一种测定血浆中shp099浓度的方法
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种药物的测定方法，特别涉及一种测定血浆(k2edta抗凝)中shp099浓度的方法。
背景技术：2.shp099是一种有效的shp2抑制剂，因其存在变构作用机制，使其在一个自抑制的构型中使shp2稳定而无法产生活性。其化学名称6-(4-氨基
ꢀ‑
4-甲基-1-哌啶基)-3-(2,3-二氯苯基)-2-吡嗪胺，分子式：c
16h19
cl2n5，分子量：352.3，其化学结构式为：
[0003][0004]
shp2为含src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶，是一个关键的信号节点和调节因子，通过ras通路促进癌细胞存活和生长，在癌细胞对靶向治疗产生耐药性的方式中发挥关键作用。过去几十年，它一直被认为是“不可成药”靶点。随着研究的深入发现了几种类型的小分子抑制剂。
[0005]
磷酸酶作为一种在多种细胞信号通路中发挥重要作用的蛋白，几十年来，科学家们在磷酸酶上已经花费了无数时间，却难以开发出以它们为靶标的药物。其中shp2(蛋白酪氨酸磷酸酶2)在许多癌症中都有涉及.
[0006]
shp2的全名叫做蛋白酪氨酸磷酸酶2，它与乳腺癌、白血病、肺癌、肝癌、胃癌、喉癌、口腔癌，以及其他多种癌症类型密切相关。shp2一般由egfr、fgfr2、her2和alk等酪氨酸激酶受体所驱动。这样的酪氨酸激酶受体有30％在人类的癌症细胞系中被改变。它们活化调节细胞生长和分化的mapk分析信号途径。
[0007]
shp2的重要性在一个大型的基因敲除实验中被发现。在一个或多个酪氨酸激酶受体有改变的细胞中shp2的降低让癌细胞几乎“残废”，也就是说癌细胞的生存依赖于shp2。
[0008]
shp2就像一个铰链一样工作。当它打开时才有活性，并且我们能够将其保持关闭。所以研究团队开始将目光投向shp2不同的构象，琢磨它的铰链结构。
[0009]
很快，研究团队意识到，活性位点只有在蛋白质被打开时才暴露出来。那么，是不是保持这个蛋白关闭就能让它沉默呢？于是他们设计了一个非常规的、多步骤的化学筛选来寻找候选物。而正是这样，导致了shp2“分子胶”的发现。
[0010]
通过晶体学和遗传突变实验，科学家们发现了一个化合物能够填补蛋白质靠近铰链处的一个孔，像胶水一样把所有东西“粘”起来。他们又将这种有类似药物特性的“分子胶”运用到包含酪氨酸激酶受体改变的人类肿瘤的模式小鼠身上，实验证明，癌细胞最终消失了。
[0011]
催化位点抑制剂，其原理是shp2作用底物酪氨酸磷酸酯，这一类抑制剂主要就含有模拟酪氨酸磷酸的离子官能团，来模拟作用底物作用于底物催化口袋，从而抑制酶的活性。虽然研究了十几年，但是还是没有达到很好体内治疗效果。因此催生出来变构位点抑制剂。首先诺华团队通过特殊的药物筛选方式获得首款变构位点抑制shp099。它做为先导化合物，后来再此基础上通过计算机辅助药物设计发现更多的变构抑制剂。
[0012]
shp099具有一个变构作用机制，它通过该机制在一个自抑制的构形中使shp2稳定。shp099还能抑制ras-erk信号作用，从而在人类癌细胞系中和小鼠肿瘤异种移植模型中抑制由rtk驱动的癌细胞扩增。
[0013]
作为一个拥有全新作用机理的化合物，开发一个简单快速的检测方法，对于新药研发，及其体内外研究，包括吸收，分布，代谢，排泄等具有重要作用。因此建立此方法对于加快新药研发速度具有积极意义。
技术实现要素：[0014]
本发明的目的是提供一种测定血浆(k2edta抗凝)中shp099浓度的方法，解决上述现有技术问题中的一个或者多个。
[0015]
本发明提供的一种测定血浆(k2edta抗凝)中shp099浓度的方法，包括如下步骤：采用蛋白沉淀的方法对血浆样品进行预处理，获得测试样品；将测试样品采用高效液相色谱-串联质谱进行定性定量分析；
[0016]
所述高效液相色谱-串联质谱的液相色谱条件包括：
[0017]
色谱柱：gl sciences，inertsustain，c18 hp，3μm，2.1
×
50mm(up)；
[0018]
色谱柱温：40℃；
[0019]
流动相a：体积比为100/0.01的h2o/1m ch3coonh4溶液；
[0020]
流动相b：体积比为100/1/0.01的meoh/acn/1m ch3coonh4溶液；
[0021]
洗液：体积比为85/15的meoh/acn溶液；
[0022]
自动进样器温度为4℃；
[0023]
梯度洗脱，流速为0.5ml/min，进样量为2μl，分析时间为3.601min。
[0024]
其中：待测物选用血浆(k2edta抗凝)。血浆是临床试验最常用的临床样品，易获得，且能准确地反映药物在体内的情况。
[0025]
