对bcma特异的抗体及嵌合抗原受体
技术领域
1.本发明涉及与新bcma特异结合的蛋白，更详细地，涉及bcma结合蛋白、对其进行编码的核酸、包括其的细胞以及包括上述细胞的具有抗癌效果的组合物。
背景技术：2.对癌症治疗，尤其对血液肿瘤(hematological malignancy)显出卓越效果的修饰t细胞疗法(modified t cell therapy)是利用以通过靶向分子特异方式与肿瘤细胞特异结合而可杀灭该细胞的方式转基因的t细胞的癌症治疗方法。这种靶向通常将编码嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)的重组dna分子导入来源于患者的t细胞而实现。car是包括细胞外靶向结构域(extracellular targeting domain)、跨膜结构域(transmembrane domain)及一个以上的细胞内信号传递结构域(intracellular signaling domain)的合成受体。大部分的情况下，细胞外靶向结构域由对指定的肿瘤相关抗原(taa：tumor-associated antigen)等靶向分子特异的抗体的单链fv片段(scfv)构成。细胞外靶向结构域使car具有对于肿瘤的特异性，细胞内信号传递结构域在car的靶向分子结合时激活t细胞，这些转基因的t细胞重新注入到癌症患者身上，与表达car的靶向分子的细胞特异结合而杀灭该细胞。
3.报告血癌的car-t治疗效果的临床研究，大部分涉及b细胞恶性肿瘤的治疗，其对cd19或cd20进行靶向处理。虽然car-t细胞疗法凸现为有效的疗法，但是在car信号传递的最优化、靶向抗原的最优化、细胞制造方法的最优化、安全性的提高、用于提高car-t细胞的治疗潜力的组合战略的最优化等多个方面上依然存在改善的余地。
4.多发性骨髓瘤(multiple myeloma，mm)是以克隆浆细胞(clonal plasma cells)的蓄积为特征的癌症。mm是在血癌中第二个出现多的癌，mm导致的死亡在整个癌症引起的死亡当中占2％。mm是在患者之间出现的特性不均匀的疾病，攻击性及治疗耐性等不同程度差异较大。例如，一部分患者在诊断后能生存10年以上，相反，由于治疗耐性快速进行，不到2年以内死亡的情况也多。虽然开发了多种治疗剂，但是目前尚未出现对于mm的治疗。即，现存的疗法虽然诱导mm缓解，但是最终几乎所有患者的疾病复发，甚至死亡，化疗及放疗等传统的治疗方法具有毒性副作用。因此，需要有关用于治疗mm的更有效的治疗剂。
5.为mm治疗而报告的潜在靶子中，有主要表达在成熟b细胞上的肿瘤坏死因子受体家族的成员b细胞成熟抗原(b cell maturation antigen，bcma)。bcma虽然在健康的机体中为了保持脏器体液免疫而介导浆细胞的生存，但是据最近报告，bcma的表达与许多的癌症、自身免疫疾病及感染性疾病相关联。作为bcma表达增加的癌症，有一部分血癌，例如多发性骨髓瘤、霍奇金及非霍奇金淋巴瘤、多种白血病及胶质母细胞瘤等。因此，存在对于将bcma-表达细胞特异靶向的有效治疗剂的必要性。
技术实现要素：6.技术问题
7.本发明是为了解决前述要求而提出的，本发明提供一种分离的bcma结合蛋白，其为包括与bcma特异结合的抗原结合结构域的分离的bcma结合蛋白，上述抗原结合结构域包括：i)重链可变结构域的互补性决定结构域1(vh-cdr1)，其包括seq id no.1的氨基酸序列或在seq id no.1具有80％以上的同源性的氨基酸序列；ii)vh-cdr2，其包括seq id no.2的氨基酸序列或在seq id no.2具有80％以上的同源性的氨基酸序列；以及iii)vh-cdr3，其包括seq id no.3的氨基酸序列或在seq id no.3具有80％以上的同源性的氨基酸序列。
8.并且，本发明提供对上述bcma结合蛋白进行编码的分离的核酸。
9.并且，本发明提供包括对上述bcma结合蛋白进行编码的核酸的细胞。
10.并且，本发明提供对上述bcma结合蛋白进行表达的细胞。
11.并且，本发明提供包括上述细胞的具有抗癌效果的组合物。
12.本发明要解决的技术问题并不限定于以上提及的技术问题，本发明所属技术领域的普通技术人员通过以下记载内容可明确理解未被提及的其他技术问题。
13.技术方案
14.为了实现上述技术问题，根据本发明的一方面的分离的bcma结合蛋白，包括与bcma特异结合的抗原结合结构域，上述抗原结合结构域包括：i)重链可变结构域的互补性决定结构域1(vh-cdr1)，其包括seq id no.1的氨基酸序列或在seq id no.1具有80％以上的同源性的氨基酸序列；ii)重链可变结构域的互补性决定结构域2(vh-cdr2)，其包括seq id no.2的氨基酸序列或在seq id no.2具有80％以上的同源性的氨基酸序列；以及iii)重链可变结构域的互补性决定结构域3(vh-cdr3)，其包括seq id no.3的氨基酸序列或在seq id no.3具有80％以上的同源性的氨基酸序列。
15.其中，上述抗原结合结构域还可包括：i)轻链可变结构域的互补性决定结构域1(vl-cdr1)，其包括seq id no.4的氨基酸序列或在seq id no.4具有80％以上的同源性的氨基酸序列；ii)轻链可变结构域的互补性决定结构域2(vl-cdr2)，其包括seq id no.5的氨基酸序列或在seq id no.5具有80％以上的同源性的氨基酸序列；以及iii)轻链可变结构域的互补性决定结构域3(vl-cdr3)，其包括seq id no.6的氨基酸序列或在seq id no.6具有80％以上的同源性的氨基酸序列。
