dznep联合il-6抗体在制备抑制肝细胞癌肿瘤药物中的应用
技术领域
1.本发明属于医学生物工程领域，具体涉及dznep联合il-6抗体在制备抑制肝细胞癌肿瘤药物中的应用。
背景技术：2.目前，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc)是全球第四大癌症相关死亡原因，也是全球第五大最常见的癌症。由于其异质性以及对放化疗的不敏感，hcc的有效治疗手段仅限于疾病早期的局部消融、手术切除或是肝移植，对于晚期hcc患者来说，缺乏有效的治疗手段。自从2007年索拉非尼被批准为晚期肝癌患者的一线小分子靶向药物以来，分子靶向治疗对肝癌治疗的策略产生了深远的影响，成为肝癌治疗研究的热点。2017年，雷戈非尼是首个获得fda批准的用于治疗hcc的二线药物。随后，两种pd-1抑制剂nivolumab和pembrolizumab，两种酪氨酸激酶抑制剂lenvatinib和cabozantinib以及单克隆抗体ramucirumab均已获得fda批准应用于临床。但是，这些药物均未显示出明显的临床获益。
3.目前，研究人员正尝试分子靶向药物的联合治疗研究，来弥补单种药物的不足，以期达到更好的协同效果，这成为hcc治疗研究的新方向。zeste同源物2增强子(enhancer of zeste homolog 2,ezh2)作为组蛋白甲基转移酶，是prc2的催化亚基，在诱导组蛋白h3赖氨酸27(h3k27me3)的三甲基化和基因沉默中起重要作用。大量研究表明，ezh2的病理激活是在某些癌症模型中观察到的常见改变之一，并通过影响转录程序来调节疾病进展。一系列实验研究证实了ezh2作为治疗靶点，3-deazaneplanocin a(dznep)抑制ezh2已成为癌症表观遗传治疗的新选择。dznep作为最有效的s-腺苷高半胱氨酸(adohcy)水解酶抑制剂之一，影响组蛋白赖氨酸甲基转移酶活性。它是广泛使用的h3k27me3甲基转移酶抑制剂之一，用于抗癌和其他非肿瘤性疾病，如肝纤维化、肾i/r损伤和前列腺炎治疗开发然而，目前为止关于ezh2抑制剂对原发性hcc的治疗效果以及相关的作用机制，鲜有报道。
4.白细胞介素6(il-6)参与各种生理和病理生理过程。il-6的失调和增加的活性实际上可以在炎症、再生和肿瘤发展中发现。在肝细胞或白细胞上，il-6最初与il-6受体(il-6r)结合，然后il-6/il-6r复合物与糖蛋白130kda(gp130)结合，信号转导β亚基，产生六聚体信号复合物，已被描述为“经典信号”。已知il-6可激活许多细胞信号通路级联，包括mapk、pi3k/akt、jak/stat和src/yap信号通路。近年来，各种联合靶向治疗策略在临床前研究中不断探索，并逐渐应用于临床治疗。大量研究报道，il-6阻断剂联合其他药物可在不同癌症模型中获得有益结果。
技术实现要素：5.为解决肝细胞癌治疗效果差的难题，本发明提供一种新的治疗策略，用于抑制肝细胞癌的肿瘤进展。
6.具体技术方案如下：
7.本发明提供ezh2抑制剂联合il-6抗体在制备肿瘤抑制药物中的的应用。
8.具体的，所述ezh2抑制剂优选为dznep，即3-deazaneplanocin a。dznep的分子式是c
12h14
n4o3。dznep的分子量是262.269g/mol。dznep的cas号是120964-45-6。购买自selleck公司。
9.il-6抗体购自bioxcell公司，cat#:be0046。
10.所述肿瘤为ezh2高表达的肿瘤，为乳腺癌、胶质瘤、宫颈癌、胃癌、黑色素瘤、肺癌或肝癌。
11.本发明重点提供dznep联合il-6抗体在制备抑制肝细胞癌肿瘤药物中的的应用，尤其是原发性肝细胞癌肿瘤。
12.具体的，二者使用的有效dznep与il-6抗体联合使用的重量比为1：1-1：20。
13.优选1：10。
14.当然，除两种有效成分外，还包括药学上常用的载体或助剂。
15.本发明证实了在小鼠原发性hcc模型中dznep对hcc的治疗效果，il-6抗体对hcc的治疗效果。同时，我们在小鼠hcc模型中证实了ezh2联合il-6抗体的治疗效果比单一使用一种有效成分要有显著提高，这些研究为hcc提供了一种有效的联合治疗策略。
附图说明
16.图1是正常肝组织和hcc肝组织的western印迹分析结果，证明在hcc组织中ezh2的蛋白表达显著增加。
17.图2是dznep治疗策略图
18.图3是dznep治疗的肝脏肉眼观察图
