1.本发明涉及粮食储藏技术、农业昆虫与害虫防治领域，具体涉及一种储粮害 虫赤拟谷盗高抗性种群地理区系的鉴定方法。
背景技术：2.储粮害虫是造成粮食数量和质量损失重要生物因素之一。粮食仓储稳定环境 和食物充足为其生长繁殖提供理想温床。对储粮害虫的防治方法包含物理防治、 化学防治、生物防治和生态防治。在深入开展储粮害虫生物学、基因遗传、抗性 机理解析、新型药剂杀虫机制等科学研究中，常常难以保障所用供试昆虫遗传信 息的单一来源、遗传稳定，尤其是不同地理区系的试虫相互污染问题，给生物防 治工作和科学研究带来极大阻碍，急需建立储粮害虫高抗性种群地理区系的判别 方法。
技术实现要素：3.本发明的目的是提供一种储粮害虫赤拟谷盗高抗性种群地理区系的鉴定方 法，具备方法简便、精准、高效的特点。
4.本发明的目的采用如下技术方案实现：
5.一种储粮害虫赤拟谷盗高抗性种群地理区系的鉴定方法，通过检测二氢硫辛 酰胺脱氢酶的氨基酸或者核苷酸序列鉴定储粮害虫赤拟谷盗高抗性种群地理区 系。
6.在本发明中，若seq id no:1所示的二氢硫辛酰胺脱氢酶的氨基酸序列中 第45位、131位、167位氨基酸依次被替换为丝氨酸、甘氨酸和缬氨酸，则对应 的试虫为赤拟谷盗高抗性种群美国区系；若seq id no:1所示的二氢硫辛酰胺 脱氢酶的氨基酸序列中第45位、131位、167位氨基酸依次被替换为丝氨酸、丝 氨酸和缬氨酸，则对应的试虫为赤拟谷盗高抗性种群澳大利亚区系；若seq idno:1所示的二氢硫辛酰胺脱氢酶的氨基酸序列中第45位、131位、167位氨基 酸依次被替换为丝氨酸、天冬氨酸和丙氨酸，则对应的试虫为赤拟谷盗高抗性种 群巴西区系；若seq id no:1所示的二氢硫辛酰胺脱氢酶的氨基酸序列中第4 5位、131位、167位氨基酸依次被替换为丝氨酸、天冬氨酸和缬氨酸，则对应 的试虫为赤拟谷盗高抗性种群中国区系。
7.在本发明中，采用反转录pcr方法扩增待测高抗性赤拟谷盗的二氢硫辛酰胺 脱氢酶基因序列并测序，得到对应的氨基酸序列。
8.在本发明中，反转录pcr方法包括如下步骤：(1)合成cdna第一链；(2) 以所述cdna第一链为模板，pcr扩增二氢硫辛酰胺脱氢酶基因。
9.在本发明中，反转录pcr方法中的引物包括tc-f和tc-r；tc-f的序列为： cggaaaaaaatgggcagc；tc-r的序列为：caccgggaggtcatcata。
10.本发明的有益效果在于：本发明确定的二氢硫辛酰胺脱氢酶(ec1.8.1.4)目 标位点氨基酸可以作为储粮害虫种群不同地理区系的判别，为区分储粮害虫高抗 性种群地理区系提供必要数据和方法，该方法简便、精准、高效。
11.图1赤拟谷盗的总rna琼脂凝胶电泳图，其中a1、a2为美国采集试虫种群， a3、a4为澳大利亚采集试虫种群，a5、a6为巴西采集试虫种群，a7、a8为中 国采集试虫种群。
附图说明
12.图1赤拟谷盗的总rna琼脂凝胶电泳图，其中a1、a2为美国采集试虫种 群，a3、a4为澳大利亚采集试虫种群，a5、a6为巴西采集试虫种群，a7、a8 为中国采集试虫种群。
具体实施方式
13.以下实施例用于进一步说明本发明，但是不应该理解为是对本发明的限制， 在不违背本发明实质和精神的前提下，任何对本发明所做的优化和替换，均属于 本发明范畴。若未特别声明，下列实施例种涉及的技术手段均为本科学领域技术人员普遍 使用的常规技术。
14.实施例1
15.一.试虫的种属鉴定和抗性检测
16.将收集到的来源于美国、澳大利亚、巴西和中国的52份试虫(表1)进行 种属鉴定和抗性检测。
17.(1)种属鉴定
18.上述52份试虫按照gb/t 37719.1-2019《粮油储藏储粮害虫检验辅助图谱 第1部分：拟步甲科》进行形态鉴定，确定为赤拟谷盗。
19.(2)抗性测定