在某些实施方案中，所述梯度洗脱的程序为：
[0026]
总时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0.1052480.7033671.4033371.411992.201992.2152483.605248
[0027]
其中：考虑流速、流动相和进样量以及梯度洗脱的条件，不仅可以保证药物的出峰效果和响应值，也可使药物完全洗脱干净，避免对色谱柱的污染，同时也有利于回收率的提
升和后续质谱检测的灵敏度的提升。
[0028]
本发明采用梯度洗脱的方式对血浆中的shp099进行检测，流动相的洗脱比例在不同时间进行变化，综合考虑血浆基质效应等问题，使得药物出峰峰型对称，不仅将药物充分洗脱下来，且回收率高，干扰性小。
[0029]
在某些实施方案中，所述高效液相色谱-串联质谱的质谱条件包括：
[0030]
离子源采用电喷雾离子源，喷雾电压为5500v，雾化温度为500℃，喷雾气压力为50psi，辅助加热气压力为50psi，气帘气压力为30psi，碰撞气压力为9psi，去簇电压为50ev；
[0031]
碰撞室入口电压为12ev；
[0032]
碰撞电压为35ev；
[0033]
碰撞室出口电压为12ev；
[0034]
正离子方式检测；
[0035]
扫描方式为多重反应检测；
[0036]
shp099用于定量分析的离子对为：m/z353.1
→
m/z268.1；定性分析的离子对为：m/z353.1
→
m/z336.0。
[0037]
其中：本发明方法的响应值合理，质谱参数合适，可持续检测。
[0038]
在某些实施方案中，所述血浆样品预处理步骤如下：
[0039]
s1、取出待测样品，平衡至室温；
[0040]
s2、将待测样品置于96深孔板中，加入meoh涡旋混合后离心；
[0041]
s3、取上侧清液至加有复溶液h2o/1m ch3coonh4的96深孔板中，涡旋混合，获得所述测试样品，h2o和1m ch3coonh4的体积比为100/0.5。
[0042]
在某些实施方案中，步骤s2中涡旋混合时间为2min；离心条件为：4℃， 2600g，10min。
[0043]
在某些实施方案中，步骤s3中涡旋混合时间为2min。
[0044]
在某些实施方案中，将所述测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中shp099的色谱峰，并据此计算所述血浆样品中的shp099 浓度。
[0045]
在某些实施方案中，以shp099的峰面积带入标准曲线方程计算所述血浆样品中的shp099的浓度。
[0046]
在某些实施方案中，所述标准曲线方程的建立包括以下步骤：
[0047]
取190μl空白血浆8份置于1.5ml离心管中，以储备液的形式添加 10μl浓度分别为20.0ng/ml、40.0ng/ml、160ng/ml、400ng/ml、1200 ng/ml、4000ng/ml、16000ng/ml、20000ng/ml的shp099溶液至标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、标样8中，分别取标样 1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、标样8、零浓度样本 50μl于96深孔板中，加入200μl的meoh涡旋混合2min，于4℃以2600 g离心10min.，取上层清液100μl至加有100μl复溶液h2o/1m ch3coonh4的96深孔板中，涡旋混合2min，作为测试样品待检测，h2o 和1m ch3coonh4的体积比为100/0.5；
[0048]
分别取2μl测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中shp099的色谱峰，并据此得到标准曲线，以用于计算所述血浆中的shp099 的浓度。
[0049]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0050]
(1)预处理方法简便，一步有机溶剂蛋白沉淀，适用于常规测定；
[0051]
(2)专属性强：在本实验所采用的色谱条件下，shp099保留时间为 1.190min左右，shp099的峰型良好；
[0052]
(3)灵敏度高：血浆最低定量限为1.00ng/ml，能准确测定血浆中 shp099的浓度，灵敏度高，特异性强；
[0053]
(4)本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为shp099的血药浓度测定提供依据。本方法的血浆标准曲线线性范围为1.00-1000ng/ml，批内和批间精密度rsd小于
±
15％。
附图说明
[0054]
