1.本发明涉及根系分泌物
技术领域：
：，具体为植物芳香有机酸(aoas)对多环芳烃(pahs)的共代谢降解及其分子响应机制。
背景技术：
：：2.pahs是分子中含有两个或两个以上稠合苯环结构的芳香化合物，具有强烈的“三致”毒性。随着城市化和工业的快速发展，燃煤、石油和天然气等各种矿物燃料的使用日益增加，而当中的有机物质在不完全燃烧或其他还原条件下生成pahs。此类污染物主要通过土壤、水体和空气三种途径进入自然环境中，从而直接或间接地对微生物群落、动植物和人类造成危害。3.常见的pahs修复技术包括物理修复技术、化学修复技术、生物修复技术和共代谢修复技术等，针对因由pahs而造成污染难以有效修复的问题，传统共代谢底物存在特异性差、易导致二次污染等问题。本研究拟使用aoas作为pahs的共代谢底物，植物所产生的根系分泌物含有aoas且能够被微生物直接利用(天然碳源)，并具有与目标污染物相似的苯环结构(特异性强)。一方面aoas对促进微生物的生长代谢起促进作用，使微生物活性增强、生长加快，从而增加促使微生物的生物量积累增加；另一方面，具有特定功能结构的aoas根系分泌物可通过诱导特异性降解酶的生长，来增强环境中pahs的降解和矿化作用。4.本研究旨在构建aoas-pahs共代谢体系，研究该体系中pahs的共代谢降解规律及微生物响应机制。据此，拟以植物天然分泌单位主要活性成分对羟基苯甲酸(pha)、对香豆酸(pca)、咖啡酸(ca)、阿魏酸(fa)作为代表性aoas，以环境中常见菲作为pahs目标污染物，开展以下两个方面的研究：5.(1)aoas-微生物协同作用下pahs的降解规律：6.实验采取pahs污染水体作为研究环境，以四种不同化学结构的aoas作为研究对象，比较不同功能结构aoas在水体中pahs的降解效果。通过分析pahs降解去除速率与相关微生物群落状况，阐明aoas-微生物协同作用下pahs的降解规律。7.(2)aoas-pahs交互影响下微生物的响应机制：8.结合高通量测序和生物信息学分析技术，分析不同生长阶段微生物生物膜的形成特征，以及微生物优势菌和pahs降解功能菌的群落结构和丰度，综合aoas功能结构、pahs降解途径、微生物群落结构三者之间的映射关系，揭示微生物对aoas-pahs共代谢过程的响应机制。技术实现要素：9.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：植物芳香有机酸对多环芳烃的共代谢降解及分子响应机制，包括以下步骤：10.s1：实验设计：实验所采用的芦苇幼苗购置于当地市场，选取大小、鲜重、根长相似的芦苇作为实验对象；11.s2：样品采集与预处理：实验装置开始运行后在十天内每天连续采集不同处理组水样(n＝10)；每次采集5ml水样用作cod、nh4-n、pahs浓度实验分析，采样后立刻添加等量灭菌的hoagland营养液作为补充；12.s3：分析方法：13.1)：化学需氧量：cod使用水质分析仪(ycnpn-4h，jinzhuang，上海)测定分析，水质分析仪需要根据实际水样cod范围配置量程合适的cod试剂一和试剂三；其配置方法如下：14.a：试剂一：在200ml烧杯中加入90ml蒸馏水，再不断搅拌下沿杯壁加入10ml浓硫酸(实验分析纯)，再将cod试剂一粉包倒入溶解，冷却后装入试剂瓶中备用；15.b：试剂三：取整包cod试剂三置于500ml细口棕色瓶中，加入400ml浓硫酸(实验分析纯)，放置于暗处溶解，备用；16.水样的测定分析：将水样中的cod浓度稀释10倍后，取2ml于试管中并依次加入0.5ml试剂一和2ml试剂三，然后上机检测，分析测定结果换算回稀释前浓度即为水样中cod的浓度；17.2)：氨氮：水体中的nh4-n亦是使用水质分析仪进行测定分析；根据水样nh4-n的范围，取0.5ml水样并补加4.5ml蒸馏水于试管中，依次加入0.1mlnh4-n试剂一和0.15mlnh4-n试剂二，加盖摇匀后静置10分钟待其显色，然后上机检测，上机测定结果即为水样中nh4-n的浓度；18.3)：多环芳烃：19.