h9n2亚型禽流感病毒mrna疫苗及制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种h9n2亚型禽流感病毒 mrna疫苗及制备方法与应用。
背景技术：2.流感病毒为多节段单股负链有囊膜的rna病毒，流感病毒可根据核蛋白和基质蛋白的抗原性差异分为a，b，c三种型，h9n2亚型禽流感病毒属于a型流感病毒，病毒粒子由核衣壳和病毒囊膜构成。在亚洲的禽类中广泛传播，病理表现为轻微的呼吸道症状，引发继发感染后会感染导致死亡。
3.a型流感病毒基因组按照基因长度由pb2、pb1、pa、ha、np、na、m 和ns这8个负链和单链rna片段组成，每种病毒基因至少编码一种蛋白。 ha是一种三聚体形式的吸附蛋白，c端末端的一个疏水区插入病毒囊膜中，是血凝素蛋白与病毒囊膜结合的部位，n端末端的一个疏水区有膜融合活性，与病毒入侵宿主细胞有关，还会诱导中和抗体产生和细胞免疫，是病毒表面的主要抗原之一。而灭活疫苗主要诱导体液免疫，细胞免疫较弱，随着h9n2病毒的不断变异，在各个国家都出现了疫苗接种失效的情况。
4.mrna疫苗是一种将rna在体外进行相关的修饰后传递至机体细胞内表达并产生蛋白抗原，从而导致机体产生针对该抗原的免疫应答，进而扩大机体的免疫能力的疫苗。与全细菌、亚单位和dna疫苗等其他疫苗相比，mrna 疫苗可以诱导t细胞和b细胞免疫反应，并且是非整合性和可自然降解的，因此，不存在感染或插入诱变的风险。其次，通过体外转录反应可以快速、廉价地合成mrna，因此很容易可以在短时间内大量生产。第三，病毒载体疫苗成本高，对机体免疫影响大，lnp比之相对安全，出现自身免疫反应几率小。对于机体来说，机体所产生的抗原存在时间长，数量多，它的特异性免疫记忆和免疫应答就越强、越快。mrna疫苗从接种、被递送到目标靶点、呈递抗原直至降解，整个过程中疫苗接种量不会对抗原数量产生较大影响，且mrna所呈递的抗原存在时间长，不会迅速被消化，十分有利于免疫应答。
5.总体来说，mrna疫苗具有研发周期短，生产工艺简单，易于批量生产；研发周期短，能够快速开发新型候选疫苗；安全性好，不需要佐剂，不含病毒成分，无感染风险；具有双重免疫机制，免疫原性强等优势，所以mrna疫苗正成为对抗感染性疾病的强大平台。
技术实现要素：6.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种h9n2亚型禽流感病毒mrna 疫苗及制备方法与应用。
7.本发明的目的是提供一种h9n2亚型禽流感病毒mrna疫苗的制备方法，包括：
8.以h9n2亚型禽流感病毒ha全长为模板，经过pcr扩增得到扩增产物；扩增产物连接入pvax1质粒，构建了pvax1-ha重组质粒；
9.反向pcr线性化重组质粒，带有t7启动子的线性化质粒在t7 rna聚合酶作用下体
外转录后得到目的片段mrna；
10.通过牛痘病毒加帽系统和poly(a)聚合酶进行mrna修饰，得到mrna 疫苗。
11.其中，通过牛痘病毒加帽系统和poly(a)聚合酶进行mrna修饰具体包括：
12.mrna纯化：将所述体外转录后得到的mrna进行氯化锂、乙醇沉淀纯化；
13.mrna加帽：在加帽酶催化下，在mrna的5’端加上帽子结构，得到带有帽子结构的mrna；
14.mrna纯化：将所述加帽后的mrna进行氯化锂、乙醇沉淀纯化；
15.mrna加尾：在poly(a)聚合酶催化下，atp以amp的形式添加到 mrna 3
′
端，即在mrna的3
′
端加20-200个a碱基，得到加帽和加poly(a) 尾的mrna；
16.mrna纯化：将所述加尾后的mrna进行氯化锂、乙醇沉淀纯化。
17.优选的，上述h9n2亚型禽流感病毒mrna疫苗的制备方法，pcr扩增所用引物为：
18.上游引物h9n2 ha p1：
[0019]5’‑ꢀ
gggagacccaagctggctagcatggaagtagcatcactaataactatact
‑ꢀ3’
；
[0020]
下游引物h9n2 ha p2：
[0021]5’‑ꢀ
tccgagctcggtaccaagcttttatatacaaatgttgcatctgcaagc-3’。