19.图4是dznep治疗的肿瘤负荷参数图，包括肝脏重量与体重(lw/bw)比值、脾脏与体重(sw/bw)比值，肿瘤数量和最大肿瘤直径
20.图5是对照组、dznep、antiil-6ab和联合治疗组药物治疗策略
21.图6是对照组、dznep、antiil-6ab和联合治疗组的肝脏肉眼观察图
22.图7是对照组、dznep、antiil-6ab和联合治疗组的肿瘤负荷参数图，肝脏重量与体重(lw/bw)比值、脾脏与体重(sw/bw)比值，肿瘤数量和最大肿瘤直径
23.图8是对照组、dznep、antiil-6ab和联合治疗组的生存时间图
24.图9是对照组、dznep、antiil-6ab和联合治疗组的体重对比图
具体实施方式
25.具体实施方式：
26.实施例1：通过构建小鼠原发性hcc模型来检测dznep对肝细胞癌的影响。
27.1.1小鼠原发性hcc模型的构建及组织取材
28.(1)水动力法转染基因的方法诱导小鼠原发性hcc模型
29.1)配制质粒溶液：将c-myc/n-ras/sb三种质粒以质量比为1:19:2的比例溶解到无菌的1
×
pbs溶液中，混合质粒的浓度为11μg/ml；所述pt3-ef1a-c-myc,pt/caggs-nras-v12,pcmvsb11三种质粒为浙江大学龚渭华教授课题组惠赠。
30.2)尾静脉注射质粒：根据小鼠体重，质粒溶液按100ml/kg/只的量进行尾静脉注射。将小鼠安置于静脉可视小鼠尾注固定器内，在5-7秒内快速将质粒溶液注射入小鼠体
内，质粒溶液注射后小鼠会出现心跳加速、状态萎靡的现象，小鼠状态恢复后将小鼠放入笼内继续饲养。
31.(2)组织取材
32.1)将小鼠麻醉后称重，首先打开胸腔，切断上腔静脉，收集富集于胸腔内的血液。
33.然后开腹，切取肝脏和脾脏；
34.2)将肝脏和脾脏用生理盐水进行清洗，然后用吸水纸吸干表面水分，进行拍照留取大体标本图像，然后进行称重、计数肝脏表面的肿瘤结节数量、选取最大肿瘤结节测量其直径；
35.3)留取新鲜组织：将肝脏组织分别保存至o.c.t.复合物、4％多聚甲醛溶液及液氮中，后续处理后保存待用。
36.1.2药物治疗方案
37.dznep单药治疗时的用药方案：对照组小鼠(6只)：质粒转染后第14、16、18、20、22天时腹腔注射载体溶液；dznep治疗组小鼠(6只)：质粒转染后第14、16、18、20、22天时腹腔注射dznep(1mg/kg)溶液。
38.1.3用he染色的方法观察肝脏的病理变化
39.1)小鼠肝组织在4％多聚甲醛溶液内固定24小时，将肝组织取出，于1
×
pbs溶液内浸泡不少于24小时；
40.2)脱水：将肝组织从1
×
pbs中取出，在75％乙醇溶液内浸泡2次，每次15分钟；然后在95％乙醇溶液内浸泡3次，每次20分钟；最后在无水乙醇内浸泡2次，每次60分钟；
41.3)透明：将脱水后的肝组织于二甲苯中浸泡2次，每次20分钟；
42.4)浸蜡：选熔点分别为45℃至50℃的软蜡和55℃至60℃的硬蜡。先将组织在软蜡中浸泡2次，每次1小时；然后将组织完全浸在硬蜡中2次，每次1小时；
43.5)包埋切片：将标本放置于含蜡块的硬具中冷却，并形成蜡块；用切片机连续切取厚4um的组织切片；
44.6)脱蜡：将切片于二甲苯中浸泡2次，每次10分钟；然后将切片依次在无水乙醇，95％乙醇以及75％乙醇内各浸泡2次，每次3分钟；
45.7)先用去离子水洗2遍，每次5分钟；然后用苏木精染色5分钟，再用流水冲洗10分钟；然后将切片于氨水内放置3秒，用ddh2o进行冲洗；用伊红染色1-3分钟，然后再用ddh2o冲洗；
46.8)脱水：将切片先于95％乙醇溶液内浸泡2次，每次3分钟，然后于无水乙醇内浸泡2次，每次2分钟，最后于二甲苯内浸泡2次，每次15分钟；
47.9)将切片放于室温干燥，用中性树脂将盖玻片封片，待凝固后显微镜下观察。
48.1.4蛋白免疫印迹(western blot)观察肿瘤中ezh2的表达量
49.(1)肝组织蛋白提取
50.1)称取100mg左右的肝脏组织用冷1
×
pbs洗涤2-3次，除去血凝块及其他杂质；
51.2)配制组织裂解液：按20mg/200ul的浓度配制ripa组织裂解液，使用前在ripa组织裂解液内加入蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂并混匀，放于冰上；