采用高效液相色谱法对水样中的pahs浓度进行测定(hplc；1260infinityⅱ，安捷伦，美国)；20.s4：微生物群落分析方法：采集不同处理组的根系样品共计15个，用powersoildnaisolationkit试剂盒提取水样中的dna，用nanodrop分光光度计检测dna的浓度和纯度；21.s5：数值计算：实验中所使用的污染物去除速率常数(k，/d)和去除负荷(rl，mg/d)的计算公式如下：和式中，ct为t时间水样中污染物的浓度(mg/l)，v为水样的体积(l)；22.s6：数据处理与分析：实验结束后的数据结果采用excel软件进行处理分析，对各项指标数据的平均值、标准误差、污染物去除速率常数等进行计算，利用spss软件对数据间的差异性使用单因素方差分析的方法。23.优选的，实验开始前先用自来水将芦苇幼苗根系上附着的泥土清洗干净，再使用超纯水冲洗两遍，将芦苇幼苗转移至装有300mlhoagland营养液的三角锥形瓶中，其中包含1mg/lpahs的典型代表物菲和50mg/laoas，五组实验组置于人工生化培养箱培养(气温25ꢀ±1℃、湿度80％、光强8000lx、光照12h/d)，三角锥形瓶瓶身部分使用锡纸进行避光处理；每组设置三个平行，aoas使用磁力加热搅拌器(尚仪sunnesnms-h)加热溶解于营养液中。24.优选的，步骤2中为了样品更好地反应水体中的真实情况，采样前需要使用涡旋振荡器混匀水样，其中1.5ml用于pahs浓度分析的水样需经0.22μm的针筒式滤膜过滤器过滤后，用甲醇溶剂将滤膜上的物质洗脱出来并冷冻保存等待上机分析。25.优选的，步骤3中色谱分析条件：选用xterramsc18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；进样量15μl；流速1ml/min；dad检测波长254nm；柱温40℃；标准曲线：取7瓶进样小瓶，依次加入0、0.10、0.20、0.25、0.50、0.75、1.0ml的1mg/l菲液，用甲醇稀释至1m，振荡摇匀，以甲醇为参比溶液，上机测定菲的峰面积，以峰面积为纵坐标，相应菲含量为横坐标绘制出标曲曲线。26.优选的，步骤4中用引物341f和806r扩增细菌16srrna序列的v3-v4区，pcr反应体系为50μl，2xpremixtaq25μl，341f/806r引物各1μl，dna3μl，nuclease-freewater20μl，反应条件为：98℃预变性1min，98℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，再在72℃下延伸5min，最后保存在4℃条件下，最后使用illuminahiseq2500平台进行测序。27.与现有技术相比，本发明的有益效果是：28.本发明中研究发现aoas可以为植物根际微生物提供易利用碳源，并提高pahs相关降解菌(如嗜甲基菌和硝基黄杆菌)的丰度，从而促进pahs的生物降解，特别是一元酸pca组中这种现象最为明显，但二元酚酸ca组可以强化植物生长活性从而增强植物对pahs的吸附和吸收能力，进而促进pahs的整体去除效果。由此可见，利用aoas促进有机污染物的生物降解，既对目标污染物具有高度针对性，又不产生二次污染。附图说明29.图1为本发明技术线路图。30.图2为本发明cod的去除速率(a)与去除负荷(b)。31.图3为本发明nh4-h去除速率(a)与去除负荷(b)。32.图4为本发明菲去除速率(a)与去除负荷(b)。33.图5为本发明不同aoas处理下芦苇根际细菌群落的alpha多样性分析。34.图6为本发明基于weightedunifrac(a)与unweightedunifrac(b)距离的不同aoas处理下芦苇根际细菌群落的pcoa分析。