1.本发明属于生物降解处理技术领域，具体涉及一种可用于电镀污染场地修复的铬还原菌群的富集及其在液相污染体系内进行生物还原处理的应用。
背景技术：2.在过去的40年时间里，电镀工业在中国的经济发展中发挥了重要的作用，并且已成为汽车，制造业，家用电器和电子行业等重要过程。据统计，目前我国有近20000个电镀厂区，其中40％以上集中在长三角和珠三角，涉及最广的工艺是镀锌、铜、镍及铬。但是我国电镀企业普遍设备陈旧、工艺落后，三废处理率低，使得电镀行业每年产生约4亿吨废水，其中包含重金属和50,000吨固体废物，使电镀厂点成为了重要的重金属污染源。
3.铬是电镀行业产生的典型重金属污染物，毒性大、“三致”效应强，属于国家重点控制的五大重金属之一。目前，利用微生物进行六价铬污染环境的治理是具有一定发展前景的。利用微生物的生长活动，将六价铬作为其生产所需的能量来源，同时以环境中的有机物作为碳源，在铬还原酶的作用下，将六价铬还原为毒性更低、迁移性更弱的三价铬。由于其最终的代谢产物低毒性，成本相比于化学处理方法更为低廉，而且利用原位土著微生物生态风险低，因此如何达成高效的微生物还原六价铬是很有意义的。
4.同时，在电镀污染环境中，除了高毒性的六价铬以外，还存在镍铜重金属的复合污染，且他们的存在会对土著微生物还原六价铬造成抑制作用，所以研究六价铬和其他重金属同时存在时，铬还原菌对于六价铬的高效去除是具有非常重要意义的。
5.现有技术中，目前尚无可以耐受镍铜重金属的六价铬还原菌群。主要的应用主要是处理单一六价铬污染，或者是吸附单一重金属。
技术实现要素：6.本发明的目的在于克服现有技术的不足，并提供一种可用于电镀污染场地修复的固态菌剂及其方法与应用。
7.本发明所采用的具体技术方案如下：
8.第一方面，本发明提供了一种可用于电镀污染场地修复的固态菌剂的制备方法，具体如下：
9.将完全溶解的聚乙烯醇与海藻酸钠粉末混合均匀，得到第一混合溶液；向第一混合溶液中加入活性炭，得到第二混合溶液；将含有微杆菌属(microbacterium sp.)cr2203-1和赖氨酸芽胞杆菌(lysinibacillus sp.)cr2203-2的铬还原菌剂按照(1-2):10的体积比与所述第二混合溶液混合均匀，随后于0-4℃下滴入浓度为20-50％的氯化钙饱和硼酸溶液，以包埋得到固态菌剂；
10.所述微杆菌属cr2203-1于2022年06月13日保藏于中国武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no:m2022878；所述赖氨酸芽胞杆菌cr2203-2于2022年06月13日保藏于中国武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no:
m2022879。
11.作为优选，所述聚乙烯醇于70～80℃下以实现完全溶解。
12.作为优选，所述聚乙烯醇与海藻酸钠粉末的质量比为1:(1-5)。
13.作为优选，所述第二混合溶液中的活性炭浓度为3-5g/l。
14.作为优选，所述铬还原菌剂中微杆菌属cr2203-1的含量占比为3％～10.2％，赖氨酸芽胞杆菌cr2203-2的含量占比为62％～89.2％。
15.作为优选，所述铬还原菌剂的制备方法如下：
16.s1：将2g胰蛋白胨、1g酵母提取物和2g氯化钠加入至200ml水中，用hcl调节ph至7，压力升至103.4kpa，于121.3℃温度下维持15～30分钟以高温高压灭菌，配成细菌基础培养基；在所述细菌基础培养基中加入0.17-0.56g重铬酸钾，制成含有300-1000mg/l六价铬的含铬培养基；
17.s2：以10-40g:1l的比例向所述含铬培养基中添加电镀场地污染土壤，于35℃和120rpm的条件下培养3天后取上清菌液，得到初始接种源；
18.s3：将所述初始接种源接种至含有镍30-50mg/l、铜50-100mg/l和六价铬50-300mg/l的细菌基础培养基中进行六价铬还原，至菌群具有还原六价铬的功能且50-300mg/l六价铬完全被还原，富集得到铬还原菌剂。
19.第二方面，本发明提供了一种利用第一方面任一所述制备方法得到的可用于电镀污染场地修复的固态菌剂。
20.第三方面，本发明提供了一种利用第二方面所述固态菌剂在处理污染土壤中的应用，具体的，于35℃和120rpm的条件下，将含有50-300mg/l六价铬的污染土壤和固态菌剂加入细菌基础培养基中。
21.第四方面，本发明提供了一种利用第二方面所述固态菌剂在处理污染土壤中的应用，具体的，于35℃和120rpm的条件下，将含有50-300mg/l六价铬、30-50mg/l镍或50-100mg/l铜的污染土壤和固态菌剂加入细菌基础培养基中。