20.采用联合国粮食及农业组织(以下简称fao)推荐的排水法装置 (anonymous.recommended methods for the detection and measurement ofresistance of agricultural pests to pesticides.teantative method for adults of somemajor pest species of stored cereals,with methyl bromide and phosphine[j].faoplant protection bulletin,1975,23:12-25.)测定试虫抗性。ph3气体由磷化锌与10％ 的硫酸参与反应制得。采用fao推荐的储粮害虫磷化氢抗性测定的方法。每个 熏蒸瓶挑选50头成虫，用高真空硅脂玻璃旋塞密封，浓度设置在有效浓度区间， 使用相应量程的气密性注射器抽取磷化氢气体，从橡胶塞中将气体注入瓶内，置 于(30
±
1)℃、rh 75％
±
5％、无光照的恒温恒湿培养箱中密闭熏蒸约20h。再 按照熏蒸瓶的容积与注入的磷化氢气体体积，计算出磷化氢的浓度。每个浓度设 置3个重复组，并注射相同体积的空气组成对照。待熏蒸时间结束，在通风橱中 将熏蒸瓶的玻璃旋塞打开，放置大约1h使气体充分散尽后将试虫从熏蒸瓶中取 出，并且将赤拟谷盗放入饲料充足的培养箱中观察14d，分别用毛笔轻触碰虫体 尾部，四肢不动的成虫视为死亡试虫，记录每组浓度试虫的死亡率，并根据抗性 计算公式计算赤拟谷盗抗性系数(王晶磊,王殿轩,肖雅斌,等.辽宁地区储粮害 虫对磷化氢抗性测定及对策研究[j].粮食与饲料工业,2014(9):16-18+23.)。抗性 系数rf介于50～160判定为高抗性种群。
[0021]
结果见表1。可以看到，51份试虫为赤拟谷盗磷化氢高抗性种群，1份试虫 为赤拟谷盗磷化氢无抗性种群。
[0022]
表1赤拟谷盗高抗性测定结果
[0023]
[0024][0025]
二、对表1中52份试虫采用二氢硫辛酰胺脱氢酶(ec1.8.1.4)鉴定赤拟谷 盗高抗性种群地理区系
[0026]
1、试虫总rna提取
[0027]
采用trizol试剂提取法试剂盒(购自vazyme，南京)，分别提取表1中52 份试虫的总rna，具体操作步骤如下：
[0028]
(1)配制浓度为75％的乙醇水溶液作为备用，并用其擦拭移液枪和超净工作台， 以达到消毒效果；
[0029]
(2)将-80℃冻存好的试虫放入1.5ml无菌离心管中，做好标记，每个离心管 均加入500μl rna-easy试剂，用组织研磨仪(30hz，5min)研磨至匀浆状；
[0030]
(3)取出离心管，加入200μlrnase-freewater，盖紧离心管，剧烈震荡15s后，室温下静置5min；
[0031]
(4)室温，12000
×
g条件下离心15min；
[0032]
(5)取出离心管，吸取500μl上清液于新的离心管中，再加入500μl异丙醇，混合均匀，室温下静置10min；
[0033]
(6)室温，12000
×
g条件下离心10min，此时试管壁通常可见白色胶状沉淀；
[0034]
(7)取出离心管，弃上清液，加入500μl75％乙醇水溶液混匀，上下翻转数次，充分洗涤管盖和管壁，并轻弹管底，使沉淀物悬浮，并在室温，8000
×
g条件下离心3min；
[0035]
(8)重复步骤(7)；
[0036]
(9)取出离心管，弃上清液，打开离心管盖，置于超净工作台中，干燥5～10min；
[0037]
(10)加入30μlrnase-freewater，使用移液枪吹打rna沉淀使其加速溶解，并将所得的rna溶液置于-80℃超低温冰箱中保存备用。
[0038]
2、琼脂糖凝胶电泳检测
[0039]
(1)制胶：称量0.30g琼脂糖和30ml的1
×
tae稀释缓冲液，倒入锥形瓶中，摇匀后放入微波炉中加热1min，待其冷却至50℃左右，加入2μleb核酸染料，摇匀后倒入制胶板并插上孔梳，待凝胶完全凝固后，即完成1％的琼脂糖凝胶的制备；
[0040]
(2)加样：将凝胶置于电泳槽内，倒入1
×
tae稀释缓冲液，使其没过凝胶表面。以6
×
