1.本发明属于功能化纳米材料领域，特别涉及一种吲哚菁绿功能化的树状大分子纳米药物及其制备方法和应用。
背景技术：2.癌症的传统治疗手段如手术治疗、化疗及放疗可消除局部病灶，但仍然存在一些缺点，如不能完全治愈并有效地预防癌症地转移和复发，并且对机体正常组织造成有害毒副作用。新型的免疫疗法可以通过提高自身免疫敏感性杀死肿瘤细胞，相比于传统治疗手段具有更低的毒性和更持久的疗效可以根除肿瘤和预防复发或转移。同时，光热治疗也作为一种新型肿瘤治疗手段而受到广泛关注，其不仅可以利用近红外激光照射光热剂产热来消融肿瘤细胞，还可以诱导免疫原性细胞死亡(icd)，并伴随有损伤相关分子模式，从而启动抗肿瘤免疫循环。虽然光热治疗可以诱发肿瘤细胞免疫原性死亡从而增强免疫治疗，但肿瘤细胞可通过调节自噬来对光热进行抵抗。自噬是指细胞降解受损的细胞器、老化的蛋白质和其他成分，并循环利用自我更新营养的过程。通过自噬行为，癌细胞可以抵抗细胞应激和多种治疗手段以及逃避免疫监视。由光热治疗引起的细胞损伤可以被自噬过程修复和逆转，导致细胞不完全坏死。因此为了克服细胞自噬引起的光热治疗效果减弱及免疫监视逃避，开发一种能够抑制细胞自噬的光热治疗并联合免疫治疗纳米药物，实现更具有特异性和高效性的肿瘤治疗至关重要。
3.聚酰胺-胺(pamam)树状大分子是一类物化性质独特的纳米级大分子，它具有高度分支的三维结构，良好的生物相容性和可高度官能化的表面功能团，被广泛应用于生物医学领域。研究表明，pamam树状大分子表面可以修饰靶向肽rgd及两性离子羧酸甜菜碱，并通过二硫键连接化疗药物阿霉素以及内部包裹cus纳米颗粒用于肿瘤光热/化疗联合治疗(xiong et al.,small methods 2021,5,2100204)。同时，树状大分子的独特性能也使其能够作为载体负载光热转换剂或基因药物用于光热治疗和基因治疗(wei,p.,et al.adv.healthcare mater.2016,5,3203-3213)。此外，cq作为常用的细胞自噬抑制剂，常用于联合光热治疗用于增强的肿瘤治疗。程等人为提高光热治疗敏感度，设计了一种以聚多巴胺为模板负载cq用于抑制细胞自噬通路，实现了对肿瘤细胞的高效杀伤(chen et al.,biomaterials,2017,141,116-124)。与此同时，研究发现cq也具有免疫调节的作用，可以使肿瘤相关巨噬细胞从促进肿瘤生长的m2型向抑制肿瘤生长的m1型极化转换，从而提高对肿瘤免疫杀伤效果(chen et al.,nat.commun.,2018,9,873)。
4.此外，吲哚菁绿(icg)是临床应用的近红外成像造影剂，大量研究表明icg也是一种有效的小分子光热试剂。刘等人文章报道设计开发了具有活性氧响应性的icg键合和天然复合γ-氨基丁酸负载聚合物胶束作为一种高肿瘤特异性的近红外激光激活纳米系统，用于侵袭性乳腺癌的局部化疗/光热协同治疗(yang et al.,j.controlled release 2021,339,114-129)
技术实现要素：5.本发明所要解决的技术问题是提供一种吲哚菁绿功能化的树状大分子纳米药物及其制备方法和应用，该纳米药物抑制肿瘤细胞自噬促进肿瘤光热治疗、诱导免疫原性死亡、引发机体免疫治疗、抑制细胞自噬促进光热治疗，进而增强肿瘤免疫治疗。