[0022]
优选的，上述h9n2亚型禽流感病毒mrna疫苗的制备方法，pvax1质粒以及重组质粒酶切位点均是nhei、hindiii；
[0023]
反向pcr得到线性化质粒的引物序列如下：
[0024]
pvax1-hap1：5
’‑
ttatatacaaatgttgcatctgcaaga-3’；
[0025]
pvax1-ha p2：5
’‑
atggaagtagcatcactaataactatactactag
‑ꢀ3’
。
[0026]
优选的，上述h9n2亚型禽流感病毒mrna疫苗的制备方法，将纳米脂质体与修饰后的mrna自组装后制备成粒子形态的mrna疫苗。
[0027]
本发明还提供了一种由上述方法制备的h9n2亚型禽流感病毒mrna疫苗。
[0028]
本发明还提供了一种针对h9n2亚型禽流感病毒mrna疫苗的抗原，所述抗原是ha原核蛋白，其抗原氨基酸序列如seq id no.1所示。
[0029]
本发明还提供了一种用于制备针对h9n2亚型禽流感病毒的疫苗的 mrna，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0030]
本发明还提供了一种与所述的mrna互补的dna，其核苷酸序列如seqid no.3所示。
[0031]
本发明还提供了一种包含所述的mrna的载体。
[0032]
本发明还提供了一种所述的mrna在制备针对h9n2亚型禽流感病毒的疫苗中的应用。
[0033]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0034]
典型h9n2亚型禽流感病毒颗粒呈球状，有囊膜。囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白，分别是血凝素(ha)、神经氨酸酶(na)和基质蛋白 (m2)，中间为基质蛋白(m1)，内为核衣壳，呈螺旋状对称，直径为 10nm。在病毒感染过程中，ha为三聚体结构，可以识别并结合细胞膜表面唾液酸(sa)受体，和使病毒囊膜与内吞体膜融合，在病毒吸附细胞和穿膜过程中起重要作用。ha的前体是ha0，经蛋白酶裂解后变成ha1和ha2两条链，产生n端融合肽，促进病毒囊膜与内吞体膜融合。ha受体结合区(rbd)位于三聚体顶端的球形结构域，与宿主
细胞表面sa结合。
[0035]
本发明先通过分子生物学方法得到h9n2亚型禽流感病毒的ha序列，然后通过体外转录的方法合成mrna，实现对h9n2亚型禽流感病毒的免疫。整个mrna疫苗生产中不依赖细胞的扩增，仅根据基因测序即可快速开展疫苗研发，大大缩短了生产时间，能够很容易实现量产，提高疫苗的产能，可快速应对大范围的传染病。同时mrna疫苗仅含病毒的遗传物质片段，不会使人感染病毒，可以诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，通过多种机制保护机体，保护效率更高。
[0036]
本发明完成了h9n2亚型禽流感病毒mrna疫苗安全性和免疫效力的评估：首先安全性评价包括疫苗注射spf鸡胚后观察鸡胚生长发育状况，注射spf雏鸡后观察是否出现局部或全身不良反应和疫苗注射部位吸收情况；然后免疫效力评价包括hi试验测定血清抗体水平、elispot试验检测细胞因子ifn-γ表达水平、荧光定量pcr试验检测咽拭子和组织载毒量、he染色观察肺脏病理组织变化。结果显示，本发明提供的mrna疫苗免疫效果好，安全性高。
附图说明
[0037]
图1为mrna疫苗作用机制图；
[0038]
a，疫苗结构，b，疫苗作用原理；
[0039]
图2为mrna疫苗结构示意图；
[0040]
图3为h9n2亚型禽流感病毒的ha全长电泳图；
[0041]
1：dl-5000dna marker；2：ha全长；
[0042]
图4为pvax1-ha重组质粒电泳鉴定结果；
[0043]
图5为mrna转染df-1和hek293ft细胞western blot图；
[0044]