loadingbuffer为缓冲液配制6μl的样品溶液，打入点样孔中；
[0041]
(3)电泳：调节电泳仪电压至150v，10min后切段电源；
[0042]
(4)成像：将凝胶取出，放入凝胶成像仪进行成像观察。
[0043]
各来源的试虫总rna的电泳图如图1。实验结果显示，试虫rna条带清晰明亮，未发现弥散降解现象，经核酸浓度测定仪测定，rna的od260/od280均在1.8～2.2范围内，表明rna完整性良好且纯度较高，无降解现象，可作为合成cdna模板，进行后续试验。
[0044]
3、cdna第一链的合成
[0045]
以上述提取的各试虫rna为模板，采用南京vazyme公司的ii1ststrandcdnasynthesiskit(+gdnawiper)试剂盒进行cdna第一链的合成。按照试剂盒说明书进行操作，具体如下：
[0046]
(1)rna模板变性处理，在rnase-free离心管中按照表2配制混合液。
[0047]
表2rna模板变性处理混合液配制
[0048]
试剂添加量4
×
gdna wiper mix4μloligo(dt)
23
vn(50μm)1μlrandom hexamers(50ng/μl)1μl总rna10pg-5μgrnase-free ddh2oto16μl
[0049]
(2)用移液枪轻轻吹打混匀，42℃金属浴中孵育2min；
[0050]
(3)配制第一链cdna合成反应液，具体按照表3进行。
[0051]
表3第一链cdna合成反应液配制
[0052]
试剂添加量步骤(2)所得混合液16μl10
×
rt mix2μlhiscript
ⅱꢀ
enzyme mix2μl
[0053]
(4)用移液枪轻轻吹打混匀；
[0054]
(5)按表4中条件进行第一链cdna的合成反应。
[0055]
表4第一链cdna合成反应条件
[0056]
温度时间50℃15min85℃2min
[0057]
(6)将合成cdna置于-20℃冰箱保存备用。
[0058]
4、pcr扩增及产物纯化
[0059]
pcr反应使用2
×
taq master mix dna扩增酶系统(购自vazyme，南京)， 参照表5在200μl的无酶pcr管中配制25μl的反应体系，使用的pcr引物为： tc-f(seq id no:2)和tc-r(seq id no:3)。其中tc-f的序列为：cggaa aaaaatgggcagc)和tc-r的序列为：caccgggaggtcatcata。
[0060]
表5 pcr反应体系
[0061]
试剂体积cdna2μlrnase free water8.5μltaq pcr master mix12.5μltc-f1μltc-r1μl
[0062]
按照表6中的条件进行pcr扩增。
[0063]
表6 pcr反应条件
[0064][0065]
采用sv gel and pcr clean-up试剂盒(promega，美国)进行pcr 产物的纯化。
[0066]
5、基因测序
[0067]
上述扩增基因的测序由abi 3700 dna测序仪(abi，美国)完成。序号 为52的试虫，属于中国的赤拟谷盗无抗性种群，其二氢硫辛酰胺脱氢酶(ec1. 8.1.4)的氨基酸序列(seq id no:1)与gendbank登陆号为np_001280524. 1的序列同源性为100％。与seq id no:1所示的二氢硫辛酰胺脱氢酶(ec1.8. 1.4)氨基酸序列相比，其他来源的赤拟谷盗高抗性种群的二氢硫辛酰胺脱氢酶 不同之处仅在于第45位、131位、167位氨基酸(表7)，具体如下：
[0068]
(1)赤拟谷盗高抗性种群美国区系，其二氢硫辛酰胺脱氢酶第45位、131位、 167位
氨基酸依次为丝氨酸、甘氨酸和缬氨酸；
[0069]
(2)赤拟谷盗高抗性种群澳大利亚区系，其二氢硫辛酰胺脱氢酶第45位、131 位、167位氨基酸依次为丝氨酸、丝氨酸和缬氨酸；
[0070]