图1为本发明hplc-ms/ms法测得的shp099在人血浆中的标准曲线；
[0055]
图2为本发明人空白血浆加入shp099的hplc-ms/ms图。
[0056]
图3为本发明人空白血浆的hplc-ms/ms图；
具体实施方式
[0057]
下面通过实施方式对本发明进行进一步详细的说明。
[0058]
实施例1实验材料与分析设备
[0059]
shp099(分析物)：glpbio或相同、更高等级的标准品
[0060]
使用试剂见下表1：
[0061]
表1试剂明细
[0062]
试剂名称级别制造商meohhplcfisher chemical乙腈hplcadamas-beta醋酸铵acssigma-aldrichdmsohplcadamas-beta
[0063]
注：亦可使用相同级别或更高级别的试剂
[0064]
使用分析设备见下表2：
[0065]
表2使用设备明细
[0066]
组件种类制造商binary pump(二元泵)ad pumpshimadzudegasser(脱气器)degassershimadzucolumn oven(恒温柱箱)ad column ovenshimadzuautosampler(自动取样器)ac autosamplershimadzusample rack(样本架)rack changershimadzumass spectrometer(质谱仪)triple quad 6500+sciexdata processor(数据处理器)analyst(software)sciex
[0067]
相同的lc-ms/ms系统亦可被使用。
[0068]
实施例2液相条件
[0069]
1、液相色谱条件
[0070]
色谱柱：gl sciences，inertsustain,，c18 hp，3μm，2.1
×
50mm(up)；色谱柱温：40℃；流动相a：h2o/1m ch3coonh4＝100/0.01；流动相b： meoh/acn/1m ch3coonh4＝100/1/0.01；洗液：meoh/acn＝85/15；自动进样器温度为4℃；梯度洗脱，流速为0.5ml/min，进样量为2μl，分析时间为3.601min；
[0071]
表3梯度洗脱程序
[0072]
总时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0.1052480.7033671.4033371.411992.201992.2152483.605248
[0073]
2、质谱条件
[0074]
离子源采用电喷雾离子源，喷雾电压为5500v，雾化温度为500℃，喷雾气压力为50psi，辅助加热气压力为50psi，气帘气压力为30psi，碰撞气压力为9psi，去簇电压为50ev；碰撞室入口电压为12ev；碰撞电压为35ev；碰撞室出口电压为12ev；正离子方式检测；扫描方式为多重反应检测；
[0075]
shp099用于定量分析的离子对为：m/z353.1
→
m/z268.1；定性分析的离子对为：m/z353.1
→
m/z336.0。
[0076]
实施例3试验过程
[0077]
1、shp099标准溶液的配制
[0078]
shp099标准溶液的配制：精密称取shp099(分析物)1mg，dmso 溶解至1.00mg/ml，50％乙腈水溶液溶依次稀释配制shp099标准溶液，具体稀释浓度见下表4：
[0079]
表4 shp099标准溶液配制浓度
[0080]
来源溶液(ng/ml)来源溶液体积(μl)溶剂体积(μl)最终浓度(ng/ml)10000004019602000010000004829521600016000500150040001600015018501200160005019504004000801920160400020198040.0400100190020.0
[0081]
shp099标准溶液于不使用时储存于棕色玻璃容器及冰箱(-20℃)保存，体积可视需要依比例增加或减少。
[0082]
2、线性试验
[0083]
将空白血浆于室温环境放入水浴解冻；转移190μl的空白血浆10份至96深孔板中(每一个标准曲线样本、空白样本-00及零浓度样本-0)，依下表5所列，分别精密加入不同浓
度的shp099标准溶液10μl或稀释溶液配制每一个样本并混匀，配成不同浓度的含药血浆，按“血浆样品预处理”操作。以峰面积值y对血药浓度x作回归计算，结果见图1和表6。以y 对血药浓度x做回归计算，得回归方程y＝6877x+754，相关系数(r)为0.9968，拟合度(r2)为0.99361024。权重系数w＝1/x2，按该方法测得的 shp099的血药浓度的最低定量限为：1.00ng/ml，定量下限代表性图谱见图2。
[0084]
表5 shp099标准曲线配制浓度
[0085][0086]