1：marker；2：mrna转染df-1细胞；3：mrna转染293-ft细胞；4： df-1细胞空白对照；5：293-ft细胞空白对照；
[0045]
图6为低温透射电镜下lnp形态；
[0046]
图7为lnp动态光散射分析；
[0047]
图8为凝胶阻滞结果；
[0048]
1：marker；2：lnp；3：mrna，4：lnp-mrna；
[0049]
图9为鸡胚注射疫苗后形态观察图；
[0050]
1：空白对照；2：lnp；3：低剂量mrna疫苗(10μg mrna)；4：高剂量mrna疫苗(15μg mrna)；
[0051]
图10为特性异性抗体滴度；
[0052]
图11为elispot检测免疫后脾淋巴细胞状态；
[0053]
图12为elispot检测免疫后外周血淋巴细胞状态；
[0054]
图13为elispot检测免疫后脾淋巴细胞(a)和外周血淋巴细胞(b)分泌细胞因子ifn-γ数量；
[0055]
图14为本发明的攻毒保护试验中体重变化图；
[0056]
图15为本发明的攻毒保护试验中咽拭子及部分组织病毒载量图；
[0057]
a，咽部载毒量变化，b，肺载毒量变化，c，气管载毒量变化，d，十二指肠载毒量变
id no.2。
[0077]
实施例4
[0078]
进行转染的hek293ft和df-1细胞要求将复苏细胞传代3-4次后，观察到细胞状态良好，生长速度稳定，然后将细胞传到六孔板中，密度到60-70％可以开始转染。将获得的mrna转染hek293ft和df-1细胞，具体操作步骤为：用灭菌离心管制备转染液。以六孔板为例，a液：用200μl dmem培养基稀释4μg mrna；b液：用200μl dmem培养基稀释5μl lipo2000，分别将a液、 b液轻轻混匀，静置5min，吸取a液加入至b液中，用移液枪轻轻混匀，室温静置20min；吸去培养皿中的培养基，用pbs清洗一次；每孔缓慢滴加等量的转染试剂，4h后，更换成dmem完全培养基，继续培养24-48h。细胞转染完毕后需要裂解细胞并提取其蛋白进行western blot检测。检测结果参见图5。
[0079]
电泳转膜封闭后进行抗体孵育，一抗为高免血清，二抗为hrp标记的山羊抗鸡抗体。
[0080]
实施例5脂质体纳米颗粒(lnp)制备与检测
[0081]
选择dotap、dspc、dspe-mpeg2000、胆固醇为制备lnp的材料，选择薄膜水化法制备完成，具体步骤如下：(1)按摩尔比dotap∶dspc∶胆固醇∶dspe-mpeg2000＝34∶13∶14∶1称量后加入5ml三氯甲烷中，超声使其充分溶解；(2)将溶液倒入旋蒸仪圆底烧瓶中，转速为8rpm，打开水浴锅至40℃，调整茄形瓶底浸入至水浴锅，2h除去氯仿，纳米脂质体在茄形瓶壁上形成一层薄膜；(3)取出茄形瓶，加入预热的去钙去镁d-pbs缓冲液进行40倍稀释，在50℃水浴超声1h，得到纳米脂质体溶液；(4)加入50kd超滤管中，室温下2000rpm离心5-30min，取出超滤管，将管底部液体倒出，并用移液枪吸取管中液体冲洗滤膜2-3次；(5)将剩余液体加入重复第(4)步，直至溶液全部浓缩至1ml，吸出超滤管中液体过0.45μm滤膜三次和0.22μm滤膜五次，除去杂质和菌，4℃保存。
[0082]
lnp粒子形态：用反向镊子将碳支持膜的铜网固定好，将制备好的lnp溶液吸取10μl缓慢滴加到铜网上，室温等待30min即可。低温透射电子显微镜 (cryo-tem)下观察样品形态。见图6。
[0083]
lnp粒径：使用马尔文动态光散射粒度仪测量制备完成的纳米脂质体颗粒的粒径，采用动态光散射法。散射光强度代表该粒径颗粒的数量，可以得到样品的粒度分布，结合nibs光学器件可增强对聚集体的检测。见图7。
[0084]
实施例6mrna组装与检测
[0085]
lnp与mrna包封及凝胶阻滞检测：lnp不会随着电荷迁移，所以将 mrna和lnp自组装后，mrna也应当不会随着电荷在琼脂糖凝胶内迁移，因此凝胶阻滞试验是检查疫苗包封率的指征之一。
[0086]
制备用递送系统lnp包被的mrna，按照n∶p＝lnp∶mrna＝10∶1的摩尔比计算所需体积，在depc水处理过的灭菌离心管中按照比例将lnp与mrna 吹打混合，静置30min，lnp与mrna自组装形成试验所需的mrna-lnp。