35.图7为本发明根际样品中门分类水平上的细菌群落分布情况。36.图8为本发明根际样品中属分类水平上的细菌群落分布情况。37.图9为本发明实验所用hoagland营养液成分表。38.图10为本发明实验设计分组表。39.图11为本发明样本表型丰度表。具体实施方式40.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。41.请参阅图1-11，本发明提供一种技术方案：植物芳香有机酸对多环芳烃的共代谢降解及分子响应机制，包括以下步骤：42.s1：实验设计：实验所采用的芦苇幼苗购置于当地市场，选取大小、鲜重、根长相似的芦苇作为实验对象；43.s2：样品采集与预处理：实验装置开始运行后在十天内每天连续采集不同处理组水样(n＝10)；每次采集5ml水样用作cod、nh4-n、pahs浓度实验分析，采样后立刻添加等量灭菌的hoagland营养液作为补充；44.s3：分析方法：45.1)：化学需氧量：cod使用水质分析仪(ycnpn-4h，jinzhuang，上海)测定分析，水质分析仪需要根据实际水样cod范围配置量程合适的cod试剂一和试剂三；其配置方法如下：46.a：试剂一：在200ml烧杯中加入90ml蒸馏水，再不断搅拌下沿杯壁加入10ml浓硫酸(实验分析纯)，再将cod试剂一粉包倒入溶解，冷却后装入试剂瓶中备用；47.b：试剂三：取整包cod试剂三置于500ml细口棕色瓶中，加入400ml浓硫酸(实验分析纯)，放置于暗处溶解，备用；48.水样的测定分析：将水样中的cod浓度稀释10倍后，取2ml于试管中并依次加入0.5ml试剂一和2ml试剂三，然后上机检测，分析测定结果换算回稀释前浓度即为水样中cod的浓度；49.2)：氨氮：水体中的nh4-n亦是使用水质分析仪进行测定分析；根据水样nh4-n的范围，取0.5ml水样并补加4.5ml蒸馏水于试管中，依次加入0.1mlnh4-n试剂一和0.15mlnh4-n试剂二，加盖摇匀后静置10分钟待其显色，然后上机检测，上机测定结果即为水样中nh4-n的浓度；50.3)：多环芳烃：51.采用高效液相色谱法对水样中的pahs浓度进行测定(hplc；1260infinityⅱ，安捷伦，美国)；52.s4：微生物群落分析方法：采集不同处理组的根系样品共计15个，用powersoildnaisolationkit试剂盒提取水样中的dna，用nanodrop分光光度计检测dna的浓度和纯度；53.s5：数值计算：实验中所使用的污染物去除速率常数(k，/d)和去除负荷(rl，mg/d)的计算公式如下：和式中，ct为t时间水样中污染物的浓度(mg/l)，v为水样的体积(l)；54.s6：数据处理与分析：实验结束后的数据结果采用excel软件进行处理分析，对各项指标数据的平均值、标准误差、污染物去除速率常数等进行计算，利用spss软件对数据间的差异性使用单因素方差分析的方法。55.在本发明中，实验开始前先用自来水将芦苇幼苗根系上附着的泥土清洗干净，再使用超纯水冲洗两遍，将芦苇幼苗转移至装有300mlhoagland营养液的三角锥形瓶中，其中包含1mg/lpahs的典型代表物菲和50mg/l的aoas，五组实验组置于人工生化培养箱培养(气温25±1℃、湿度80％、光强8000lx、光照12h/d)，三角锥形瓶瓶身部分使用锡纸进行避光处理；每组设置三个平行实验，aoas使用磁力加热搅拌器(尚仪sunnesnms-h)加热溶解于营养液中。56.在本发明中，为了样品更好地反应水体中的真实情况，采样前需要使用涡旋振荡器混匀水样，其中1.5ml用于pahs浓度分析的水样需经0.22μm的针筒式滤膜过滤器过滤后，用甲醇溶剂将滤膜上的物质洗脱出来并冷冻保存等待上机分析。57.