a：分析物的稀释溶液：50％乙腈水溶液
[0087]
表6 hplc-ms/ms法测得的shp099在人血浆中的标准曲线(n＝5)
[0088][0089]
实施例4准确度和精密度
[0090]
将空白血浆于室温环境放入水浴解冻；转移适当体积的空白血浆至适当的容器并添加shp099标准溶液制备5种不同浓度的含药血浆质控样品 (lloq qc、lqc、gmqc、mqc、hqc)及一条随行标准曲线，按“血浆样品预处理”操作，质控样品制备如下表7所示。每天做一批及一条随行标准曲线，连续做3天，共3批，第一批、第二批和第三批每个浓度分别做6份
样品，计算shp099峰面积，代入当天的标准曲线中求得实测浓度，由实测浓度计算批内与批间精密度，实测浓度与理论浓度的比值即为准确度，结果见表8。shp099血浆样品批间、批内精密度、准确度在
±
15％之间符合要求。
[0091]
表7质控样品配制浓度
[0092][0093]
依每一分析批所需，分装足够的体积至已标示的样本瓶瓶中并储存于理论温度-20℃。体积可视需要依比例增加或减少。
[0094]
表8 hplc-ms/ms法测定血浆中shp099的批内、批间精度和准确度
[0095]
[0096][0097][0098]
实施例5干扰性
[0099]
将6个不同来源的空白血浆样品，3个不同来源的高脂血浆和3个不同来源的溶血
血浆用于同一分析批依样本制备步骤制备及分析，来评价不同空白血浆对shp099分析物的干扰。
[0100]
12个不同来源空白血浆样本制备分析后，在符合shp099保留时间处的干扰峰响应均低于该分析批的标准曲线中定量下限样本的shp099响应的20.0％，结果见表9，空白血浆代表性图谱见图3。结果表明该分析方法对shp099的分析具有专属性。
[0101]
表9 12个不同来源空白血浆对shp099分析物的干扰性数据对比表
[0102][0103]
从表9中可以看出，不同人体的空白血浆对shp099的检测结果没有造成干扰。因此，该方法可以用于检测不同人体血浆中的shp099浓度。
[0104]
实施例6回收率
[0105]
将使用混合血浆配制的lqc、mqc和hqc来计算分析物的回收率。对于lqc、mqc和hqc的各6个平行样品和18个db进行提取。db提取后加入分析物，使它们在提取后加入的db提取物中的浓度与提取的 lqc、mqc和hqc样品相同。通过比较来自于qc的分析物和内标的峰面积与db提取后加入的分析物和内标的平均峰面积来计算提取回收率，结果见表10，在分析物的每个浓度水平，分析物峰面积的％cv和总体％cv 均在
±
15.0％之间，回收率为103.4％，表明使用该前处理方法shp099的提取回收率高。
[0106]
表10 shp099分析物的提取回收率
[0107][0108]
实施例7基质效应
[0109]
处理来自至少6个不同来源的空白基质样品。在提取db后加入分析物，确保它们在处理后db中的浓度(每个浓度每个来源1个样品)与处理后的lqc、mqc和hqc样品浓度相同；准备包含分析物的溶液，使最终浓度与处理后的lqc、mqc和hqc样品浓度相同，每个浓度6个平行，结果见表11，分析物峰面积比％cv均在
±
15％之间，表明不存在基质效应问题。
[0110]
表11 shp099分析物的基质效应
[0111][0112]
综上所述：本发明提供了一种预处理方法简便的血浆中shp099浓度的测定方法，采用一步有机溶剂沉淀法，适用于常规测定；同时，在本实验所采用的色谱条件下，shp099保留时间为1.190min左右，峰形良好，无杂峰干扰测定，基线平稳；本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中shp099的浓度，灵敏度较高，血浆最低定量限为1.00ng/ml；同时，本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为shp099的血药浓度测定提供依据。本方法的血浆标准曲线线性范围20.0～20000ng/ml，批内和批间精密度rsd在
±
15％之间，分析物提取回收率高且不存在基质效应。
[0113]
以上表述仅为本发明的优选方式，应当指出，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些也应视为发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种测定血浆(k2edta抗凝)中shp099浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用蛋白沉淀的方法对血浆样品进行预处理，获得测试样品；将测试样品采用高效液相色谱-串联质谱进行定性定量分析；所述高效液相色谱-串联质谱的液相色谱条件包括：色谱柱：gl sciences，inertsustain，c18 hp，3μm，2.1