22.作为第三方面或第四方面的优选，所述细菌基础培养基的制备方法如下：
23.将2g胰蛋白胨、1g酵母提取物和2g氯化钠加入至200ml水中，用hcl调节ph至7，压力升至103.4kpa，于121.3℃温度下维持15～30分钟以高温高压灭菌，配成细菌基础培养基。
24.本发明相对于现有技术而言，具有以下有益效果：
25.1)本发明中的固态菌剂具有高效的还原六价铬的效率，在24小时内可以将50mg/l的六价铬完全还原。
26.2)本发明中的固态菌剂可以同时还原环境中的六价铬和耐受环境中的镍铜。
27.3)相较于现有技术，本发明用微生物固态菌剂去除环境中的六价铬具有成本低、有效期长、降解效果稳定、环境友好等优点，适合长时间地处理六价铬和镍铜复合污染的环境。
附图说明
28.图1本发明中固态菌剂进行六价铬还原数据图；
29.图2本发明中固态菌剂进行不同浓度六价铬还原效率图；
30.图3本发明中固态菌剂进行镍铜混合污染下六价铬还原效率图；
31.图4本发明中固态菌剂以及不同起始六价铬浓度下组成类别(门水平)；
32.图5本发明中固态菌剂以及不同起始六价铬浓度下组成类别(属水平)；
33.图6本发明中固态菌剂进行镍铜混合污染下土壤中六价铬还原效率图。
34.生物材料保藏
35.本发明的微杆菌属(microbacterium sp.)cr2203-1于2022年06月13日保藏于中国武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no:m2022878；本发明的赖氨酸芽胞杆菌(lysinibacillus sp.)cr2203-2于2022年06月13日保藏于中国武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no:m2022879。
具体实施方式
36.下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
37.本发明中，作为初始接种源的是利用污染土壤在含300-1000mg/l六价铬的细菌基础培养基中富集的菌群。污染土壤的获取方式是：采集废弃电镀场地未经防漏措施的污染土壤(采集自张家口动力机械厂停产电镀车间)，在含300-1000mg/l六价铬的细菌基础培养基中培养3天，然后将上清菌群接种至含有50-300mg/l六价铬和镍(30-50)mg/l或铜(50-100)mg/l的细菌基础培养基中，至六价铬完全被还原，即可获得菌种含量稳定的菌群。该菌群中含按含量占比计算的下属菌种：赖氨酸芽胞杆菌(lysinibacillus sp.)cr2203-2为62％～89.2％，微杆菌属(microbacterium sp.)cr2203-1为3％～10.2％，均已被证明具有六价铬还原和耐受镍铜重金属的作用，余量是非富集对象的杂菌。
38.菌群的富集方法具体如下：
39.s1：将2g胰蛋白胨、1g酵母提取物和2g氯化钠加入至200ml水中，用hcl调节ph至7，压力升至103.4kpa(1.05kg/cm2)，于121.3℃温度下维持15～30分钟以高温高压灭菌，配成细菌基础培养基；在所述细菌基础培养基中加入0.17-0.56g重铬酸钾，制成含有300-1000mg/l六价铬的含铬培养基；
40.s2：以10-40g:1l的比例向所述含铬培养基中添加电镀场地污染土壤，于35℃和120rpm的条件下培养3天后取上清菌液，得到初始接种源；
41.s3：将所述初始接种源接种至含有镍30-50mg/l或铜50-100mg/l和六价铬50-300mg/l的细菌基础培养基(即该细菌基础培养基含有六价铬50-300mg/l和镍30-50mg/l或者含有六价铬50-300mg/l和铜50-100mg/l)中进行六价铬还原，至菌群具有还原六价铬的功能且50-300mg/l六价铬完全被还原，富集得到铬还原菌剂。
42.本发明所得微杆菌属cr2203-1于2022年06月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no:m2022878；本发明所得赖氨酸芽胞杆菌cr2203-2于2022年06月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no:m2022879。
43.将菌群形成的菌液利用海藻酸钠、聚乙烯醇、石墨以及氯化钙饱和硼酸溶液进行包埋，形成固态菌剂。具体如下：
44.将聚乙烯醇于70～80℃下以实现完全溶解，将完全溶解的聚乙烯醇与海藻酸钠粉末按照质量比为1:(1-5)混合均匀，得到第一混合溶液；向第一混合溶液中加入活性炭，得