在本发明中，色谱分析条件：选用xterramsc18色谱柱(4.6×ꢀ250mm，5μm)；进样量15μl；流速1ml/min；dad检测波长254nm；柱温40℃；标准曲线：取7瓶进样小瓶，依次加入0、0.10、0.20、0.25、0.50、0.75、1.0ml的1mg/l菲液，用甲醇稀释至1m，振荡摇匀，以甲醇为参比溶液，上机测定菲的峰面积，以峰面积为纵坐标，相应菲含量为横坐标绘制出标曲曲线。58.在本发明中，用引物341f和806r扩增细菌16srrna序列的v3-v4区，pcr反应体系为50μl，2xpremixtaq25μl，341f/806r引物各1μl，dna3μl，nuclease-freewater20μl，反应条件为：98℃预变性1min，98℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，再在72℃下延伸5min，最后保存在4℃条件下，最后使用illuminahiseq2500平台进行测序。59.结果与讨论：60.1、aoas和pahs在芦苇根际的共代谢作用；61.a、aoas作用下cod的去除，如图2所示，显示了不同aoas处理下cod去除速率常数和去除负荷，5个实验组的处理分别为①+fa、ꢀ②+ca、③+pca、④+pha、⑤ck，在水质参数cod的结果中，所有添加了aoas的实验组(aoas组)对cod的去除速率常数与去除负荷均低于ck组(6.56/d，59.70mg/d)，而aoas组对cod的去除速率常数和去除负荷的排序为：ca组(6.55/d，59.54mg/d)》pha组(6.54/d，58.86mg/d)》fa组(6.52/d，56.96mg/d)》pca组(6.49/d，53.33mg/d)，从结果来看，ca和pha相较于fa和pca对去除水质中的cod有着更好的效果，但根据方差分析的结果来看，各实验组之间没有显著差异，据此推测aoas和水体中cod的含量变化并无直接关系。62.b、aoas作用下nh4-h的去除，如图3所示，为实验组水化参数nh4-h的结果，所有aoas组的去除速率常数和去除负荷都明显比ck组(5.01/d，2.18mg/d)高，其中ca组(5.42/d，8.96mg/l)的去除速率常数和去除负荷皆为最高，对nh4-h的去除效果最好，虽然fa组(5.09/d，2.96mg/l)、pca组(5.10/d，5.80mg/l)、pha组(5.10/d，4.20mg/l)对nh4-h的去除速率相差不大，但pca组和pha组有着更高的去除负荷，芦苇本身作为一种耐污的湿地植物，对nh4-h污染具有良好的去除效果，这表明实验期间，植物能够正常生长且不受nh4-h污染的胁迫，另外由于aoas的存在，致使水体中cod和nh4-h的初始含量升高，微生物有效利用添加的碳源从而促使nh4-h相关微生物群落的生长，加快了水体中微生物对污染物的分解速度。63.c、aoas作用下菲的去除，如图4所示不同aoas对植物去除菲污染的速率具有很大的差异：在所有处理组中，处理效果最佳的为ca组(0.19-0.24/d)，pha(0.14-0.18/d)组的去除效果与ck组(0.15-0.19/d)的去除效果相仿，而fa组(0.13-0.15/d)和pca组(0.09-0.14/d)的处理效果却不及ck组，已知植物中的微生物既能够抑制也可以放大酚酸的毒性，这取决于酚酸物质是否能成为固氮菌的碳源并为之利用，通过研究发现了某些酚酸物质能够弱化芦苇的化感效应，其中就包含了响应特性较强的fa和pca，此类物质威胁到植物的活性，对污染物菲的降去除果，ca和pha对植物的化感效应抑制能力弱，它们作为低分子有机酸能够改善污染物菲的生物可利用性，使菲更容易被去除。64.