16.上述bcma结合蛋白可包括：重链可变结构域(vh)序列，其包括seq id no.7的氨基酸序列或在seq id no.7具有80％以上的同源性的氨基酸序列；以及轻链可变结构域(vl)，其包括seq id no.8的氨基酸序列或在seq id no.8具有80％以上的同源性的氨基酸序列。上述bcma结合蛋白包还包括连接子，上述连接子、vh及vl自n末端至c末端方向，可按照选自vh-连接子-vl或vl-连接子-vh中的任一个顺序排列。
17.上述bcma结合蛋白可包括seq id no.9的氨基酸序列或在seq id no.9具有80％以上的同源性的氨基酸序列。
18.上述bcma结合蛋白可以是选自由如下组分组成的组中的任一个：i)选自iga、igd、ige、igg及igm中的免疫球蛋白；ii)选自fv、fab、fab
′
、f(ab
′
)2、vhh、vnar中的天然(native)抗体片段；iii)选自scfv、dsfv、ds-scfv、(scfv)2、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)、五链抗体(pentabody)中的工程抗体；iv)fc、一种以上的重链不变结构域、多聚化结构域、化学连接子或与其组合连接的ii)或iii)；v)抗-bcma嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)。上述抗-bcma嵌合抗原受体还包括细胞内
信号传递结构域，上述细胞内信号传递结构域可包括来源于选自cd3ζ、fcγr、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、ox40(cd134)、cd27、cd28、il-2rβ、il-15r-α、cd40、myd88、dap10、dap12、mhc class i分子、tnf受体蛋白、免疫球蛋白-类似蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、slam蛋白、活化nk细胞受体、btla、toll配体受体、cd2、cd7、cd30、cd40、cds、icam-1、b7-h3、gitr、baffr、light、hvem(lightr)、kirds2、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、itgb7、nkg2d、nkg2c、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a及cd83特异配体中的任一个以上的信号传递结构域。上述抗-bcma嵌合抗原受体还包括跨膜结构域，上述跨膜结构域可来源于选自t细胞受体(tcr)α链、tcrβ链、cd3ζ、cd3ε、cd28、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、cd278及cd314中的任一个。上述抗-bcma嵌合抗原受体还包括铰链(hinge)结构域，上述铰链结构域位于bcma结合蛋白与跨膜结构域之间，可来源于选自cd8、fcγiiiα及igg1中的任一个。上述抗-bcma嵌合抗原受体在n末端还包括信号肽，上述信号肽可来源于选自cd8、igg1重链、igk轻链及gm-csf的任一个。上述抗-bcma嵌合抗原受体可包括seq id no.15的氨基酸序列或在seq id no.15具有80％以上的同源性的氨基酸序列。
19.根据本发明的另一方面的分离的核酸，其特征在于，对前述的bcma结合蛋白进行编码。
20.根据本发明的另一方面的细胞，其特征在于，其包括对上述bcma结合蛋白进行编码的核酸。
21.根据本发明的另一方面的细胞，其特征在于，对上述bcma结合蛋白进行表达。
22.根据本发明的另一方面的具有抗癌效果的组合物，包括包含对上述bcma结合蛋白进行编码的核酸的细胞或对上述bcma结合蛋白进行表达的细胞。
23.上述解决问题的方案仅是例示性的，不得以限定本发明的意图解释。除了上述例示的实施例以外，在附图及发明内容中还可存在追加的实施例。
24.发明的效果
25.本发明最初揭示了分离的bcma结合蛋白，其为包括与bcma特异结合的抗原结合结构域的bcma结合蛋白，上述抗原结合结构域包括：i)重链可变结构域的互补性决定结构域1(vh-cdr1)，其包括seq id no.1的氨基酸序列或在seq id no.1具有80％以上的同源性的氨基酸序列；ii)vh-cdr2，其包括seq id no.2的氨基酸序列或在seq id no.2具有80％以上的同源性的氨基酸序列；以及iii)vh-cdr3，其包括seq id no.3的氨基酸序列或在seq id no.3具有80％以上的同源性的氨基酸序列。
26.根据本发明的一实施例的上述bcma结合蛋白，可呈现对于bcma的特异结合活性。
27.根据本发明的一实施例的包括与上述bcma特异结合的抗原结合结构域的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)在免疫细胞可顺利表达。这样，表达对上述bcma特异的car的免疫细胞，针对表达bcma的细胞可呈现特异的细胞毒性，导入到生物体内时，
可有效治疗表达bcma的肿瘤。
28.根据本发明的一实施例的上述bcma结合蛋白，可利用于公知为与bcma相关的许多癌症、自身免疫疾病及感染性疾病等疾病，尤其癌症的疾病的诊断、预防、预后预测及治疗等。
29.本发明的效果并不限定于上述效果，应当要理解，包括可从本发明的发明内容或权利要求书中记载的发明的结构中推导的所有效果。
附图说明
30.图1为用于确认抗-bcmascfv抗体候选物质的bcma特异结合的facs数据。
31.图2为根据本发明的一实施例的抗-bcma car及包括其的载体的结构示意图。
32.图3为根据本发明的一实施例的抗-bcma car的序列及结构。