到第二混合溶液，第二混合溶液中的活性炭浓度为3-5g/l；将含有3％～10.2％微杆菌属(microbacterium sp.)cr2203-1和62％～89.2％赖氨酸芽胞杆菌(lysinibacillus sp.)cr2203-2的铬还原菌剂按照(1-2):10的体积比与所述第二混合溶液混合均匀，随后于0-4℃下滴入浓度为20-50％的氯化钙饱和硼酸溶液，以包埋得到固态菌剂。
45.下面将上述保藏的微杆菌属cr2203-1和赖氨酸芽胞杆菌cr2203-2应用于一个具体实施例中，通过将其制成固态菌剂用于土壤修复，以展示其所能实现的技术效果。
46.实施例
47.将聚乙烯醇于70～80℃下以实现完全溶解，将完全溶解的聚乙烯醇与海藻酸钠粉末按照质量比为1:5混合均匀，得到第一混合溶液；向第一混合溶液中加入活性炭，得到第二混合溶液，第二混合溶液中的活性炭浓度为3g/l；将含有10.2％微杆菌属(microbacterium sp.)cr2203-1和89.2％赖氨酸芽胞杆菌(lysinibacillus sp.)cr2203-2的铬还原菌剂按照1:5的体积比与所述第二混合溶液混合均匀，随后于4℃下滴入浓度为25％的氯化钙饱和硼酸溶液，以包埋得到固态菌剂。
48.其中，菌群的富集方法具体如下：
49.s1：将2g胰蛋白胨、1g酵母提取物和2g氯化钠加入至200ml水中，用hcl调节ph至7，压力升至103.4kpa(1.05kg/cm2)，于121.3℃温度下维持30分钟以高温高压灭菌，配成细菌基础培养基；通过向细菌基础培养基中加入一定质量的重铬酸钾，制成含有50、100、150、200mg/l六价铬的含铬培养基；
50.s2：以40g:1l的比例向所述含铬培养基中添加电镀场地污染土壤(采集自张家口动力机械厂停产电镀车间)，于35℃和120rpm的条件下培养3天后取上清菌液，得到初始接种源；
51.s3：将所述初始接种源接种至含重金属的细菌基础培养基中，得到六种不同重金属浓度和含量的培养基，六种培养基具体如下：
52.第一培养基：含有六价铬50mg/l和镍30mg/l的细菌基础培养基；
53.第二培养基：含有六价铬50mg/l和镍40mg/l的细菌基础培养基；
54.第三培养基：含有六价铬50mg/l和镍50mg/l的细菌基础培养基；
55.第四培养基：含有六价铬50mg/l和铜50mg/l的细菌基础培养基；
56.第五培养基：含有六价铬50mg/l和铜75mg/l的细菌基础培养基；
57.第六培养基：含有六价铬50mg/l和铜100mg/l的细菌基础培养基；
58.随后在六种培养基中进行六价铬还原，至菌群具有还原六价铬的功能且50mg/l六价铬完全被还原，富集得到铬还原菌剂。
59.为了验证本实施例所得固态菌剂的效果，还进行了如下实验。
60.将所得固态菌剂投加到含有50mg/l六价铬的细菌基础培养基中，于35℃和120rpm的条件下进行反应，20h内可以将50mg/l六价铬完全还原，如图1所示，从图中可以看出，该固态菌剂具有六价铬的还原效果。
61.将所得固态菌剂投加到含有50、100、150、200mg/l六价铬的细菌基础培养基中，于35℃和120rpm的条件下进行反应，96h内可以将200mg/l六价铬完全还原，如图2所示，从图中可以看出，该菌剂对六价铬还原浓度范围比较广。
62.将所得固态菌剂投加到上述的第一至第六培养基中，观察在镍铜分别存在时六价
铬的还原速率，如图3所示，发现12h内，镍的存在对六价铬的还原速率无影响，铜的存在对六价铬的还原速率有促进作用。两者的存在均对六价铬的还原速率没有抑制作用，说明该固态菌剂具有在多种金属污染下的六价铬还原功能。
63.提取该固态菌剂的dna并扩增16srrna送至测序公司测序，测定该菌剂的组成成分，如图4和5所示。
64.将所得固态菌剂投加到实际污染土壤中(含1220mg/kg六价铬、30mg/kg镍、198mg/kg铜)中，并加入细菌培养液(土壤：细菌培养液＝1g:10ml)，35℃和120rpm的条件下进行反应，如图6所示。从图中可以看出，该固态菌剂7天时间完全将六价铬还原，说明该固态菌剂对于实际多种金属污染土壤有高效治理功能。
65.由此可见，本发明所制备的固态菌剂具有高效的铬还原效率，可以在24小时内完全还原50mg/l六价铬，同时可以在镍(30-50)mg/l、铜(50-100)mg/l的存在下不受影响地进行六价铬还原。用微生物去除环境中的六价铬具有成本低、有效期长、环境友好、效果稳定等优点，适合长时间的处理大量六价铬污染的环境。
66.以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