52.3)向肝组织中加入0.5ml组织裂解液，于组织匀浆仪中进行匀浆，然后将匀浆液置于冰上30分钟，间断颠倒混匀，然后于4℃离心机内15000rpm离心30分钟，取上清；
53.4)向上清内加入4倍体积的5
×
上样缓冲液，然后放置于金属盂内进行煮样，设置温度为100℃，时间为15分钟。收集蛋白样本，将其贮存于-20℃冰箱内。
54.(2)蛋白免疫印迹(western blot)
55.(1)聚丙烯酰胺凝胶的配制：配制相应浓度的分离胶溶液，将胶板固定于配胶架上，将分离胶溶液倒入胶板间的空隙，上部留出约2cm左右的空间，然后再分离胶溶液上部加入蒸馏水压线，静置到分离胶完全凝固，此期间配制浓缩胶溶液。分离胶溶液凝固后，将蒸馏水吸净，加入浓缩胶溶液至间隙完全填满，立即插入梳子，待浓缩胶溶液完全凝固后，将梳子拔除收胶，将其保存在4℃冰箱中；
56.(2)电泳分离：将凝胶正确安装在电泳槽上，向电泳槽中加入1
×
running buffer，内槽内须加满，外槽加至过白线。蛋白样本加至凝胶槽内，先设置恒压80v电泳跑胶，待蛋白样品跑入分离胶后，改为恒压120v电泳跑胶，至溴酚蓝完全跑出分离胶后停止；
57.(3)转膜：先将pvdf膜于甲醇中浸泡10秒将其激活。向托盘中倒入1
×
transfer buffer，从上往下按黑面夹子-纤维垫-3层滤纸-凝胶-pvdf膜-3层滤纸-纤维垫-白面夹子的顺序放好，充分除去各层次之间的气泡，压紧，夹好。对应好正负极插入转膜槽内，向转膜槽内放入两个冰袋，然后倒满预冷1
×
transfer buffer，在将整个转膜系统放入冰水中，以恒流400ma进行转膜，时间为90分钟；
58.(4)封闭：配制封闭液(含5％bsa的tbst溶液)，将转好的pvdf膜放入其中，在4℃条件下摇床上封闭至少1小时；
59.(5)孵育抗体：以封闭液配制一抗溶液(根据抗体说明书配制)，将pvdf膜置于一抗溶液中，4℃下置于摇床上孵育过夜。然后用1
×
pbst或1
×
tbst于摇床上摇洗3次，每次10分钟。将洗液吸净后，加入以封闭液配制的二抗溶液(根据抗体说明书配制)，4℃条件下置于摇床上孵育2小时。1
×
pbst或1
×
tbst于摇床上洗3次，每次10分钟；
60.(6)显影：先将ecl显色液i、ii混匀，将pvdf膜放入显色液中进行反应，然后吸净多余显色液，用保鲜膜将pvdf膜覆盖好并压平，放入暗匣内。用压片机器进行显影，根据pvdf膜上荧光的强弱选择合适的显影时间。
61.1.5实验结果
62.为了评估hcc中ezh2的表达水平，我们通过流体动力学尾静脉注射(htvi)的方法建立了hcc小鼠模型。质粒(c-myc/n-ras)结合睡美人转座酶被注入血液循环，并将基因组转基因整合到肝脏中。我们在htvi后6周处死小鼠，并获得hcc组织。western印迹分析表明，与正常肝组织相比，hcc组织中ezh2的蛋白表达显著增加，见附图1。因此，我们证实ezh2在hcc中过表达。
63.为了验证ezh2抑制剂在体内对hcc的治疗效果，我们再次构建了小鼠hcc模型，并在构建过程中进行了ezh2抑制剂dznep治疗。药物治疗策略如图2所示。在htvi后6周处死小鼠。分析了dznep治疗组和对照组之间的肿瘤负荷参数。肉眼检查结果表明，与对照组相比，dznep治疗显著抑制了hcc进展(图3)。同时，与对照组相比，dznep治疗显著降低了肝脏重量与体重(lw/bw)比值(p＝0.0141)、脾脏与体重(sw/bw)比值(p＝0.0429)。与对照组相比，dznep治疗组的肿瘤数量(p＝0.0272)和最大肿瘤直径(p＝0.0242)也显著降低(图4)。总之，这些结果表明ezh2的表达水平在hcc中显著增加，dznep显著抑制了原发性hcc小鼠模型中的hcc进展。
64.实施例2：dznep联合il-6抗体治疗对肝细胞癌肿瘤进展的影响
65.2.1小鼠原发性hcc模型的构建及组织取材方法同前(1.1)
66.2.2药物治疗方案
67.dznep联合il-6抗体联合治疗时的用药方案：对照组小鼠(6只)：质粒转染后第14、16、18、20、22天时腹腔注射载体溶液，质粒转染后第17、19、21天时腹腔注射igg2b蛋白(200μg，2mg/ml)；dznep治疗组小鼠(6只)：质粒注射后第14、16、18、20、22天时腹腔注射dznep(1mg/kg)，质粒转染后第17、19、21天时腹腔注igg2b蛋白(200μg，2mg/ml)；il-6抗体治疗组小鼠(6只)：质粒转染后第17、19、21天时腹腔注射il-6抗体(200μg，2mg/ml),质粒注射后第14、16、18、20、22天时腹腔注射等体积的载体溶液；联合治疗组小鼠(6只)：质粒转染后第14、16、18、20、22天时腹腔注射dznep(1mg/kg)，质粒注射后第17、19、21天时腹腔注射il-6抗体(200μg，2mg/ml)。