33.图4为利用生物素标记的bcma(biotinylated bcma)分析根据本发明的一实施例的抗-bcmacar的细胞表达的数据。
34.图5为利用生物素标记的抗-人fab抗体(biotinylated anti-human fab antibody)分析根据本发明的一实施例的抗-bcmacar的细胞表达的数据。
35.图6为根据本发明的一实施例的抗-bcmacar-t细胞的ifn-γ分泌活性分析数据。
36.图7为表示由抗-bcma(c11d5.3)和抗-bcma(b10)scfv制备的各抗-bcmacar结构和其t细胞上表达的数据。
37.图8为表示由抗-bcma(c11d5.3)和抗-bcma(b10)scfv制备的各抗-bcmacar-t的细胞毒性能的数据。
38.图9为表示由抗-bcma(c11d5.3)和抗-bcma(b10)scfv制备的各抗-bcmacar-t的生物体内抗癌功效的代表图像(car-t给药量1x106个)。
39.图10为表示由抗-bcma(c11d5.3)和抗-bcma(b10)scfv制备的各抗-bcmacar-t的生物体内抗癌功效的代表图像(car-t给药量0.5x106个)。
40.图11为表示由抗-bcma(c11d5.3)和抗-bcma(b10)scfv制备的各抗-bcmacar-t的生物体内抗癌功效的代表图像(car-t给药量0.25x106个)。
41.图12为表示由抗-bcma(c11d5.3)和抗-bcma(b10)scfv制备的各抗-bcmacar-t的不同给药量的生物体内抗癌功效的数据。
具体实施方式
42.以下，参照附图，说明本发明。但是，本发明能够以多种不同的形态实现，因此，并不限定于在此说明的实施例。并且，在附图中为了明确说明本发明，省略与说明无关的部分，在说明书全文中，对于类似的部分，采用类似的附图标记。
43.在说明书全文中，当某些部分与另一部分“连接(相连、接触、结合)”时，这不仅包括“直接连接”的情况，而且在其中间隔着其他部件“间接连接”的情况。并且，当某些部分“包括”某些结构要素时，这只要没有特别相反的记载内容，就意味着还可具有其他结构要素，而不是除外其他结构要素。
44.在本说明书中使用的术语仅是用于说明特定实施例而使用的，而不是限定本发明。单数的表述只要在文脉上没有明确不同，就包括多个表述。在本说明书中，“包括”或“具
有”等术语指定存在说明书上记载的特征、数字、步骤、动作、结构要素、零件或它们的组合，应当要理解为预先不排除一个或其以上的其他特征或数字、步骤、动作、结构要素、零件或它们的组合的存在或附加可能性。
45.在本说明书上，“结构域(domain)”使用为表示具有功能性或结构特性的单位的术语。例如，结合结构域(binding domain)是指具有识别靶向分子(例如，抗原)或者与该靶向分子相互作用而能够特异结合的功能的任一结构域。根据本发明的bcma结合蛋白包括对作为抗原的bcma特异的结合结构域。根据本发明的区域优选为多肽。这种多肽可以是单个多肽链，可以是由多个多肽链的一部分聚集而成的模块。上述多肽可包括蛋白部分(proteinaceous parts)及非-蛋白部分(non-proteinaceous parts)，此时，上述非-蛋白部分例如可以是戊二醛(glutaraldehyde)之类的化学交联剂或化学连接子。
46.本发明中使用的“vh”、“vl”、“cdr”、“fv”、“fab”、“fab
′”
、“f(ab
′
)2”、“fc”、“vhh”及“vnar”分别通常为由可与免疫球蛋白(immunoglobulin)替换的术语使用的天然(native)抗体的一部分(即，片段)。基本4-链抗体单位是由2个相同的轻链(light chain或l chain)及2个相同的重链(heavy chain或h chain)构成的异四聚体性糖蛋白。各轻链根据一个共轭二硫键与重链连接，2个重链根据重链同种型(isotype)，由一个或更多的二硫键相连接。各重链及轻链还具有规则上隔开的链内(inter-chain)二硫桥。各重链按照自n末端至c末端的顺序，包括可变结构域(vh)和与其连接的不变结构域(ch)，此时，对于哺乳类免疫球蛋白而言，α、δ及γ链分别为3个，μ及ε同种型(isotype)分别具有4个ch。各轻链按照自n末端至c末端的顺序，具有可变结构域(vl)和与其连接的不变结构域(cl)。vl与vh对准而排序，cl与重链的第一个不变结构域(ch1)对准而排序。据悉，特定氨基酸残基在轻链与重链可变结构域之间形成界面，通过vh和vl的配对(pairing)形成单一抗原结合结构域。免疫球蛋白可根据包括的重链的种类进行分类，例如，作为重链包括α、δ、ε、γ、μ的哺乳类免疫球蛋白分别按照顺序分为(respectively)iga、igd、ige、igg及igm。在一部分系统的动物中，还具有其他形态的免疫球蛋白。例如，在鸟类、两栖类、硬骨及软骨鱼类中，出现重链可变结构域的种类和/或数量不同的免疫球蛋白，在骆驼科(camelidae)动物和鲨鱼中，仅由重链构成，不变结构域的数分别为(respectively)2和5个，出现包括分别(respectively)称作vhh和vnar的重链可变结构域的免疫球蛋白。
47.上述“可变”中，可变结构域的规定分节与抗体间序列差异大的事实相关联。可变结构域是介导抗原结合的部分，其规定对于特定抗原的特定抗体的特异性。这种可变性在整个可变结构域中不均匀地出现，在轻链及重链的可变结构域这两者当中集中于被称为超变区(hvr(hypervariable region)或互补决定区(cdr(complementarity-determining region))的3个分节而出现。相比于此，在可变结构域上相对来说高度保存的部分被称为架构区(fr(framework regions))。哺乳类免疫球蛋白的重链和轻链的可变结构域包括分别根据3个cdr连接的4个fr。在各链中，cdr根据fr结构域靠近设置，由此与另一链的cdr一同形成抗体的抗原结合结构域。虽然不变结构域与将抗体和抗原相结合的情况不直接相关，但是在诱导抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity)时具有成为识别抗体的位点等功能。