技术特征：1.一种可用于电镀污染场地修复的固态菌剂的制备方法，其特征在于，具体如下：将完全溶解的聚乙烯醇与海藻酸钠粉末混合均匀，得到第一混合溶液；向第一混合溶液中加入活性炭，得到第二混合溶液；将含有微杆菌属(microbacterium sp.)cr2203-1和赖氨酸芽胞杆菌(lysinibacillus sp.)cr2203-2的铬还原菌剂按照(1-2):10的体积比与所述第二混合溶液混合均匀，随后于0-4℃下滴入浓度为20-50％的氯化钙饱和硼酸溶液，以包埋得到固态菌剂；所述微杆菌属cr2203-1于2022年06月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no:m2022878；所述赖氨酸芽胞杆菌cr2203-2于2022年06月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no:m2022879。2.根据权利要求1所述的可用于电镀污染场地修复的固态菌剂的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯醇于70～80℃下以实现完全溶解。3.根据权利要求1所述的可用于电镀污染场地修复的固态菌剂的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯醇与海藻酸钠粉末的质量比为1:(1-5)。4.根据权利要求1所述的可用于电镀污染场地修复的固态菌剂的制备方法，其特征在于，所述第二混合溶液中的活性炭浓度为3-5g/l。5.根据权利要求1所述的可用于电镀污染场地修复的固态菌剂的制备方法，其特征在于，所述铬还原菌剂中微杆菌属cr2203-1的含量占比为3％～10.2％，赖氨酸芽胞杆菌cr2203-2的含量占比为62％～89.2％。6.根据权利要求1所述的可用于电镀污染场地修复的固态菌剂的制备方法，其特征在于，所述铬还原菌剂的制备方法如下：s1：将2g胰蛋白胨、1g酵母提取物和2g氯化钠加入至200ml水中，用hcl调节ph至7，压力升至103.4kpa，于121.3℃温度下维持15～30分钟以高温高压灭菌，配成细菌基础培养基；在所述细菌基础培养基中加入0.17-0.56g重铬酸钾，制成含有300-1000mg/l六价铬的含铬培养基；s2：以10-40g:1l的比例向所述含铬培养基中添加电镀场地污染土壤，于35℃和120rpm的条件下培养3天后取上清菌液，得到初始接种源；s3：将所述初始接种源接种至含有镍30-50mg/l、铜50-100mg/l和六价铬50-300mg/l的细菌基础培养基中进行六价铬还原，至菌群具有还原六价铬的功能且50-300mg/l六价铬完全被还原，富集得到铬还原菌剂。7.一种利用权利要求1～6任一所述制备方法得到的可用于电镀污染场地修复的固态菌剂。8.一种利用权利要求7所述固态菌剂在处理污染土壤中的应用，其特征在于，于35℃和120rpm的条件下，将含有50-300mg/l六价铬的污染土壤和固态菌剂加入细菌基础培养基中。9.一种利用权利要求7所述固态菌剂在处理污染土壤中的应用，其特征在于，于35℃和120rpm的条件下，将含有50-300mg/l六价铬、30-50mg/l镍或50-100mg/l铜的污染土壤和固态菌剂加入细菌基础培养基中。10.根据权利要求8或9所述固态菌剂在处理污染土壤中的应用，其特征在于，所述细菌基础培养基的制备方法如下：
将2g胰蛋白胨、1g酵母提取物和2g氯化钠加入至200ml水中，用hcl调节ph至7，压力升至103.4kpa，于121.3℃温度下维持15～30分钟以高温高压灭菌，配成细菌基础培养基。
技术总结本发明公开了一种用于电镀污染场地修复的固态菌剂及其方法与应用，属于微生物修复技术领域。固态菌剂的制备方法包括将聚乙烯醇与海藻酸钠粉末混合，加入活性炭，得到第二混合溶液；将含有微杆菌属(Microbacterium sp.)Cr2203-1和赖氨酸芽胞杆菌(Lysinibacillus sp.)Cr2203-2的铬还原菌剂与第二混合溶液混合均匀，随后于0-4℃下滴入浓度为20-50％的氯化钙饱和硼酸溶液，以包埋得到固态菌剂。本发明中的菌群具有高效的铬还原效率，可以在24小时内完全还原50mg/L六价铬，同时可以在镍(30-50)mg/L、铜(50-100)mg/L的存在下不受影响地进行六价铬还原。用微生物去除环境中的六价铬具有成本低、有效期长、环境友好、效果稳定等优点，适合长时间的处理大量六价铬污染的环境。适合长时间的处理大量六价铬污染的环境。适合长时间的处理大量六价铬污染的环境。
技术研发人员：赵和平 巩文静
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2022.06.24
技术公布日：2022/11/1