6.本发明提供了一种吲哚菁绿功能化的树状大分子纳米药物，所述树状大分子纳米药物由第五代聚酰胺-胺pamam树状大分子g5.nh2表面修饰吲哚菁绿icg并乙酰化，再负载细胞自噬抑制剂氯喹cq而得。
7.本发明还提供了一种吲哚菁绿功能化的树状大分子纳米药物的制备方法，包括如下步骤：
8.(1)将羧基吲哚菁绿icg-cooh溶于有机溶剂中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐edc和n-羟基琥珀酰亚胺nhs活化；然后将上述溶液逐滴加入溶于有机溶剂的第五代聚酰胺-胺树状大分子g5.nh2溶液中，室温条件下搅拌反应2-4天，透析，冷冻干燥得到g5.nh
2-icg；其中，所述g5.nh2和icg-cooh的摩尔比为1:10～1:15；
9.(2)将步骤(1)所得g5.nh
2-icg溶于超纯水中，加入三乙胺混合均匀，逐滴加入醋酸酐溶液，室温搅拌24小时，透析，冷冻干燥得到g5.nhac-icg；
10.(3)将步骤(2)所得g5.nhac-icg溶于超纯水中，加入cq溶液，避光搅拌12-24h，离心，得到吲哚菁绿功能化的树状大分子纳米药物，即g5.nhac-icg/cq；其中，所述g5.nhac-icg与cq的摩尔比为1:2.5～1:10。
11.所述步骤(1)中的有机溶剂为二甲基亚砜dmso。
12.所述步骤(1)中的g5.nh2溶液的浓度为10mg/ml。
13.所述步骤(1)中edc活化时间为0.5h，nhs活化时间为3h。
14.所述步骤(1)和(2)中的透析为使用截留分子量为8000～14000的纤维素透析膜在超纯水中透析3天。
15.所述步骤(2)中g5.nh
2-icg与三乙胺和醋酸酐的用量之和的质量比1:0.8-1.2。
16.本发明还提供了一种吲哚菁绿功能化的树状大分子纳米药物在制备抑制肿瘤细胞自噬药物和促进肿瘤光热/免疫联合治疗中的应用。
17.本发明使用核磁共振氢谱(1h nmr)、紫外可见吸收光谱(uv-vis)、zeta电势测试、动态光散射(dls)方法表征了制备得到的纳米材料，并评价了该材料作为光热治疗试剂在近红外激光(808nm)照射下的升温效果。利用cck-8法在体外验证了纳米药物的细胞相容性，再利用流式细胞仪、共聚焦显微镜来评价该纳米药物在癌细胞中的吞噬能力和胞内定位情况，利用流式细胞仪来评价该纳米药物的巨噬细胞极化情况。采用了western blot评价了细胞自噬情况，利用激光共聚焦显微镜和相应的检测试剂盒评价了所得纳米药物引起肿瘤细胞免疫原性死亡的效果，最后在小鼠体内评价了其光热/免疫联合治疗的抗肿瘤效果。
18.有益效果
19.(1)本发明的纳米药物能高效被肿瘤细胞所吞噬并不影响肿瘤细胞活力，能实现在激光照射下很好的抑制细胞自噬，促进杀伤肿瘤细胞能力，并引起肿瘤细胞的免疫原性死亡；
20.(2)本发明的纳米药物具有多功能性，可以用于肿瘤相关巨噬细胞从促进增强生
长的m2型向抑制肿瘤生长的m1型转化，用于增强的肿瘤治疗，在纳米医学、光热治疗及肿瘤免疫治疗领域具有潜在的应用价值。
21.(3)本发明操作工艺简单，反应条件温和，易操作，易于实现，所用的合成原料均为环境友好型材料，具有良好的推广前景.