48.fv是完整地包括抗体的抗原识别及结合位点的最小限度的片段，其由vh及vl的二聚体构成。fab是指相比于fv追加包括轻链的不变结构域及ch1的片段，其用木瓜蛋白酶
(papain)处理igg抗体时可获得。fab
′
相比于fab追加包括一部分的铰链(ch1与ch2之间)部分，用胃蛋白酶(pepsin)处理igg抗体时可获得的f(ab
′
)2包括由二硫键(disulfide bond)连接的铰链部分，因此包括2价(divalent)的结合位点。fc结构域是不包括抗原-特异结合结构域的抗体的可结晶化的不变结构域，其由2个相同的蛋白片段构成。igg、iga及igd同种型的fc结构域包括抗体重链的第二及第三不变结构域(ch2-ch3)，igm及ige同种型的fc结构域包括抗体重链的第二、第三及第四不变结构域(ch2-ch3-ch4)。
49.在本说明书上包括的氨基酸序列，在保持根据本发明的结合蛋白的结合特性而发生出现序列差异的变化的情况下，可包括与该序列具有80％以上的同源性的序列，优选地具有90％以上，更优选地具有95％以上，最优选地具有99％以上的同源性。上述变化可以是选自一部分氨基酸残基的附加、取代或缺失中的任一个以上。
50.根据本发明的一方面的分离的bcma结合蛋白，包括与bcma特异结合的抗原结合结构域，上述抗原结合结构域包括：i)重链可变结构域的互补性决定结构域1(vh-cdr1)，其包括seq id no.1的氨基酸序列或在seq id no.1具有80％以上的同源性的氨基酸序列；ii)vh-cdr2，其包括seq id no.2的氨基酸序列或在seq id no.2具有80％以上的同源性的氨基酸序列；以及iii)vh-cdr3，其包括seq id no.3的氨基酸序列或在seq id no.3具有80％以上的同源性的氨基酸序列。优选地，bcma结合蛋白包括：i)重链可变结构域的互补性决定结构域1(vh-cdr1)，其包括seq id no.1的氨基酸序列；ii)vh-cdr2，其包括seq id no.2的氨基酸序列；以及iii)vh-cdr3，其包括seq id no.3的氨基酸序列。
51.其中，上述bcma结合蛋白还可包括：i)轻链可变结构域的互补性决定结构域1(vl-cdr1)，其包括seq id no.4的氨基酸序列或在seq id no.4具有80％以上的同源性的氨基酸序列；ii)vl-cdr2，其包括seq id no.5的氨基酸序列或在seq id no.5具有80％以上的同源性的氨基酸序列；以及iii)vl-cdr3，其包括seq id no.6的氨基酸序列或在seq id no.6具有80％以上的同源性的氨基酸序列。优选地，上述bcma结合蛋白还可包括：i)轻链可变结构域的互补性决定结构域1(vl-cdr1)，其包括seq id no.4的氨基酸序列；ii)vl-cdr2，其包括seq id no.5的氨基酸序列；以及iii)vl-cdr3，其包括seq id no.6的氨基酸序列。
52.b细胞成熟抗原(bcma，b-cell maturation antigen)是肿瘤坏死因子受体(tnfr：tumor necrosis factor receptor)超家族(superf amily)中的一员。bcma与b-细胞激活因子(baff：b-cell activating factor)及增殖诱导配体(april：a proliferation inducing ligand)结合。据报道，bcma在非-恶性(non-malignant)细胞中，主要在血浆细胞及成熟的b-细胞的亚群中表达。
53.bcma在多种人癌症中表达或超表达。作为表达或超表达bcma的癌症的例子，可列举伯基特氏淋巴瘤(burkitt's lymphoma)、弥漫大-b细胞淋巴瘤(diffuse large b-cell lymphoma或dlbcl)、急性淋巴性白血病(acute lymphocytic leukemia或all)淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(hodgkin lymphoma)及多发性骨髓瘤(multiple myeloma或mm)等。本发明的bcma结合蛋白特异识别bcma而与其结合，由此可靶向使bcma表达的癌细胞。可预测这种包括bcma结合蛋白的多肽或蛋白可利用于表达bcma的癌细胞的检测、表达bcma的癌细胞的靶向及破坏、癌细胞的减少及去除、促进向免疫细胞或效应分子或者两者的肿瘤位点的渗透、抗癌反应的提高、抗癌反应的延长等疾病的诊断、预防、预后预测及治疗的整个过程中。包括
上述bcma结合蛋白的多肽或蛋白以如上的用途被利用时，为了提高其功效，可与追加的多肽、蛋白或化合物等结合。例如，追加地，上述bcma结合蛋白可单独包括或者组合包括fc(可结晶片段(crystallizable fragment))、共轭药物(conjugated drugs)、可容易跟踪的分子标签(molecular tag，例如荧光标记物、蛋白标签等)等。
54.上述bcma结合蛋白可包括重链可变结构域(vh)，其包括seq id no.7的氨基酸序列或在seq id no.7具有80％以上的同源性的氨基酸序列，优选地可包括包括seq id no.7的氨基酸序列。上述bcma结合蛋白还可包括轻链可变结构域(vl)，其包括seq id no.8的氨基酸序列或在seq id no.8具有80％以上的同源性的氨基酸序列，优选地，还可包括包括seq id no.8的氨基酸序列。