(3)赤拟谷盗高抗性种群巴西区系，其二氢硫辛酰胺脱氢酶第45位、131位、 167位氨基酸依次为丝氨酸、天冬氨酸和丙氨酸；
[0071]
(4)赤拟谷盗高抗性种群中国区系，其二氢硫辛酰胺脱氢酶第45位、131位、 167位氨基酸依次为丝氨酸、天冬氨酸和缬氨酸；
[0072]
表7储粮害虫赤拟谷盗高抗性种群地理区系判别
[0073][0074]
实施例2
[0075]
从国家粮食局科学研究院、河南工业大学、国家粮食储备局成都粮食储藏科 学研究所等实验室保藏的赤拟谷盗高抗性种群各选取3组作为试虫(表8)，按 照实施例1中方法检测其种属和抗性，采用二氢硫辛酰胺脱氢酶(ec1.8.1.4) 鉴定赤拟谷盗高抗性种群地理区系的方法进行检测。测定结果显示，表8中试虫 均为赤拟谷盗高抗性种群，通过测定其二氢硫辛酰胺脱氢酶基因序列，分析氨基 酸序列。与seq id no:1所示的二氢硫辛酰胺脱氢酶相比，其他赤拟谷盗高抗性 种群的二氢硫辛酰胺脱氢酶不同之处仅在于第45位、131位、167位氨基酸：赤 拟谷盗种群美国区系，其二氢硫辛酰胺脱氢酶第45位、131位、167位氨基酸依 次为丝氨酸、甘氨酸和缬氨酸；赤拟谷盗种群澳大利亚区系，其二氢硫辛酰胺脱 氢酶第45位、131位、167位氨基酸依次为丝氨酸、丝氨酸和缬氨酸；赤拟谷盗 种群巴西区系，其二氢硫辛酰胺脱氢酶第45位、131位、167位氨基酸依次为丝 氨酸、天冬氨酸和丙氨酸；赤拟谷盗种群中国区系，其二氢硫辛酰胺脱氢酶第 45位、131位、167位氨基酸依次为丝氨酸、天冬氨酸和缬氨酸。通过比较，采 用二氢硫辛酰胺脱氢酶(ec1.8.1.4)鉴定得到的赤拟谷盗高抗性种群地理区系 与其原始来源(采集地)相符，因此该方法是准确的。
[0076]
表8储粮害虫赤拟谷盗高抗性种群地理区系验证
[0077]
技术特征：1.一种储粮害虫赤拟谷盗高抗性种群地理区系的鉴定方法，其特征在于，通过检测二氢硫辛酰胺脱氢酶的氨基酸或者核苷酸序列鉴定储粮害虫赤拟谷盗高抗性种群地理区系。2.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于，若seq id no:1所示的二氢硫辛酰胺脱氢酶的氨基酸序列中第45位、131位、167位氨基酸依次被替换为丝氨酸、甘氨酸和缬氨酸，则对应的试虫为赤拟谷盗高抗性种群美国区系；若seq id no:1所示的二氢硫辛酰胺脱氢酶的氨基酸序列中第45位、131位、167位氨基酸依次被替换为丝氨酸、丝氨酸和缬氨酸，则对应的试虫为赤拟谷盗高抗性种群澳大利亚区系；若seq id no:1所示的二氢硫辛酰胺脱氢酶的氨基酸序列中第45位、131位、167位氨基酸依次被替换为丝氨酸、天冬氨酸和丙氨酸，则对应的试虫为赤拟谷盗高抗性种群巴西区系；若seq id no:1所示的二氢硫辛酰胺脱氢酶的氨基酸序列中第45位、131位、167位氨基酸依次被替换为丝氨酸、天冬氨酸和缬氨酸，则对应的试虫为赤拟谷盗高抗性种群中国区系。3.根据权利要求2所述方法，其特征在于采用反转录pcr方法扩增待测高抗性赤拟谷盗的二氢硫辛酰胺脱氢酶基因序列并测序，得到对应的氨基酸序列。4.根据权利要求3所述方法，其特征在于反转录pcr方法包括如下步骤：（1）合成cdna第一链；（2）以所述cdna第一链为模板，pcr扩增二氢硫辛酰胺脱氢酶基因。5.根据权利要求4所述方法，其特征在于反转录pcr方法中的引物包括tc-f和tc-r；tc-f的序列为：cggaaaaaaatgggcagc；tc-r的序列为：caccgggaggtcatcata。
技术总结本发明提供一种储粮害虫赤拟谷盗高抗性种群地理区系的鉴定方法，涉及粮食储藏技术、农业昆虫与害虫防治领域。该鉴定方法，通过检测二氢硫辛酰胺脱氢酶的氨基酸或者核苷酸序列鉴定储粮害虫赤拟谷盗高抗性种群地理区系。本发明鉴定方法，具备方法简便、精准、高效的特点。点。点。
技术研发人员：孙晟源 富瑶瑶 张鑫 肖雅予 马廷娇 姚堃 吴凡 沐雨欣
受保护的技术使用者：南京财经大学
技术研发日：2022.05.30
技术公布日：2022/11/1