附图说明
22.图1为本发明树状大分子纳米药物的合成及其应用于肿瘤光热免疫治疗联合治疗示意图。
23.图2为本发明制备的g5.nh
2-icg(a)和g5.nhac-icg的(b)的1h nmr谱图。
24.图3为本发明制备的gi和gic的uv-vis谱图。
25.图4为本发明制备的gic的光热升温曲线(a)和单个升降温循环曲线图(b)，在激光照射阶段和移除激光冷却阶段的线性拟合冷却时间与驱动温度的自然对数的相反数(c)，连续升温/降温三个循环的光热稳定性(d)。
26.图5为gi(a)、cq及gic复合物(b)与b16-f10细胞共培养24h后的cck-8细胞活力检测结果。
27.图6为b16-f10细胞经过不同实验组处理后的cck-8细胞活力测试。
28.图7为本发明制备的gic在不同浓度下与b16-f10细胞共孵育4小时，经流式细胞仪测定的吞噬结果图；
29.图8为gic在不同浓度下与b16-f10细胞共孵育4小时，经dapi染色后的激光共聚焦显微镜图片。
30.图9为b16-f10细胞经过不同实验组处理24小时后的western blot图(a)及其定量数据图(b)。
31.图10为b16-f10细胞与不同实验组处理后共孵育4h后的crt的表达情况图(a)以及孵育4小时后经不同实验组处理的细胞培养液中atp含量的定量分析图(b)与hmgb-1含量的定量分析图(c)。
32.图11为经lps处理后的raw 264.7细胞与不同实验组处理后共孵育24h后，其流式细胞表达分析图(a)及raw 264.7表面表达cd206(b)、cd86(c)定量分析柱状图和m1/m2比例定量结果图(d)。
33.图12为b16-f10黑色素瘤荷瘤小鼠接受pbs、cq、gic、apd-l1、gi+l、gic+l或gic+l+apd-l1处理12天治疗过程示意图(a)、每组的肿瘤体积变化图{pbs(b)、cq(c)、gic(d)、apd-l1(e)、gi+l(f)、gic+l(g)、gic+l+apd-l1(h)}、每组肿瘤体积相对体积变化图(i)、体重变化(j)、肿瘤重量(k)、肿瘤照片(l)。
34.图13为接受pbs、cq、gic、apd-l1、gi+l、gic+l、gic+l+apd-l1处理12天后荷瘤小鼠脾脏组织中cd4+、cd8+t细胞检测结果；cd4+、cd8+t细胞表达流式结果图(a)及cd4(b)、cd8(c)表达定量结果图。
35.图14为接受pbs、cq、gic、apd-l1、gi+l、gic+l或gic+l+apd-l1处理12天后荷瘤小鼠心、肝、脾、肺、肾切片的h&e染色结果图。
36.图15为b16黑色素瘤荷瘤小鼠接受pbs、gic+l或gic+l+apd-l1处理12天治疗过程示意图(a)、每组的远端肿瘤体积变化图(b-c)、肿瘤重量(d)、肿瘤照片(e)。
具体实施方式
37.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
38.实施例1
39.(1)称取4.46mg的羧基吲哚菁绿icg-cooh溶于5ml的dmso中，待其充分溶解后加入溶于2ml dmso中的edc(11.03mg)搅拌0.5h，然后加入溶于2ml dmso中的nhs(8.64mg)搅拌3h后。将上述溶液逐滴加入溶于5mldmso的第五代pamam树状大分子g5.nh2(10mg)，室温搅拌反应三天。反应结束后，使用截留分子量为8000～14000的纤维素透析袋在超纯水(2l)中透析3天(每日换水3次)后冷冻干燥，得到g5.nh
2-icg；
40.(2)称取10mg g5.nh
2-icg，溶于5ml的超纯水中。随后，加入三乙胺(9.30mg)混合均匀，逐滴加入醋酸酐溶液(9.52mg)，室温搅拌24小时。随后使用截留分子量为8000～14000的纤维素透析袋在纯水(2l)中透析3天(每日换水3次)，冷冻干燥，得到g5.nhac-icg(gi)。