[0087]
将lnp、mrna-lnp、mrna用rna buffer按照5∶1的体积比吹吸混合均匀后依次加入琼脂糖凝胶的孔中，第一孔道加marker，电泳30min，凝胶成像仪红外灯下观察lnp包裹mrna的效果。见图8。
[0088]
包封率检测：mrna-lnp浓度为c0＝0.1μg/μl，将分别其置于depc处理过的超滤管
(50kd)，低温离心机4℃、2000rpm离心15min，未组装的 lnp和mrna将会离心至底部，将超滤至底部的废液置于紫外分光光度计测量 rna浓度c1，所有实验重复三次。包封率检测公式如下：r＝c0-c1/ c0
×
100％，r为包封率。通过检测，c0＝0.1ug/ul，超滤后rna浓度c1＝3.536 ng/ul，r＝(c0-c1)/c0
×
100％＝96.46％
[0089]
实施例7
[0090]
用200μl dmem培养基稀释实施例3制备的纯化后的4μg mrna，得到疫苗。spf鸡胚尿囊腔(as)接种0.2ml疫苗，放置孵化器中孵化7d，24h 内死亡鸡胚不计。7d后打开所有鸡胚(包括24h后死亡鸡胚)进行解剖观察，鸡胚发育正常如图9所示，疫苗注射鸡胚24h内无死亡，7d后，蛋壳形态正常，气室大小正常，打开观察鸡胚发育正常，可明显看到眼、尾、四肢，颈伸长，血管分布广，尿囊液ha为阴性，检验疫苗样品合格。
[0091]
实施例8
[0092]
本实施例中，将制备的h9n2亚型禽流感病毒的mrna疫苗分别在第1天和第21天肌肉注射接种三周龄spf雏鸡，每7天取一次血清，检测血清中抗 ha蛋白特异性抗体的滴度。
[0093]
1.在血凝板1-11孔中分别加入25μl生理盐水，在第12孔中加入50μl生理盐水，将待检血清编号标记在血凝板上；
[0094]
2.在每行第1孔中加入25μl待检血清，将第1孔中液体反复吹吸6-8次后吸出25μl至第2孔中，注意不要产生气泡，反复吹吸6-8次后吸出25μl至第 3孔，按同样的方法倍比稀释至第10孔，第10孔吹吸混匀后吸出25μl弃掉，第11孔设为抗原对照，第12孔设为红细胞对照；
[0095]
3.从第11孔开始，从右向左依次加入配好的4单位抗原25μl，加好后轻轻震荡，室温静置30min；
[0096]
4.将1％鸡红细胞悬液摇匀倒入加样槽，从第12孔开始依次悬空加入25 μl 1％鸡红细胞悬液，用手轻扣混匀，室温下静置25min后读数；
[0097]
5.将血凝板倾斜45
°
读数，第12孔红细胞下滑，第11孔完全凝集，试验成立。以完全下滑孔的最高稀释倍数为该血清的抗体效价。
[0098]
结果如图10，显示mrna疫苗和灭活疫苗特异性抗体在初免后第1周出现，在第3周加强免疫后显著增加，高剂量25μg免疫的mrna疫苗的抗体与全病毒灭活疫苗水平相当，而placebo组则未检测到特异性抗体反应。四批疫苗10 μg mrna、15μg mrna、25μg mrna、灭活疫苗组均使spf鸡产生了抗体，抗体滴度分别为1∶64、1∶256、1∶2048和1∶1024，具有强免疫能力。
[0099]
实施例9
[0100]
本实施例中，首先制备h9n2 ha原核重组蛋白：构建pet32a-ha原核重组质粒，方法同实施例1-2，然后将构建好的质粒转入bl21大肠杆菌中表达， sds-page电泳后考马斯亮蓝染色然后观察蛋白表达情况。然后将菌液过夜培养按1％接种量接入200ml lb培养基中，37℃和200rpm下培养至 od600＝0.6-0.8，添加iptg最终浓度为0.1mmol
·
l-1，37℃继续培养6h，8000 rpm离心10min收集菌体，pbs重悬洗涤2次，然后用菌体∶pbs＝1∶10的比例重悬菌体并超声破碎15min(功率40w，超声4s，间歇6s)，4℃离心10 min，10000rpm，使包涵体蛋白与可溶性蛋白分离，确定蛋白大部分在包涵体内表达，收集沉淀。然后使用his标签蛋白纯化试剂盒(包涵体蛋白)纯化得到的包涵体蛋白，sds-page电泳后考马斯亮蓝染色30min