55.上述bcma结合蛋白可包括：重链可变结构域(vh)，其包括seq id no.7的氨基酸序列或在seq id no.7具有80％以上的同源性的氨基酸序列；以及轻链可变结构域(vl)，其包括seq id no.8的氨基酸序列或在seq id no.8具有80％以上的同源性的氨基酸序列，优选地可包括包括seq id no.7的氨基酸序列的vh及seq id no.8的氨基酸序列的vl。
56.上述bcma结合蛋白还包括连接子，上述连接子、vh及vl，沿着自n末端至c末端的方向，可按照选自vh-连接子-vl或vl-连接子-vh中的任一个顺序进行排列，优选地可按照vh-连接子-vl的顺序进行排列。其中，连接子是连接相互不同的结构域(domain)的部分，其可包括2至500个氨基酸。上述连接子可由甘氨酸(glycine)和丝氨酸(serine)构成，优选地，上述连接子可包括(gly
x
sery)n(由x个glycine和y个serine构成的n个序列连接而成，x、y及n分别为1以上且10以下的整数)，更优选地可包括(gly
4-ser1)n序列，其中更优选地，n可以是1、2、3、4、5或6，最优选地，n为3或4，例如可包括(gly
4-ser1)3(即，ggggsggggsggggs)等。
57.上述bcma结合蛋白可包括seq id no.9的氨基酸序列或在seq id no.9具有80％以上的同源性的氨基酸序列，优选地可包括seq id no.9的氨基酸序列。
58.上述bcma结合蛋白可以是选自由如下组分组成的组中的任一个：i)选自iga、igd、ige、igg及igm中的免疫球蛋白；ii)选自fv、fab、fab
′
、f(ab
′
)2、vhh、vnar中的天然(native)抗体片段；iii)选自scfv、dsfv、ds-scfv、(scfv)2、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)、五链抗体(pentabody)中的工程抗体；iv)fc、一种以上的重链不变结构域、多聚化结构域、化学连接子或与其组合连接的ii)或iii)；v)抗-bcma嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)。
59.上述bcma结合蛋白可仅对bcma具有抗原特异性(即，单一特异性(monospecific))，针对上述bcma结合蛋白所包括的bcma抗原结合结构域结合的表位以外的bcma上一个以上的表位；或bcma以外的一个以上的抗原，还可具有抗原特异性(即，多特异性(multispecific))。上述bcma结合蛋白可包括一个抗原结合结构域(monovalent)，并可包括一个以上的抗原结合结构域(multivalent)。上述bcma结合蛋白可以是包括本发明中记载的一个以上的序列的工程抗体。scfv由连接肽连接抗体的vh及vl，dsfv是由二硫键稳定的fv，ds-scfv是由二硫键稳定的scfv，(scfv)2与2个scfv结合。双链抗体、三链抗体、四链抗体、五链抗体分别是(respectively)由scfv形成二聚体(dimer)、三聚体(trimer)、四聚体(tetramer)、五聚体(pentamer)的。
60.本发明的bcma结合蛋白可以是该领域中公知的任意类型的免疫球蛋白。例如，上述bcma结合蛋白可以是任意的同种型(isotype)的抗体，例如，iga、igd、ige、igg(例如，
igg1、igg2、igg3或igg4)、igm等。上述bcma结合蛋白可以是单克隆性(monoclonal)或多克隆性(polyclonal)。上述bcma结合蛋白可以是从小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人等动物中分离或精制的天然来源抗体，或者可以是参考天然来源抗体的序列特性而设计及基因合成的合成抗体。上述bcma结合蛋白可以是人源化(humanized)抗体或嵌合(chimeric)抗体等制造的抗体。上述bcma结合蛋白可以是单体形态或聚合物形态。上述bcma结合蛋白可包括化学变形，例如，可包括二硫键追加、糖基化(glycosylation)、侧链(side chain)变形的氨基酸、蛋氨酸(methionine)的氧化、天冬酰胺或谷氨酰胺的脱酰胺、γ-羧化(γ-carboxylation)、β-羟基化(β-hydroxylation)、硫化(sulfation)等。上述bcma结合蛋白对于bcma可具有任意水准的亲和度(affinity)或结合力(avidity)。上述bcma结合蛋白可以是选自小鼠、兔、人、人源化或嵌合蛋白中的任一个。
61.根据本发明的抗-bcma嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)分子，除了前述bcma结合结构域以外，还包括跨膜结构域及细胞内信号传递结构域。
