌mix(green，擎科 tse101)20ul、0.5μmol/l 上下游引物、50ng 基因组模板dna。pcr 扩增程序为：94℃2min；94℃15s、60℃30s、72℃60s、30个循环；72℃10min。pcr完成后，加6
×
上样缓冲液5μl 混匀，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。检测合格后，进行测序。
20.（3）序列比较及系统发育分析将获得的its序列，使用blast软件在ncbi数据库进行同源性比对 ，与数据库中已有的金耳的各个菌株相应序列一致性（identities）都达到97%以上。its序列如seq no.1和seq no.2所示。
21.同时，从数据库下载耳包革属物种和银耳（tremella fuciformis）的its序列，且使用mega7软件构建nj系统发育树，使用默认参数，bootstrap检验为1000次。由图1，可以看出zjje001、zjje002与zjje003菌株与金耳的its序列聚为一枝，且支持率为93%。综合以上结果可以得出结论zjje002与zjje003菌株为耳包革科（naemateliaceae）、耳包革属（naematelia）的金耳（naematelia aurantialba）。
22.实施例3 采用本发明提供的ssr分子标记鉴别金耳zjje002与zjje003菌株具体步骤如下；一、实验方法（1）dna提取将供试的菌种转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，25℃培养15d后收集菌丝；采用擎科 tsp101-200试剂盒提取菌丝的基因组dna，用琼脂糖凝胶电泳法和生物分光光度计法检测dna的纯度和浓度。
23.（2）pcr扩增采用7对ssr分子标记对提取的dna进行ssr标记的pcr扩增；pcr扩增体系为：总体积20ul，包括：擎科tse101-金牌mix(green) 16.45ul，10 μm tag dna酶 1.2ul，10umol/l ssr标记正向引物和反向引物各1.2ul，模板dna 1ul。pcr 反应条件：98℃ 2 min; 98℃ 10 second，60℃ 10 second，72℃ 10 second，35个循环；72℃ 5 min。为保证鉴定的准确性，进行三次重复实验。
24.（3）将扩增产物进行毛细管电泳检测：将abi hidi formamide缓存液与genescan 500liz size standard内标试剂按130：1混合，配成mix；用96孔反应板分装mix，每个孔中加入10ul mix；对应着在96孔板中加入0.5ul样品模板，离心到4000 rpm即停；用金属浴加热器将混合板95℃加热预变性5分钟，拿出后立即放入-20℃；冷却后拿出，4000 rpm离心，解冻、混匀；使用3730测序仪进行毛线管电泳，加样量为2ul样品和6ul溴酚蓝，电压为300v，时间12分钟。
25.二、结果分析：（1）毛细管电泳的荧光检测峰值图对比分析将其他5个金耳菌种的电泳检测峰值图与zjje002、zjje003的电泳检测峰值图进
行对比（图2-8），金耳zjje002、zjje003与其他5个菌种的每个荧光标记出现的峰清晰可辨。图2为引物jessr003扩增的结果，zjje002、zjje003和5种金耳菌株j-2、zjje001、j-5、j-6、j-7对应的片段大小依次为173、183、183、175、183、183、183；图3为引物jessr010扩增的结果，zjje002、zjje003和5种金耳菌株j-2、zjje001、j-5、j-6、j-7对应的片段大小依次为167、167、178、（173+184）、167、（167+178）、167；图4为引物jessr032扩增的结果，zjje002、zjje003和5种金耳菌株j-2、zjje001、j-5、j-6、j-7对应的片段大小依次为165、165、168、161、165、165、165；图5为引物jessr075扩增的结果，zjje002、zjje003和5种金耳菌株j-2、zjje001、j-5、j-6、j-7对应的片段大小依次为159、159、161、180、161、161、161；图6为引物