41.(3)称取20mg gi溶于水中，加入溶于甲醇的cq(1.84mg)，避光敞口搅拌12～24h，挥发掉溶液中的甲醇溶剂，然后3000rpm离心10min，除去下层未络合的cq沉淀，上清液即为g5.nhac-icg/cq(gic)。向剩余沉淀中加入1ml甲醇，溶解其中的cq，测其在330nm处的紫外吸收值，利用预先绘制的cq甲醇溶液标准曲线计算未负载上的cq质量，然后通过差减法得出gic中cq的上载量lc
cq
＝4.5％，封装率ee
cq
＝98.9％。
42.实施例2
43.对实施例1步骤(1)和步骤(2)中制备的g5.nh
2-icg和g5.nhac-icg各称取5mg，分别溶于600μldmso-d6和d2o中，进行核磁氢谱分析。如图2a所示，其中2.2～3.4ppm为第五代树状大分子的特征峰，7.9-8.1ppm处为icg的特征归属，通过积分计算可得每个树状大分子上连接的icg为11.2个。如图2b所示，1.9ppm处为乙酰基的甲基特征峰，2.2～3.4ppm为第五代树状大分子的特征峰，并通过积分计算可得g5.nh2表面剩余氨基已被乙酰化。
44.实施例3
45.(1)取实施例1步骤(2)中和步骤(3)中制备的gi和gic制备成水溶液，进行紫外可见光谱(uv-vis)测试，测量紫外吸收，结果如图3所示。gi在795nm附近的近红外光区观察到了icg的特征吸收峰，当上载了自噬抑制剂cq以后，紫外结果显示gic在330nm处有cq的紫外吸收特征峰，表明gic已经成功制备。
46.(2)取0.2mg/ml的gic水溶液进行水动力学直径和zeta电势测试，如表1所示，gic水动力学直径在252.3nm，zeta电势为11.8mv，单分散性系数较小为0.6。可以发现gic具有合适的纳米尺度，同时由于cq的包裹，gic电势相比于gi有所下降。
47.表1 gi和gic的zeta电势、水动力学直径结果
[0048][0049]
实施例4
[0050]
参见图4a，考察了不同浓度(0、50、100、200、300μg/ml)的gic在808nm激光照射下(5min)的升温情况。在一定功率密度(1.2w/cm2)下，gic的升温效应随着浓度的增加逐渐升高，在浓度为300μg/ml时，照射五分钟后，gic的温度达到了50.9℃，而超纯水温度基本维持不变(图4a)。通过单个循环升温降温曲线，根据公式计算出gic的光热转换效率为39.7％(图4b-c)，说明gic具有良好的光热转换性能。此外，如图4d，gic的光热稳定性通过三次循环升降温进行测试，用808nm激光照射5min完成一个升温过程，然后关闭激光冷却至起始温度，完成一个降温过程。从图中看出3个循环之间温度变化没有出现明显的差异，表明制备的gic具有良好的光热稳定性。
[0051]
实施例5
[0052]
将b16-f10细胞按照每孔8
×
103的密度种植于96孔细胞培养板中，过夜、贴壁后更换成不同实验浓度的gi(0、10、20、40、60、80、100、200、400μg/ml)以及含不同cq浓度的gic或自由cq(0、0.5、1、2、4、6、8μg/ml)的新鲜培养基共培养24小时后，用pbs清洗3次，更换培养基为含10％cck-8溶液的无血清培养基，37℃培养箱中培养2小时后用酶标仪在450nm波长下测定吸光度值，计算细胞活力。如图5a所示，在不同的gi实验浓度范围内，b16-f10都有较好的细胞活力，表明g5.nhac-icg的良好细胞相容性。此外，如图5b所示，经gic处理的癌细胞活力基本没有发生变化，而自由cq处理的癌细胞活力随着其浓度的增加而减小，说明g5.nhac-icg可以提高自噬抑制剂cq的细胞相容性。
[0053]
实施例6
[0054]
将b16-f10细胞按每孔8
×