×
50mm(up)；色谱柱温：40℃；流动相a：体积比为100/0.01的h2o/1m ch3coonh4溶液；流动相b：体积比为100/1/0.01的meoh/acn/1m ch3coonh4溶液；洗液：体积比为85/15的meoh/acn溶液；自动进样器温度为4℃；梯度洗脱，流速为0.5ml/min，进样量为2μl，分析时间为3.601min。2.根据权利要求1所述的一种测定血浆(k2edta抗凝)中shp099浓度的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：总时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0.1052480.7033671.4033371.411992.201992.2152483.6052483.根据权利要求1所述的一种测定血浆(k2edta抗凝)中shp099浓度的方法，其特征在于，所述高效液相色谱-串联质谱的质谱条件包括：离子源采用电喷雾离子源，喷雾电压为5500v，雾化温度为500℃，喷雾气压力为50psi，辅助加热气压力为50psi，气帘气压力为30psi，碰撞气压力为9psi，去簇电压为50ev；碰撞室入口电压为12ev；碰撞电压为35ev；碰撞室出口电压为12ev；正离子方式检测；扫描方式为多重反应检测；shp099用于定量分析的离子对为：m/z353.1
→
m/z268.1；定性分析的离子对为：m/z353.1
→
m/z336.0。4.根据权利要求1所述的一种测定血浆(k2edta抗凝)中shp099浓度的方法，其特征在于，所述血浆样品预处理步骤如下：s1、取出待测样品，平衡至室温；s2、将待测样品置于96深孔板中，加入meoh涡旋混合后离心；s3、取上侧清液至加有复溶液h2o/1m ch3coonh4的96深孔板中，涡旋混合，获得所述测试样品，h2o和1m ch3coonh4的体积比为100/0.5。5.根据权利要求4所述的一种测定血浆(k2edta抗凝)中shp099浓度的方法，其特征在
于，步骤s2中涡旋混合时间为2min；离心条件为：4℃，2600g，10min。6.根据权利要求4所述的一种测定血浆(k2edta抗凝)中shp099浓度的方法，其特征在于，步骤s3中涡旋混合时间为2min。7.根据权利要求1所述的一种测定血浆(k2edta抗凝)中shp099浓度的方法，其特征在于，将所述测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中shp099的色谱峰，并据此计算所述血浆样品中的shp099浓度。8.根据权利要求7所述的一种测定血浆(k2edta抗凝)中shp099浓度的方法，其特征在于，以shp099的峰面积带入标准曲线方程计算所述血浆样品中的shp099的浓度。9.根据权利要求8所述的一种测定血浆(k2edta抗凝)中shp099浓度的方法，其特征在于，所述标准曲线方程的建立包括以下步骤：取190μl空白血浆8份置于1.5ml离心管中，以储备液的形式添加10μl浓度分别为20.0ng/ml、40.0ng/ml、160ng/ml、400ng/ml、1200ng/ml、4000ng/ml、16000ng/ml、20000ng/ml的shp099溶液至标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、标样8中，分别取标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、标样8、零浓度样本50μl于96深孔板中，加入200μl的meoh涡旋混合2min，于4℃以2600g离心10min.，取上层清液100μl至加有100μl复溶液h2o/1mch3coonh4的96深孔板中，涡旋混合2min，作为测试样品待检测，h2o和1m ch3coonh4的体积比为100/0.5；分别取2μl测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中shp099的色谱峰，并据此得到标准曲线，以用于计算所述血浆中的shp099的浓度。
技术总结本发明公开了一种测定血浆(K2EDTA抗凝)中SHP099浓度的方法，包括如下步骤：采用蛋白沉淀的方法对血浆样品进行预处理，获得测试样品；将测试样品采用高效液相色谱-串联质谱进行定性定量分析；所述高效液相色谱-串联质谱的液相色谱条件包括：色谱柱：GL Sciences，InertSustain,C18HP，3μm，2.1
技术研发人员：黄启宽 祝永琴 胡海俊 金莹莹
受保护的技术使用者：上海精翰生物科技有限公司
技术研发日：2022.07.25
技术公布日：2022/11/1