jessr090扩增的结果，zjje002、zjje003和5种金耳菌株j-2、zjje001、j-5、j-6、j-7对应的片段大小依次为175、175、175、169、175、175、（163+175）；图7为引物jessr098扩增的结果，zjje002、zjje003和5种金耳菌株j-2、zjje001、j-5、j-6、j-7对应的片段大小依次为129、132、129、（129+135）、129、132、132；图8为引物jessr100扩增的结果，zjje002、zjje003和5种金耳菌株j-2、zjje001、j-5、j-6、j-7对应的片段大小依次为139、139、137、（137+143）、137、137、137。
26.图2-8的结果说明本发明提供的7对ssr分子标记引物组合能够精准地将金耳zjje002与zjje003菌株与其他5个供试金耳菌株区分。
27.（2）7对ssr引物扩增出的条带组合分析将7对ssr引物在7个供试金耳菌种中扩增出的等位片段根据分子量大小进行编码，并进行编号组合。j-2、zjje001、j-5、j-6、j-7对应的编号组合为3/3/3/2/3/1/1、2/(2+4)/1/3/2/(1+3)/(1+3)、3/1/2/2/3/1/1、3/(1+3)/2/2/3/2/1、3/1/2/2/(1+3)/2/1。符合ssr等位片段编号组合为1/1/2/1/3/1/2的菌株为金耳zjje002菌株；符合ssr等位片段编号组合为3/1/2/1/3/2/2的菌株为金耳zjje003菌株。
28.（3）聚类分析基于7对ssr扩增出的多态性片段对7个金耳菌株进行遗传多样性分析，基于nei的遗传距离，构建了7个金耳菌株的upgma聚类树（图9）。从图9可知，本发明提供的7对引物将金耳zjje003与zjje002聚为一个类群，其他的j-2、j-5、j-6、j-7菌株聚为一个类群，金耳zjje001菌株为单独的一枝并完全与其他菌株区分开。由此可见，本发明提供的7对ssr引物组合可以应用于上述7种不同金耳菌株的区分。
29.实施例4 金耳zjje002与zjje003菌株的栽培方法1）配置栽培料：按木屑70份，玉米芯15份，麦麸13.9份，石膏0.5份，石灰0.5份，磷酸二氢钾0.1份的栽培料配比称取原料，加水拌匀使含水量为50-65%；2）装料灭菌：将配置好的栽培料装入栽培袋中高压蒸汽灭菌并冷却至室温；3）接种：在栽培袋表面打孔7-9个，底部开3-5个接种穴，在每个孔内接入毛韧革菌液体菌种9-11ml，将原种瓶中金耳组织块切成1cm3左右的小块，嫁接在每接种穴内并以透气膜封口，中间间隔一个洞，在17℃-20℃、空气湿度50%-60%条件下，暗培养20-25天；4）出菇管理：待嫁接组织块开始发白，且开始生长快接触透气膜，将空气湿度提高至70%-75%，透气膜稍微撕开一个小口，继续培养5-7天；5）待组织块开始长出，撑开透气膜时，将透气膜撕去，空气湿度提高至80%-85%，16-18℃继续培养10-15天；
6）待金耳子实体生长至鸡蛋大小时，将湿度提高至90%-95%，16-19℃，光照继续培养7-10天；7）待金耳子实体长大快开瓣时，湿度提高至95%-100%，继续光照培养5-7天至成熟，即可采摘。
30.经统计，zjje002与zjje003的出耳率为97%和96.8%，一茬生物学效率分别为70%和68%。
31.实施例5 金耳zjje002与zjje003菌株的栽培方法1）配置栽培料：按木屑80份，玉米芯10份，麦麸14.5份，石膏0.6份，石灰0.4份，磷酸二氢钾0.12份的栽培料配比称取原料，加水拌匀使含水量为65%；其他步骤与实施例4相同。
32.经统计，zjje002与zjje003菌株的出耳率分别为96.6%和97.1%，一茬生物学效率分别为67%和69%。
33.实施例6 金耳zjje002与zjje003菌株的栽培方法1）配置栽培料：按木屑70份，玉米芯20份，麦麸13.9份，石膏0.4份，石灰0.6份，磷酸二氢钾0.08份的栽培料配比称取原料，加水拌匀使含水量为50%；其他步骤与实施例4相同。
34.经统计，zjje002与zjje003菌株的出耳率分别为97.2%和97.3%，一茬生物学效率分别为71%和72%。