68.2.3用he染色的方法观察肝脏的病理变化，方法同前(1.3)
69.2.4实验结果
70.il-6作为一种重要的炎性细胞因子与hcc的进展密切相关。同时，它已被确定为一系列疾病模型中促进mapk信号通路的关键因素。因此，我们研究了ezh2抑制联合il-6/il-6r轴阻断是否可以在hcc中获得更好的治疗效果。
71.如上所述，我们建立了原发性hcc小鼠模型，药物治疗策略如图5所示。在htvi后6周时处死小鼠。分析对照组、dznep、antiil-6ab和联合治疗组的肿瘤负荷参数。肉眼检查结果显示，与对照组相比，dznep和anti-il-6ab治疗组均显著抑制了hcc的进展，联合治疗组获得了最显著的抑制效果(图6)。同时，dznep和anti il-6ab治疗显著降低lw/bw比值(dznep治疗p＝0.0224，抗il-6ab治疗p＝0.0491)，sw/bw比值(dznep治疗p＝0.0352，抗-il-6ab治疗p＝0.0713)与对照组相比，联合治疗与对照组相比表现出最大的降低效果(lw/bw比值p＝0.0002，抗il-6ab治疗p＝0.0001)。dznep(肿瘤数p＝0.0004，最大肿瘤直径p＝0.0334)和抗il-6抗体(肿瘤数p＝0.0011，最大肿瘤直径p＝0.1732)治疗组的肿瘤数和最大肿瘤直径也显著降低，与对照组相比，联合治疗组与对照组相比显示出最大的抑制效果(肿瘤数量p《0.0001，最大肿瘤直径p＝0.0003)(图7)。此外，生存分析显示，对照组、dznep、抗il-6ab和联合治疗组的中位生存时间分别为58.50
±
2.739、75.88
±
3.838、74.50
±
3.576和98.75
±
7.485天。
72.总体而言，与对照组的生存时间相比，dznep(p＝0.0024)和抗il-6ab(p＝0.0032)治疗组的生存时间显著延长，联合组的生存时间增加最为显著(p＝0.0002)(图7)。同时，为了研究药物治疗的安全性和毒性，在给药过程中测量了小鼠的体重。结果表明，四个治疗组的体重不受药物治疗的显著影响(图8)。总之，这些结果表明ezh2抑制和抗il-6ab的联合治疗有效地抑制了hcc进展。
73.以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
技术特征：1.ezh2抑制剂联合il-6抗体在制备抑制肿瘤药物中的应用。2.权利要求1所述的应用，其特征在于：所述ezh2抑制剂为dznep。3.权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为ezh2表达高的肿瘤。4.权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肿瘤选自乳腺癌、胶质瘤、宫颈癌、胃癌、黑色素瘤、肺癌或肝癌。5.权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为肝细胞癌。6.权利要求6所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为原发性肝细胞癌。7.权利要求2所述的应用，其特征在于：dznep与il-6抗体联合使用的重量比为1：1-1：20。8.权利要求7所述的应用，其特征在于：dznep与il-6抗体联合使用的重量比为1：10。9.权利要求1-8任一项所述的应用，其特征在于：还包括一种或多种常规的药学上可接受的辅料或载体。
技术总结本发明属于医学生物工程领域，具体涉及DZNep联合IL-6抗体在制备抑制肝细胞癌肿瘤药物中的应用。本发明证实了在小鼠原发性HCC模型中EZH2抑制剂DZNep联合IL-6抗体的治疗效果比单一使用任一种有效成分要有显著提高，为HCC提供了一种有效的联合治疗策略。HCC提供了一种有效的联合治疗策略。HCC提供了一种有效的联合治疗策略。
技术研发人员：刘晨 宋天强 张伟 程侠卫
受保护的技术使用者：天津市肿瘤医院（天津医科大学肿瘤医院）
技术研发日：2022.07.15
技术公布日：2022/11/1