图4b为污染菲的去除负荷，ck组(34.92mg/l)的污染去除负荷明显比aoas处理组要高，据推测，这可能是由于ck组没有受到aoas的胁迫，导致植物对污染物菲的吸附量高于其他处理组，从而使ck组的去除负荷增大，aoas处理组的去除负荷大小为：ca组(33.42mg/l)》pha组(30.04mg/l)》pca组(28.37mg/l)》fa组(25.34mg/l)，ca组对菲高去除率与该组较高的去除负荷是相匹配的，而fa组和pca组有着相近的去除速率，但pca组却有着更高的去除负荷，通过比较aoas的功能结构，有着高去除率和高去除负荷的ca组具有邻二羟基的结构，此类结构的芳香有机酸相对于单羟基结构(pha、pca和ca)能够更好地改善有机物的去除。65.2、共代谢作用下芦苇根际微生物的多样性与群落组成66.a、芦苇根际微生物群落的aplha多样性分析：67.alphadiversity用于分析样本内(within-community)的微生物群落多样，通过单样本的多样性分析(alpha多样性)可以反映样本内的微生物群落的丰富度和多样性，本实验的alpha多样性分析采用chao1指数(图5)和shannon指数(图5)，其具体数值越高表明微生物群落的丰富度和多样性就越高，由图5很明显得看出，pca组中的chao1指数明显低于其他处理组，该组并没因aoas的存在而促进微生物群落的生长，反而抑制了微生物群落的正常生长，这与前面pca组的菲去除速率常数低的原因是相对应的，在所有的芳香有机酸组中，fa组拥有较高的chao1指数和shannon指数，但前文中fa组对菲污染物的去除速率常数和去除负荷是较低的，这可能是因为fa的强化感作用抑制了植物的生长，导致减少了植物对菲的吸附量，但同时作为微生物的碳源又促进了微生物群落的生长，ck组因没有aoas对植物的胁迫影响，在每种处理组的各指数平均值均为最高，这表明ck组微生物群落生长情况是最好的，但微生物群落生长好并不代表对污染物菲的降解效果是最好的，想要确定微生物对菲的降解效果，还需后续对pahs降解菌进行分析。68.b、芦苇根际微生物群落的beta多样性分析：69.betadiversity是对不同样本的微生物群落构成进行比较分析，首先根据所有样本的物种注释结果和otus的丰度信息，将相同分类的otus信息合并处理得到物种丰度信息表(profilingtable)，同时利用otus之间的系统发生关系，进一步计算unifrac距离(unweightedunifrac)，unifrac距离是一种利用各样本中微生物序列间的进化信息计算样本间距离，两个以上的样本，则得到一个距离矩阵，然后，利用otus的丰度信息对unifrac距离(unweightedunifrac)进一步构建weightedunifrac距离。70.由图6显示可知，aoas各组在unweightedunifrac距离矩阵中有倾向于成簇聚集的现象(permanova多因素方差分析)，不同aoas处理对芦苇根际微生物群落的beta多样性有显著影响，且aoas组(pha组、pca组、ca组、fa组)与ck组之间的群落结构差异较大。71.c、芦苇根际微生物群落的结构组成：72.选取每个分组在门水平上前十的优势菌群进行分析，各组菌群结果分布如图7所示，所检测到的优势菌门有变形菌门(proteobacteria)、蓝细菌门(cyanobacteria)、拟杆菌门(bacteroidetes)、厚壁菌门(firmicutes)、绿弯菌门(chloroflexi)、放线菌门(actinobacteria)，这些优势门在微生物群落中占比高达99％，其中变形菌门(proteobacteria)在各实验组的占比约为60％-66％，在所有微生物群落中占比最大，这与湿地植物中该菌门的分布情况是相似的，从横向对比来看，添加aoas的实验组的变形菌门和拟杆菌门丰度显著高于ck组。变形菌门和拟杆菌门作为一种富营养菌，能够有效利用芳香有机酸作为碳源，使得这两种菌群在细菌群落生长竞争中占据优势，图7中有充足碳源的aoas组中这两种菌的生长情况都较ck组好，而ck组因为缺少有效的碳源，为了抵御pahs的胁迫，促使了绿弯菌门的生长，这与绿弯菌门能够吸收环境中的有机酸物质特性相符合。