62.通常，car是表达在免疫细胞上时能够使这种免疫细胞特异识别细胞(一般而言，癌细胞)上的靶向分子而结合，这种结合可连接到上述免疫细胞的细胞内信号传递激活的、由多肽构成的组。car除了识别靶向抗原的细胞以外，至少包括抗原结合结构域、跨膜结构域及细胞内信号传递结构域。上述细胞内信号传递结构域优选地来源于刺激分子或共刺激分子。由上述多肽构成的组可以是单链(single chain)多肽形态，并可以是具有通过刺激实现二聚化(dimerization)或多聚化(multimerization)的开关来相粘的多链(poly chain)形态。刺激(stimulatory)分子是指与抗原-特异性地激活免疫反应的信号传递相关的分子，共刺激分子(costimulatory molecule)是指抗原-非特异性地扩增或减少免疫细胞的初期信号的分子。上述细胞内信号传递结构域可包括来源于刺激分子或共刺激分子的一个以上的信号传递结构域。通过这种信号传递结构域优选地可诱导表达该结构域的免疫细胞的激活，其中，激活可包括开始和/或增加细胞的增殖、向效应细胞的分化、细胞因子分泌、细胞毒性物质分泌、吞噬作用(phagocytosis)、靶向细胞凋亡诱导中的一个以上。car可以是除了上述细胞以外包括抗原结合结构域、上述跨膜结构域及上述细胞内信号传递结构域的融合蛋白。上述car在n末端还可包括信号肽(signal peptide或前导序列(leader sequence))，上述信号肽在car表达而安置于细胞膜的过程中可能被切断。
63.上述细胞内信号传递结构域可包括来源于选自cd3ζ、fcγr、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、ox40(cd134)、cd27、cd28、il-2rβ、il-15r-α、cd40、myd88、dap10、dap12、mhc class i分子、tnf受体蛋白、免疫球蛋白-类似蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、slam蛋白、活化nk细胞受体、btla、toll配体受体、cd2、cd7、cd30、cd40、cds、icam-1、b7-h3、gitr、baffr、light、hvem(lightr)、kirds2、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、itgb7、nkg2d、nkg2c、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244，2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a，ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a及cd83特异配体中的任一个的信号传递结构域。优选地，上述细胞内信号传递结构域可包括选自cd3ζ及4-1bb中的任一个以上，最
优选地均可包括cd3ζ及4-1bb。
64.上述细胞内信号传递结构域可包括选自seq id no.10的氨基酸序列或在seq id no.10具有80％以上的同源性的氨基酸序列及seq id no.11的氨基酸序列或在seq id no.11具有80％以上的同源性的氨基酸序列中的任一个以上。优选地，上述细胞内信号传递结构域可包括选自seq id no.10的氨基酸序列及seq id no.11的氨基酸序列中的任一个以上，更优选地均可包括seq id no.10的氨基酸序列及seq id no.11的氨基酸序列。
65.上述跨膜结构域可来源于选自t细胞受体(tcr)α链、tcrβ链、cd3ζ、cd3ε、cd28、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、cd278及cd314中的任一个。优选地，上述跨膜结构域可选自可促进上述抗-bcmacar分子的二聚化(dimerization)的结构域中，例如，可来源于cd3ζ、cd28或cd8，更优选地可来源于cd8，最优选地可来源于cd8α。上述跨膜结构域可包括seq id no.12的氨基酸序列或在seq id no.12具有80％以上的同源性的氨基酸序列，优选地可包括seq id no.12的氨基酸序列。
66.上述抗-bcma car分子还包括铰链(hinge)结构域，述铰链结构域可位于bcma结合蛋白与跨膜结构域之间。上述铰链结构域可来源于选自cd8、fcγriiiα及igg1中的任一个，优选地可来源于cd8，更优选地可来源于cd8α。上述铰链结构域可包括seq id no.13的氨基酸序列或在seq id no.13具有80％以上的同源性的氨基酸序列。
67.上述抗-bcma car分子，在n末端还可包括信号肽(signal peptide)。上述信号肽可来源于选自cd8、igg1重链、igk轻链及gm-csf中的任一个，优选地可来源于cd8，最优选地可来源于cd8α。上述信号肽可包括seq id no.14的氨基酸序列或在seq id no.14具有80％以上的同源性的氨基酸序列，优选地可包括seq id no.14的氨基酸序列。
68.上述抗-bcmacar可包括seq id no.15的氨基酸序列或在seq id no.15具有80％以上的同源性的氨基酸序列，优选地可包括seq id no.15的氨基酸序列。
69.上述抗-bcma car还可包括连接相互不同的各肽模块、结构域等之间的连接子。其中，连接子如上所述可包括2至500个氨基酸。上述连接子可以是选自前述连接子及下列表的序列中的任一个。
70.[表1]
[0071]
[0072][0073]
根据本发明的另一方面的分离的核酸，其特征在于，对前述的bcma结合蛋白进行编码。上述核酸可包括在细胞内将表达调节序列可操纵地连接在编码上述bcma结合蛋白的序列的核酸。上述表达调节序列可包括一个以上启动子(promoter)、增强子(enhancer)、多腺苷酸化信号(polyadenylation signal)、内核糖体进入位点(ires，internal ribosome entry site)、内含子(intron)、其他转录后调节因子(post-transcriptional regulatory elements)等。对于上述表达调节序列而言，如下所述，编码上述bcma结合蛋白的分离的核酸包括在细胞中，表达上述bcma结合蛋白的情况下，能够以适合于该细胞的表达调节的方式进行选择。