技术特征：1.两株金耳新菌株zjje002与zjje003，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为cgmcc no.40124与cgmcc no.40125，its序列分别如seq no.1和seq no.2所示。2.金耳ssr分子标记组合，其特征在于由以下7对ssr分子标记组成：jessr003、jessr010、jessr032、jessr075、jessr090、jessr098及jessr100；所述ssr分子标记的引物序列分别为：jessr003-f：catccctatgcaatgattccacg；jessr003-r：tagaacaagactagaaccgggac；jessr010-f：gaaggacgtacaaggccgtg；jessr010-r：gtgactagatttgatgctggcag；jessr032-f：gctctgtttacgaggggatagg；jessr032-r：ccgaatctgacaccatcatctct；jessr075-f：gagtcttgagcggaggagtac；jessr075-r：gacgtaccatgctgatgctgat；jessr090-f：taaagcacttcaattgcgtctcg；jessr090-r：ctagaggaggccaagaggaagaa；jessr098-f：cctataccttagcctgagacagc；jessr098-r：gaggatcaccatgtccgtctc；jessr100-f：cttggggaggtggagagtatagg；jessr100-r：actgttcttcgcttgaccaaatt。3.根据权利要求2所述金耳ssr分子标记组合，其特征在于，所述7对 ssr分子标记的引物的等位片段数量及分子量大小信息如下：
。4.一种采用权利要求2所述ssr分子标记鉴定金耳菌株zjje002与zjje003的方法，其特征在于，按以下步骤实现：s1、将金耳菌种转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，25℃培养15d后收集菌丝；s2、提取所述菌丝的基因组dna，紫外分光光度法检测总基因组dna浓度和质量；s3、采用权利要求2的ssr分子标记对步骤2提取的dna进行ssr标记的pcr扩增；s4、将s3得到的扩增产物进行毛细管电泳检测，分析ssr引物扩增出的等位片段的数量及分子量大小，获得不同ssr等位片段的编号组合，符合ssr等位片段编号组合的菌株即为金耳zjje002 与zjje003菌株。5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，符合ssr等位片段编号组合为1/1/2/1/3/1/2的菌株为金耳zjje002菌株；符合ssr等位片段编号组合为3/1/2/1/3/2/2的菌株为金耳zjje003菌株。
技术总结本发明公开了两株金耳新菌株及其SSR分子标记鉴定方法，所述2个菌株命名为ZJJE002和ZJJE003，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCC NO.40124与CGMCC NO.40125，ITS序列如SEQ NO.1和SEQ NO.2所示。所述SSR分子标记鉴定金耳ZJJE002和ZJJE003菌株的方法是通过检测金耳菌种的SSR分子标记组合PCR扩增产物的等位片段的数量及分子量大小，获得不同SSR等位片段的编号组合，符合SSR等位片段编号组合为1/1/2/1/3/1/2的菌株为金耳ZJJE002菌株；符合SSR等位片段编号组合为3/1/2/1/3/2/2的菌株为金耳ZJJE003菌株。本发明SSR分子标记鉴定方法具有节约成本、效率高、操作方便、结果准确的优点，可用于ZJJE002与ZJJE003菌株的快速鉴定。ZJJE002与ZJJE003菌株的快速鉴定。ZJJE002与ZJJE003菌株的快速鉴定。
技术研发人员：李雪松 华蓉 孙达锋 刘绍雄 张俊波 岳万松 李建英 余金凤 刘春丽
受保护的技术使用者：中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所
技术研发日：2022.05.30
技术公布日：2022/11/1