73.在以往的研究中，蓝细菌门比较少成为降解pahs的主导菌门，但在此次实验结果中，该菌门在各组都呈现出较为明显的优势，蓝细菌门在氮、磷丰富的水体中生长旺盛，经常作为水体富营养化的指示生物，蓝细菌门的大量繁殖很可能与实验水体的高nh4-n值有关，蓝细菌门的生长与其他微生物有一个良性的关系，在guo等人的研究中，蓝细菌门与锰氧化细。菌的共存能够促进人工湿地强化苯并[b]荧蒽的去除率，因此ca组和ck组对污染物菲的去除率较高很可能是得益于蓝细菌群落的繁殖增长。[0074]根据所有样本在属水平的物种注释及丰度信息，选取丰度排名前10的属，根据其在每个样本中的丰度信息，从物种和样本两个层面进行聚类，分析不同aoas处理群落物种属水平上的差异，其结果如图8所示，嗜甲基菌属(methylophilus)是本实验中的优势菌属，它能够利用类甲基物质作为自身的碳源进行生长，从该菌属在各组的表现来看，嗜甲基菌在ck组中比在aoas组中的丰度都低；而aoas组中的处理效果为：pca组》pha组》fa组》ca组，这表明aoas组存在更多的菲降解过程中所产生的类甲基物质，为嗜甲基菌提供充足的碳源从而促进细菌群落的生长，印证了芳香有机酸增强芦苇根际微生物对pahs菲的降解作用。[0075]d、芦苇根际微生物群落的环境因子关联分析：[0076]本实验的环境因子关联采用spearman秩相关进行分析，用它来研究环境因子与物种之间的相互变化关系，得到两两之间的相关性和显著性，目前对pahs具有降解功能的菌种就有嗜酸菌属(acidovorax)、节杆菌属(ar-throbacter)、短杆菌属(brevibacterium)、伯克氏菌属(burkholderia)、丛毛单杆菌属(comamonas)、分支杆菌属(mycobacterium)、假单胞菌属(pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas)等，在本实验中菲的去除与硝基黄杆菌(diaphorobacter)呈极强的相关性，而该菌属是丛毛单胞菌科(comamonadaceae)的硝基黄杆菌属，其主要特征为：革兰氏阴性、细胞直杆状，单极毛，氧化酶阳性，研究表明，硝基黄杆菌能够去除一定的苯系物且在菲的生物降解中起到主要的作用，asticcacaulis、acetobacteroides、azospirillum等菌种与环境因子cod表现出较为强烈的相关性，但当目前研究并未发现这些菌种对pahs具有降解的作用，难以确定cod因子对菲去除的影响，环境因子nh4-h则没有对微生物群落产生显著的影响，热单胞菌属(thermomonas)与植物的根长呈极强的相关性，说明植物的根际越发达该菌属就生长得越好，该菌属与硝基黄杆菌作为能够高效降解菲的菌属已经被证明，这表明，根际的生长情况对菲的去除存在一定程度的影响。[0077]e、多环芳烃降解菌功能预测：[0078]本实验的pahs降解功能菌采用了bugbase进预测分析，图11展示了各实验组7种微生物表型的丰度，对菲降解效果最好的pca组相较于其他实验组，革兰氏阴性菌的丰度是最高的，前文中的嗜甲基菌和硝基黄杆菌也属于革兰氏阴性菌，这说明菲的降解与革兰氏阴性菌的丰度存在密切关系，而对菲去除效果最好的ca组，在七种微生物表型丰度中并没有显著突出，说明ca组的高去除率并不是由微生物作用导致的，兼性厌氧菌丰度在pca组与pha组中最高，它们对菲的降解作用也是最明显的，从此可推断兼性厌氧菌的丰度与污染物菲的去除存在一定的联系，即菲的降解菌大都为兼性厌氧型细菌，虽然fa组对微生物不同表型造成了一定的影响，但是并无明显的规律性。