观察纯化效果，得到纯化后的目的蛋白，为ha原核蛋白，-80℃冰箱保存。
[0101]
以制备的ha原核蛋白为特异性抗原刺激物，以cona刀豆蛋白a为阳性对照组刺激物，dmso为阴性对照组刺激物，分析特异性抗原蛋白刺激下产生的ifn-γ细胞数目，斑点数目越多，说明分泌ifn-γ的淋巴细胞数目越多。
[0102]
1.每孔加入15μl的35％乙醇预湿最多1min，注意枪头应靠在孔壁接近孔底处加液，注意枪头不要刺到pvdf膜，未润湿pvdf膜是洁白、不透明的，经乙醇润湿后，颜色变暗，呈半透明状；
[0103]
2.洗涤：每孔加入200μl去离子水，洗涤5min，除去预湿用的乙醇；
[0104]
3.包被：每孔加入用pbs稀释为15μg/ml的mt6c2抗体100μl，4℃包被过夜；
[0105]
4.封闭：弃掉包被液，每孔200μl无菌pbs洗涤5次，每孔加入200 μl1640完全培养基，室温培养至少30min；
[0106]
5.取出培养基，加入5μl刺激物，一般为纯化的蛋白，阴性对照为相同浓度的二甲亚砜(dmso)，阳性对照一般为一定浓度的刀豆蛋白(cona：5-10 μg/ml)；然后加入195μl细胞悬液，然后将96孔板放入含5％co2的37℃培养箱中，培养48h，期间不要移动平板，用铝箔包裹平板避免蒸发；
[0107]
6.取出细胞，每孔加200μl pbs洗涤5次，用pbs-0.5％fcs将检测抗体 (mt7c-生物素)稀释至1μg/ml，每孔加入100μl，室温培养2h；
[0108]
7.取出抗体，每孔加200μl pbs洗涤5次。每孔加入(1∶500)-(1∶ 1000)稀释度的100μl二抗(辣根过氧化物酶)，室温培养1h；
[0109]
8.取出抗体，每孔加200μl pbs洗涤5次。每孔加入100μl的显色底物 tmb，直至出现明显斑点，注意避光；
[0110]
9.加入超纯水洗涤两遍停止显色，吸水纸上倒扣板拍干孔中水，然后室温避光让盘子晾干，计数斑点。
[0111]
结果如图11-图13，显示在脾淋巴细胞中，疫苗接种组的ifn-γ分泌量均极显著高于placebo组；在外周血淋巴细胞中，灭活疫苗组的ifn-γ分泌量显著高于placebo组，mrna疫苗各剂量组的ifn-γ分泌量均极显著高于placebo组。
[0112]
实施例10
[0113]
病毒感染机体后产生的免疫反应可以评价疫苗的免疫效果，本实施例在免疫后第49d用2
×
107eid50的h9n2滴鼻点眼感染注射过mrna疫苗和灭活疫苗的spf鸡，采集攻毒后第1、3、5、7、9、11、13d的咽拭子和血清检测载毒量和特异性抗体水平，称量攻毒后雏鸡体重变化，然后处死spf鸡，解剖后摘取肺、气管、腺胃、十二指肠等组织，检测各组载毒量，he染色观察肺部病理组织学变化。
[0114]
测量攻毒前各组spf鸡体重，攻毒后每隔一天测量一次各组spf鸡体重，分析攻毒对各组鸡体重变化的影响。结果如图14所示，攻毒后将spf鸡称重，空白组攻毒后体重明显减少，疫苗组体重无明显波动，大致呈增加趋势。
[0115]
采集咽拭子，荧光定量pcr检测攻毒后咽部载毒量变化，通过graphpadprism 7.0的t检验进行统计分析。如图15a所示，与placebo组相比，疫苗免疫组病毒载量极显著下降。15μg mrna疫苗组和25μg mrna疫苗组的感染后的13d，咽拭子中未检测到病毒。10μg mrna疫苗组感染后13d咽部与 placebo组相比病毒载量降低了约85％。
[0116]
攻毒后的spf鸡解剖后取肺(图15b)、气管(图15c)、十二指肠(图 15d)、腺胃(图15e)组织，qpcr检测载毒量变化，通过graphpad prism 7.0 的t检验进行统计分析。*p＜0.05，表示差异具有显著的统计学意义； **p＜0.01，表示差异具有极显著的统计学意义。由图可见，肺脏中15μgmrna疫苗组、25μg mrna疫苗组和灭活疫苗组病毒载量均极显著低于 placebo组；气管中与placebo组相比，15μg mrna疫苗组和灭活疫苗组病毒载量显著下降，25μg mrna疫苗组病毒载量极显著下降；十二指肠中与 placebo组相比，10μg mrna疫苗组病毒载量显著下降，15μg mrna疫苗组、 25μg mrna疫苗组和灭活疫苗组病毒载量极显著下降；腺胃中疫苗组均极显著低于placebo组。