[0074]
上述核酸能够以载体形态可包括在上述细胞中。上述载体可选自dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体及逆转录病毒载体中。优选地，可选自慢病毒载体及逆转录病毒载体中，之所以如此，是因为进入慢病毒载体及逆转录病毒载体的基因插入到上述免疫细胞的基因组dna，由此可稳定表达上述因子。最优选地，可以是慢病毒载体。
[0075]
对于上述核酸的如上所述的载体形态的使用而言，载体内的变动，即载体内导入特定序列的克隆过程中会出现的碱基序列的追加、变形及损失或提高载体的方便性或性能等的结构要素的变更及导入等是对于普通技术人员来说是显而易见的部分，故而省略详细说明。
[0076]
根据本发明的另一方面的细胞，其特征在于，包括对前述bcma结合蛋白进行编码。
[0077]
根据本发明的另一方面的细胞，其特征在于，细胞对前述bcma结合蛋白进行表达。
[0078]
上述细胞包括包括酵母、霉、昆虫细胞及哺乳动物细胞的真核细胞及原核细胞。例如，上述细胞可以是e.coli等细菌，其可以是酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)、耶氏酵母(yarrowia)、毕赤酵母(pichia pastoris)、念珠菌(candida)、里氏木霉(trichoderma reesei)、脉孢菌(neurospora)、许旺酵母(schwanniomyces)、克鲁维酵母(kluyveromyces)、青霉菌(penicillium)、弯颈霉(tolypocladium)及曲霉(aspergillus)宿主等的真核性微生物。上述细胞为了使糖基化(glycosylation)等翻译后修饰(post-translational modification)过程能够增加适合以抗体等形态表达，可以来源于多细胞生物体，可选择适合于包括编码上述bcma结合蛋白的核酸的载体的宿主细胞。例如，利用杆状病毒载体时，上述细胞可以来源于适当选自草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)、埃及伊蚊(aedes aegypti)、白纹伊蚊(aedes albopictus)、黑腹果蝇(drosophila melanogaster)、家蚕(bombyx mori)等中的生物体。上述细胞中表达的bcma结合蛋白可通过分离及精制而被利用，这将上述bcma结合蛋白表达在细胞内之后，优选地从细胞的可溶分馏物中分离之后，可通过亲和性色谱法、体积排除色谱法等过程进行精制过程而获得，但是并不局限于此。抗体、融合蛋白等的表达(生物合成)、分离及精制过程是普通技术人员可显然地选择的事项，故而省略对其的具体说明。
[0079]
上述细胞优选地可以是免疫细胞，上述免疫细胞可以是选自t细胞前体、nk细胞前体、t细胞、自然杀伤(nk，natural killer)细胞、nkt(natural killer t)细胞、b细胞、单球细胞、巨噬细胞及树突状细胞中的任一个，更优选地可以是t细胞，最优选地可以是细胞毒
性t细胞(cytotoxic t lymphocyte)。
[0080]
当上述细胞给药到患者身上时，可以是对象患者自体同源(autologous)、同种异体(allogeneic)或异源(heterologous)中的任一个，对于异源而言，可从哺乳类中获得。为了减少对于免疫排斥反应的可能性，优选地可使用同种异体，最优选地可使用自体同源。
[0081]
上述细胞还可包括表达上述bcma结合蛋白的细胞的活性、适合性、效率和/或提高安全性的另一作用剂。上述作用剂可以是核酸或蛋白。上述作用剂可由上述bcma结合蛋白或与对其进行编码的核酸不同的分子表达，并可以是包括在相同分子的形态。上述作用剂例如可以是追加的一个以上的car，上述追加的car具有相同的靶向分子，即可以将bcma的另一表位作为靶子，并可将不同靶向分子作为靶子。上述不同的靶向分子选自5t4、α5β1-整联蛋白、707-ap、afp、art-4、b7h4、bage、β-连环蛋白/m、bcr-abl、mn/cix抗原、ca125、camel、cap-1、casp-8、cd4、cd7、cd19、cd20、cd22、cd25、cd30、cd33、cd38、cd44 variant domain 6、cd123、cd135、cd138、cd269、cdc27/m、cdk4/m、cea、clec12a、ct、cyp-b、dam、egfr、erbb3、elf2m、emmprin、epcam、etv6-aml1、g250、gage、gnt-v、gp100、hage、her-2/new、hla-a*0201-r170i、hpv-e7、hsp70-2m、hst-2、htert(或htrt)、ice、igf-1r、il-2r、il-5、kiaa0205、lage、ldlr/fut、mage、mart-1/melan-a、mart-2/ski、mc1r、肌球蛋白/m、muc1、mum-1、mum-2、mum-3、na88-a、natural killer group 2d、lewis y antigen、pap、蛋白酶-3、p190 minor bcr-abl、pml/rarα、prame、psa、psm、psma、rage、ru1或ru2、sage、sart-1、sart-3、生存素、tel/aml1、tgfβ、tpi/m、trp-1、trp-2、trp-2/int2、vegf、wt1、ny-eso-1及ny-eso-b中，其可以是上述患者的bcma表达癌中，除了bcma之外，追加地特异表达的分子。上述作用剂可以是调整或调解免疫细胞功能的一个以上的作用剂。