[0079]结论：[0080](1)通过芦苇水培的实验，发现ca组对pahs的去除效果是最好的，pha组和ck组的去除效果相仿，pca组和fa组的去除效果甚至低于ck组，但这并不能反映aoas对pahs的真实降解效果，pahs的去除包括根表吸附与生物降解，一般pahs是由植物根表进行吸附，再进行生物降解，ca作为二元酚酸能够促进芦苇根际的生长，芦苇根表上吸附了更多的pahs，使得水体中的pahs大量减少，因而pahs并非通过生物降解的作用从水体中去除，从微生物表型丰度的分析可以印证这一点，其他实验组fa、pca和pha并没有促进水体中pahs的去除，有可能是因为单羟基对植物生长的抑制作用，从而减少了植物对pahs的吸附，造成二元酚酸组(pca、pha、fa)对pahs的去除量低于ck组的现象。[0081](2)在本实验中，aoas作为外源性碳源，促进拥有相似结构的pahs相关降解菌分泌产生多功能的降解酶，然后通过裂解途径对pahs进行分解，进而促进pahs与aoas的共代谢降解作用，变形菌门和拟杆菌门是根际微生物的优势菌门同时也是降解pahs的主导菌门，而蓝细菌门能够促进pahs相关降解菌的生长，嗜甲基菌(methylophilus)是微生物群落中的一种优势菌种且具有pahs降解的功能，添加外源性aoas后，该菌种的丰度得到提高，其中pca组对嗜甲基菌的丰度提升最明显，这表明aoas-pahs的共代谢体系促进了pahs相关降解菌种的生长，强化了微生物对pahs的生物降解作用。[0082](3)二元酚酸ca能够通过促进植物生长，增强根际微生物群落的丰度，但并没有提高菲相关降解菌的丰度，因此不能促进污染物菲的生物降解，而一元酚酸(pca、pha、fa)虽然在去除效果的表现不如二元酚酸，实际上，一元酚酸释放的非特异性酶使得嗜甲基菌和硝基黄杆菌等相关pahs降解菌丰度提高，从而通过共代谢的途径使污染物菲得到降解，由此可说明，aoas的种类影响着植物的生长与根际微生物的结构，从而使得多环芳烃进行着不同的降解行为。[0083]尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。当前第1页12当前第1页12
技术特征：1.植物芳香有机酸对多环芳烃的共代谢降解及分子响应机制，包括以下步骤，其特征在于：s1：实验设计：实验所采用的芦苇幼苗购置于当地市场，选取大小、鲜重、根长相似的芦苇作为实验对象；s2：样品采集与预处理：实验装置开始运行后在十天内每天连续采集不同处理组水样(n＝10)；每次采集5ml水样用作cod、nh4-n、pahs浓度实验分析，采样后立刻添加等量灭菌的hoagland营养液作为补充；s3：分析方法：1)：化学需氧量：cod使用水质分析仪(ycnpn-4h，jinzhuang，上海)测定分析，水质分析仪需要根据实际水样cod范围配置量程合适的cod试剂一和试剂三；其配置方法如下：a：试剂一：在200ml烧杯中加入90ml蒸馏水，再不断搅拌下沿杯壁加入10ml浓硫酸(实验分析纯)，再将cod试剂一粉包倒入溶解，冷却后装入试剂瓶中备用；b：试剂三：取整包cod试剂三置于500ml细口棕色瓶中，加入400ml浓硫酸(实验分析纯)，放置于暗处溶解，备用；水样的测定分析：将水样中的cod浓度稀释10倍后，取2ml于试管中并依次加入0.5ml试剂一和2ml试剂三，然后上机检测，分析测定结果换算回稀释前浓度即为水样中cod的浓度；2)：氨氮：水体中的nh4-n亦是使用水质分析仪进行测定分析；根据水样nh4-n的范围，取0.5ml水样并补加4.5ml蒸馏水于试管中，依次加入0.1mlnh4-n试剂一和0.15mlnh4-n试剂二，加盖摇匀后静置10分钟待其显色，然后上机检测，上机测定结果即为水样中nh4-n的浓度；3)：多环芳烃：采用高效液相色谱法对水样中的pahs浓度进行测定(hplc；1260infinityⅱ，安捷伦，美国)；s4：微生物群落分析方法：采集不同处理组的根系样品共计15个，用power soildna isolation kit试剂盒提取水样中的dna，用nano drop分光光度计检测dna的浓度和纯度；s5：数值计算：实验中所使用的污染物去除速率常数(k，/d)和去除负荷(rl，mg/d)的计算公式如下：和式中，ct为t时间水样中污染物的浓度(mg/l)，v为水样的体积(l)；s6：数据处理与分析：实验结束后的数据结果采用excel软件进行处理分析，对各项指标数据的平均值、标准误差、污染物去除速率常数等进行计算，利用spss软件对数据间的差异性使用单因素方差分析的方法。