[0117]
肺脏经过多聚甲醛固定脱水后进行he染色，如图16所示，placebo组 (e)可见组织整体淤血明显；少量肺泡壁增厚，肺泡大小不一，组织可见明显淋巴细胞浸润及少量中性粒细胞浸润。灭活疫苗组(a)可观察到少量出血点；10μg mrna疫苗组(b)肺组织中可观察到少量炎症细胞浸润，15μgmrna疫苗组(c)和25μg mrna疫苗组(d)未见明显病理组织学改变。
[0118]
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0119]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
技术特征：1.一种h9n2亚型禽流感病毒mrna疫苗的制备方法，其特征在于，包括：以h9n2亚型禽流感病毒ha全长为模板，经过pcr扩增得到扩增产物；扩增产物连接入pvax1质粒，构建了pvax1-ha重组质粒；反向pcr线性化重组质粒，带有t7启动子的线性化质粒在t7 rna聚合酶作用下体外转录后得到目的片段mrna；通过牛痘病毒加帽系统和poly(a)聚合酶进行mrna修饰，得到mrna疫苗。2.根据权利要求1所述的h9n2亚型禽流感病毒mrna疫苗的制备方法，其特征在于，pcr扩增所用引物为：上游引物h9n2 ha p1：5
’‑
gggagacccaagctggctagcatggaagtagcatcactaataactatact-3’；下游引物h9n2 ha p2：5
’‑
tccgagctcggtaccaagcttttatatacaaatgttgcatctgcaagc-3’。3.根据权利要求1所述的h9n2亚型禽流感病毒mrna疫苗的制备方法，其特征在于，pvax1质粒以及重组质粒酶切位点均是nheⅰ、hindⅲ；反向pcr得到线性化质粒的引物序列如下：pvax1-ha p1：5
’‑
ttatatacaaatgttgcatctgcaaga-3’；pvax1-ha p2：5
’‑
atggaagtagcatcactaataactatactactag-3’。4.根据权利要求1所述的h9n2亚型禽流感病毒mrna疫苗的制备方法，其特征在于，将纳米脂质体与修饰后的mrna自组装后制备成粒子形态的mrna疫苗。5.根据权利要求1-4任一项所述的制备的h9n2亚型禽流感病毒mrna疫苗。6.一种针对h9n2亚型禽流感病毒的mrna疫苗的抗原，其特征在于，所述抗原是ha原核蛋白，其抗原氨基酸序列如seq id no.1所示。7.一种用于制备针对h9n2亚型禽流感病毒的疫苗的mrna，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.2所示。8.一种与权利要求7所述的mrna互补的dna，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.3所示。9.一种包含权利要求7所述的mrna的载体。10.一种权利要求7所述的mrna在制备针对h9n2亚型禽流感病毒的疫苗中的应用。
技术总结本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗及制备方法与应用。具体涉及H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗的制备和安全性和免疫效力的评估。本发明所述H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗安全有效，可以在SPF鸡体内诱发强烈的体液免疫以及细胞免疫应答，作为一种新型疫苗在应对H9N2禽流感疫情时有良好的前景。有良好的前景。有良好的前景。
技术研发人员：阮文科 张博文 徐胜奎 姚劼林 夏婷
受保护的技术使用者：北京农学院
技术研发日：2022.06.27
技术公布日：2022/11/1