103细胞的密度种植于96孔细胞培养板中，培养过夜、贴壁后，分别更换新鲜的含pbs、cq、gi及gic的培养基，在37℃下与细胞共培养24h，弃掉原培养基，用pbs清洗3次，其中gi组使用激光照射5min，gic分为有无激光照射5min(808nm,功率1.2w/cm2)，光照结束后接着用pbs清洗3次，更换培养基为含10％cck-8溶液的无血清培养基，继续培养在37℃下，培养2小时后用酶标仪在450nm波长下测定吸光度值，并根据此值计算细胞的活力。结果如图6所示，相比于pbs、自由cq及gic处理的实验组，gi和gic在有激光照射下，其细胞活力有明显降低，其细胞活力分别为58.2％和44.4％，说明所制备的纳米药物能介导光热治疗有效抑制癌细胞增长。此外，gic+l组的细胞活力低于gi+l组，这可能是由于光热效果引起细胞发生自噬从而抵抗光热治疗，而氯喹可以抑制细胞自噬，从而达到增强光热治疗的效果。
[0055]
实施例7
[0056]
将b16-f10细胞按照以每孔5
×
105密度种植于24孔细胞培养板中，过夜、贴壁后，再将不同浓度的gic(0、25、50、100、200、400μg/ml)在新鲜培养基条件下37℃培养箱中培养4小时。之后将所有孔板的细胞用pbs清洗3次、消化、离心、收集，用流式细胞仪检测样品的荧光强度(图7)。实验结果表明，随着浓度的增加，荧光强度逐渐增强，说明制备的gic能很
好地被癌细胞吞噬。
[0057]
实施例8
[0058]
将b16-f10细胞以每孔1
×
106密度种植于confocal皿中，过夜、贴壁后，再将不同浓度的gic(0、25、50、100、200、400μg/ml)在新鲜培养基条件下37℃培养箱中培养4小时。培养结束后用pbs清洗3次，随后用2.5％的戊二醛固定15分钟，固定后用dapi染色10分钟，然后在共聚焦显微镜的油镜下观察细胞的荧光信号。如图8所示，实验结果表明，随着gic浓度的升高，红色荧光逐渐增强。说明本发明制备的gic能很好地被癌细胞内吞。
[0059]
实施例9
[0060]
由于光热治疗会引起细胞发生自噬从而达到一种自我保护作用，细胞自噬发生过程中会导致lc3-i蛋白上调，随后lc3-i蛋白转换为l3-ii蛋白，其中自噬溶酶体则可以降解lc3-ii蛋白。而氯喹可以损伤自噬溶酶体功能，使得lc3-ii蛋白无法降解从而导致lc3-ii蛋白不断聚集，从而可以通过判断lc3-ii/lc3-i的比例来评价自噬水平。因此，采用western blot来评价癌细胞内自噬蛋白lc3-i和lc3-ii蛋白表达情况。将b16-f10细胞按1
×
105密度种于12孔细胞培养板中，在37℃培养箱培养过夜，待细胞贴壁后，加入含自由cq、gi或gic的新鲜培养基，在37℃下与细胞共培养4h，弃掉原培养基，用pbs清洗三次，其中gi组使用激光照射5min，gic分为有无激光照射5min(808nm,功率1.2w/cm2)。培养结束后用pbs清洗3次，最后更换为新鲜培养基继续培养24小时后，裂解提取癌细胞总蛋白，后将蛋白质变性，进行sds-page凝胶电泳，电泳结束后转膜，免疫反应，ecl化学发光，显影，定影。以pbs为空白对照组，β-actin作为内参蛋白。实验结果表明，在对照组和实验组中内参蛋白量表达都很正常，相比于pbs、自由cq及其它实验组，gic+l处理的实验组lc3-ii/lc3-i的比例最高(图9)。这一结果也证明了本发明合成的载体gic介导的光热治疗激活细胞自噬可被有效的抑制，从而达到其对光热治疗更加敏感的目的。
[0061]
实施例10
[0062]
以2
×
105/孔的密度将b16-f10细胞种于confocal培养皿中，置于37℃、5％co2条件下培养过夜。替换含有pbs、自由cq、gi或gic的新鲜培养基孵育4小时，其中gi组使用激光照射5min，gic分为有无激光照射5min(808nm,功率1.2w/cm2)。继续共培养4h后，用预冷的pbs洗涤3次。每个孔中加入2.5％戊二醛固定15分钟。用pbs洗3次，加入免疫染色封闭液，封闭60分钟后，加入稀释后的兔抗鼠crt一抗孵育1小时，洗涤3次。随后加入稀释后的二抗，室温避光孵育1小时后，洗涤5分钟，共洗涤3次。加入dapi染细胞核10分钟，pbs洗涤3次。用激光共聚焦扫描显微镜观察细胞中crt外翻情况。如图10a所示，在pbs对照组的癌细胞中几乎检测不到crt的荧光，这是由于在正常状态下crt表达在细胞内质网中。然而，经gic或gi复合物处理的b16-f10细胞，在激光照射处理后，其表面有明显的crt的荧光信号。