2.根据权利要求1所述的植物芳香有机酸对多环芳烃的共代谢降解及分子响应机制，其特征在于：实验开始前先用自来水将芦苇幼苗根系上附着的泥土清洗干净，再使用超纯水冲洗两遍，将芦苇幼苗转移至装有300ml hoagland营养液的三角锥形瓶中，其中包含1mg/l多环芳烃的典型代表物菲和50mg/l aoas，五组实验组置于人工生化培养箱培养(气温25
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1℃、湿度80％、光强8000lx、光照12h/d)，三角锥形瓶瓶身部分使用锡纸进行避光处理；每组设置三个平行，aoas使用磁力加热搅拌器(尚仪sunne snms-h)加热溶解于营养液中。
3.根据权利要求1所述的植物芳香有机酸对多环芳烃的共代谢降解及分子响应机制，其特征在于：为了样品更好地反应水体中的真实情况，采样前需要使用涡旋振荡器混匀水样，其中1.5ml用于pahs浓度分析的水样需经0.22μm的针筒式滤膜过滤器过滤后，用甲醇溶剂将滤膜上的物质洗脱出来并冷冻保存等待上机分析。4.根据权利要求1所述的植物芳香有机酸对多环芳烃的共代谢降解及分子响应机制，其特征在于：色谱分析条件：选用xterra ms c18色谱柱(4.6
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250mm，5μm)；进样量15μl；流速1ml/min；dad检测波长254nm；柱温40℃；标准曲线：取7瓶进样小瓶，依次加入0、0.10、0.20、0.25、0.50、0.75、1.0ml的1mg/l菲液，用甲醇稀释至1m，振荡摇匀，以甲醇为参比溶液，上机测定菲的峰面积，以峰面积为纵坐标，相应菲含量为横坐标绘制出标曲曲线。5.根据权利要求1所述的植物芳香有机酸对多环芳烃的共代谢降解及分子响应机制，其特征在于：用引物341f和806r扩增细菌16srrna序列的v3-v4区，pcr反应体系为50μl，2xpremix taq 25μl，341f/806r引物各1μl，dna 3μl，nuclease-free water 20μl，反应条件为：98℃预变性1min，98℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，再在72℃下延伸5min，最后保存在4℃条件下，最后使用illuminahiseq 2500平台进行测序。
技术总结本发明公开了植物芳香有机酸对多环芳烃的共代谢降解及分子响应机制。本发明中研究发现AOAs可以为植物根际微生物提供易利用碳源，并提高PAHs相关降解菌(如嗜甲基菌和硝基黄杆菌)的丰度，从而促进PAHs的生物降解，特别是一元酸PCA组中这种现象最为明显，但二元酚酸CA组可以强化植物生长活性从而增强植物对PAHs的吸附和吸收能力，进而促进PAHs的整体去除效果。由此可见，利用AOAs促进PAHs等芳香族有机污染物的生物降解，既对目标污染物具有高度针对性，又不产生二次污染，使得本发明具备高度针对性的特点，同时不会对环境造成二次污染。同时不会对环境造成二次污染。同时不会对环境造成二次污染。
技术研发人员：阿丹 郭钦梅 邹梦遥 卢桂宁 王玉 陈雪晴 李雅莹 彭铭鑫
受保护的技术使用者：仲恺农业工程学院
技术研发日：2022.07.25
技术公布日：2022/11/1