[0063]
此外，以1
×
105/孔的密度将b16-f10细胞种于12孔细胞培养板中，于37℃、5％co2培养过夜，待细胞贴壁后，然后弃去培养基，用pbs清洗三次，替换含有pbs、cq、gi或gic的新鲜培养基孵育4小时，其中gi组使用激光照射5min，gic分为有无激光照射5min(808nm,功率1.2w/cm2)。继续共培养4h后，取细胞上层培养液，在96孔板中加入100μlatp检测工作液，放置3-5分钟后在孔中加入20μl培养液样品，混匀后通过多功能酶标仪测定胞外atp含量。如图10b所示，发现gic+l组和gi+l组的胞外atp释放量显著高于其它组(p《0.05)，释放的atp将有利于促进树突细胞对凋亡肿瘤细胞的吞噬作用，加强抗肿瘤免疫响应。同时，收集细胞
培养液，参照hmgb-1的elisa试剂盒的操作步骤检测高迁移率族蛋白-1(hmgb-1)的含量，如图10c所示，gic+l组和gi+l组细胞培养液中的hmgb-1含量显著高于其它组(p《0.001)，释放的hmgb-1可促进肿瘤抗原提呈给t细胞。
[0064]
实施例11
[0065]
收集对数生长期的raw 264.7巨噬细胞，以每孔2
×
105的密度将raw 264.7细胞种于六孔板中，在37℃、5％co2条件下培养过夜，待细胞贴壁后，然后弃去培养基，用pbs清洗3次，替换含有40ng/ml il-4的新鲜培养基共培养24小时。用pbs洗涤三次，将培养基替换为含pbs、cq、gi、lps(1μg/ml)或gic的新鲜培养基孵育24小时。之后消化、离心、收集，使用荧光标记fitc-cd206抗体及pe-cd86抗体对其进行染色30分钟，用流式细胞仪检测样品的荧光强度(如图11所示)。实验结果表明，相比于pbs和gi组，gic、cq及lps阳性对照组的cd206荧光强度逐渐降低，而cd86荧光强度都逐渐增强。同时，gic、cq及lps阳性对照组的m1/m2的比例分别为4.88、4.76和4.95，这些结果表明含有自噬抑制剂cq的实验组都能明显将相关巨噬细胞从促进肿瘤生长的m2型向抑制肿瘤生长的m1型极化转换，使得其能更好的抑制肿瘤细胞生长。
[0066]
实施例12
[0067]
将取4-5周龄的雌性c57bl/6小黑鼠，每只皮下种植1
×
106的b16-f10黑色素瘤，构建肿瘤模型至肿瘤体积达到50-80mm3后将小黑鼠随机分成7组，分组情况如下，第一组：pbs；第二组：cq；第三组：gic；第四组：apd-l1；第五组：gi+l；第六组：gic+l；第七组：gic+l+apd-l1；小鼠肿瘤治疗过程示意图如图12a所示。每两天测量和记录小鼠的体重变化，并测算每组小鼠的肿瘤体积及相对肿瘤体积，计算公式如下：
[0068]
肿瘤体积(v)＝a
×
b2/2
ꢀꢀ
(1)
[0069]
*a和b分别代表肿瘤直径的最大值和最小值。
[0070]
相对肿瘤体积＝v/v0ꢀꢀꢀꢀ
(2)
[0071]
*v和v0分别代表给药后的肿瘤体积和给药前的肿瘤体积。
[0072]
如图12b-i和图12k-l所示，每个治疗组中的肿瘤抑制效果排序为：pbs＜cq＜gic＜apd-l1＜gi+l＜gic+l＜gic+l+apd-l1，其中gic+l+apd-l1实验组的肿瘤抑制效果最好，能明显抑制肿瘤生长。同时，如图12j所示，随着时间推移小鼠年龄增长且肿瘤体积增加，尤其是pbs组，小鼠体重也有所增加，而gic+l+apd-l1实验组小鼠体重变化不大。这结果也表明，光热联合免疫治疗能有效抑制肿瘤生长。
[0073]
随后为进一步验证机体免疫治疗，在治疗后12天，将各组小鼠各取一只，将小鼠进行安乐死，无菌条件下取出其脾脏组织，提取脾脏的t细胞并收集，然后将上述获取的t细胞分别用不同荧光标记fitc-cd4、pe-cd8的抗体标记后，使用流式细胞仪对脾脏组织中cd4+、cd8+t细胞进行定量分析。如图13所示，结果表明，相比于其它对照组及其它实验组，gic+l+apd-l1组小鼠脾脏组织中的cd4+及cd8+效应t细胞表达最多。
[0074]
此外，将治疗第12天的小鼠心、肝、脾、肺、肾取出进行h&e染色测试，如图14所示，不同治疗组的小鼠心、肝、脾、肺、肾均无明显异常病理出现，表明了gic+l+apd-l1的良好生物相容性。
[0075]
实施例13
[0076]
将1
×
106个b16-f10细胞接种到小鼠的右腿，将5
×
105个b16-f10细胞接种到小鼠
的左腿，待小鼠右腿肿瘤体积达到约50-80mm3左右时，将小鼠随机分为3组。分组情况如下：第一组：pbs；第二组：gic+l；第三组：gic+l+apd-l1。小鼠肿瘤治疗过程示意图如图15a所示。之后，记录12天内小鼠远端的肿瘤的体积。如图15b-e所示，对照组小鼠远端肿瘤随着时间增长，gic+l+apd-l1和gic+l组肿瘤生长受到了一定的抑制。其中，gic+l+apd-l1组的治疗小鼠获得了最高的抗肿瘤活性。实验结果证明本发明中合成的gic在激光照射下及联合免疫检查点阻断剂apd-l1可实现体内的远端抗肿瘤治疗应用。
技术特征：1.一种吲哚菁绿功能化的树状大分子纳米药物，其特征在于：所述树状大分子纳米药物由第五代聚酰胺-胺pamam树状大分子g5.nh2表面修饰吲哚菁绿icg并乙酰化，再负载细胞自噬抑制剂氯喹cq而得。2.一种吲哚菁绿功能化的树状大分子纳米药物的制备方法，包括如下步骤：(1)将羧基吲哚菁绿icg-cooh溶于有机溶剂中，加入edc和nhs活化；然后将上述溶液逐滴加入溶于有机溶剂的第五代聚酰胺-胺树状大分子g5.nh2溶液中，室温条件下搅拌反应2-4天，透析，冷冻干燥得到g5.nh
2-icg；其中，所述g5.nh2和icg-cooh的摩尔比为1:10～1:15；(2)将步骤(1)所得g5.nh
2-icg溶于超纯水中，加入三乙胺混合均匀，逐滴加入醋酸酐溶液，室温搅拌24小时，透析，冷冻干燥得到g5.nhac-icg；(3)将步骤(2)所得g5.nhac-icg溶于超纯水中，加入cq溶液，避光搅拌12-24 h，离心，得到吲哚菁绿功能化的树状大分子纳米药物，即g5.nhac-icg/cq；其中，所述g5.nhac-icg与cq的摩尔比为1:2.5～1:10。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的有机溶剂为二甲基亚砜dmso。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的g5.nh2溶液的浓度为10 mg/ml。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中edc活化时间为0.5 h，nhs活化时间为3 h。6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)和(2)中的透析为使用截留分子量为8000～14000的纤维素透析膜在超纯水中透析3天。7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中g5.nh
2-icg与三乙胺和醋酸酐的用量之和的质量比1:0.8-1.2。8.一种如权利要求1所述的吲哚菁绿功能化的树状大分子纳米药物在制备抑制肿瘤细胞自噬药物和促进肿瘤光热/免疫联合治疗中的应用。
技术总结本发明涉及一种吲哚菁绿功能化的树状大分子纳米药物及其制备方法和应用，所述树状大分子纳米药物由第五代聚酰胺-胺PAMAM树状大分子G5.NH2表面修饰吲哚菁绿ICG并乙酰化，再负载细胞自噬抑制剂氯喹CQ而得。本发明的纳米药物具有良好的单分散性、稳定性及生物相容性等优点，在抑制肿瘤细胞自噬促进肿瘤光热治疗/免疫治疗联合治疗领域具有潜在的应用价值。值。值。
技术研发人员：史向阳 欧阳智俊 高悦 沈思妍 贾兵洋 沈明武
受保护的技术使用者：东华大学
技术研发日：2022.07.21
技术公布日：2022/11/1