调整或调解上述免疫细胞功能的分子可以是抑制性分子，上述作用剂可以是均减少上述分子的表达、功能或者两者的物质。上述抑制性分子包括pd1、pd-l1、ctla4、tim3、ceacam(例如，ceacam-1、ceacam-3及ceacam-5等)、lag3、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4及tgfrβ等。上述作用剂是dsrna、sirna、shrna等的抑制性核酸、簇状规则间隔的短回文重复序列(crispr，clustered regularly interspaced short palindromic repeat，crispr)、转录激活因子样效应物核酸酶(talen，transcription activator-like effector nucleases)或锌指(zinc finger)核酸内切酶(zfn)等的抑制性蛋白或系统，或者是包括针对上述抑制性分子的抗体或结合位点的蛋白或小分子(small molecule)，其通过结合可阻止上述抑制性分子。上述作用剂可调节上述细胞的生存。例如，将上述细胞给药到患者身上时，具有细胞因子风暴等副作用的情况下，可以是去除与特定物质反应而投入的细胞或者可诱导细胞凋亡的分子，作为其例子，有美国终止专利第5358866号、美国授权专利第9393292号及欧洲授权专利第2836511号等。
[0082]
根据本发明的另一方面的具有抗癌效果的组合物，包括包括对前述bcma结合蛋白进行编码的核酸的细胞或对前述bcma结合蛋白进行表达的细胞。
[0083]
上述组合物可利用于bcma表达增加的癌症的治疗。上述组合物优选地可利用于多发性骨髓瘤、霍奇金及非霍奇金淋巴瘤、多种白血病及胶质母细胞瘤的治疗。
[0084]
在具有上述抗癌效果的组合物中，除了上述免疫细胞以外，可多样地添加药学上允许的盐、载体、赋形剂、溶剂及可更加增进治疗效果的其他添加剂等，这对于普通技术人员来说是显而易见的事项，故而除外对其的具体说明。
[0085]
在本发明中，优选的药学剂型根据意图的给药途径、传递形式及所目的的给药量，可按照本公开内容及剂型化技术的一般知识而决定。不管是给药方式，还是有效的容量可根据患者体重、表面积或器官大小而计算。用于确定伴随本说明书中记载的各个剂型的治疗的适当给药量的计算及追加的精制，在普通人员日常进行，在于本领域中日常执行的工作的区域内。适当的给药量可通过使用适当的容量-反应数据来确认。
[0086]
以下，详细说明本发明的实施例，使得本发明所属技术领域的普通技术人员可容易实施。但是，本发明能够以多种不同的形态实现，并不限定于在此说明的实施例。
[0087]
实施例1、scfv文库的构建及抗-bcmascfv候选群的导出
[0088]
《实施例1-1》scfv文库的构建
[0089]
根据韩国专利第10-0961392号的方法构建scfv文库。
[0090]
简单而言，将人的vh3-23/vl1-g基因作为骨骼，在互补性决定区(complementarity determining regions，cdr)插入随机序列，设计文库，具有β-内酰胺酶(β-lactamase)基因作为选择标记物(selection marker)的质粒载体中，在β-内酰胺酶基因的前导序列之后导入限制酶切割序列来制备pfdv质粒载体，插入scfv基因文库之后，转染至大肠杆菌之后，将其培养，构建文库。通过该过程，在文库内去除具有异常的终止密码子或移码(frameshift)的大部分scfv基因序列，可提高文库的质量。通过合酶链式反应扩增从培养的文库中去除错误的序列之后，从中重组scfv基因文库，插入到pcomb3x噬菌粒载体，通过转染er2537株的大肠杆菌而获得最终文库。在含有羧苄青霉素的超级肉汤(sb，super broth)培养基400ml中培养文库，当600纳米的吸光度为0.5时，加入1013cfu的vcsm13辅助噬菌体，在80rpm下搅拌，在摄氏37度下感染1小时。其中放入最终70ug/ml的卡那霉素抗生素，在摄氏30度、200rpm下搅拌，过夜(overnight)培养，生产展示scfv的噬菌体。第二天早上，对培养液进行离心分离，加入4％的聚乙二醇-8000和3％的氯化钠来使培养液内的噬菌体沉淀。将沉淀的噬菌体溶解于50ml的pbs缓冲溶液中，通过如上方式重新沉淀，最终溶解于2ml的pbs缓冲溶液中。对其进行离心分离而去除异物，由此获得噬菌体scfv文库，一般而言，最终噬菌体文库中包括10
13
cfu/ml以上的噬菌体粒子。
[0091]
《实施例1-2》抗bcma scfv的筛选
[0092]
在免疫试管(immunotube)中添加浓度为10ug/ml的bcma，在试管表面吸附蛋白1小时之后，在试管中添加3％脱脂乳(skim milk)溶液，保护未吸附bcma的表面。倒空试管之后，其中放入分散于3％skim milk溶液的10
12
cfu的抗体噬菌体文库，与抗原结合。利用tbst(tris buffered saline-tween20)溶液，将非特异结合的噬菌体之后，利用100mm三乙胺溶液，洗脱所剩的抗原特异噬菌体抗体。
[0093]
利用浓度为1.0m的tris-hcl缓冲液(ph 7.8)来中和洗脱的噬菌体之后，在37℃下感染至er2537大肠杆菌1小时，将感染的大肠杆菌涂布于含有羧苄青霉素的卢里亚-贝尔塔尼(lb，luria-bertani)琼脂培养基，在37℃下过夜(overnight)培养。将如此培养的大肠杆菌悬浮于3ml的sb(super broth)-羧苄青霉素培养液，添加15％甘油，一部分在-80℃下保管，将剩余部分中的50μl接种于20ml的sb-羧苄青霉素-2％葡萄糖溶液，在37℃下培养。若培养液的600纳米光线的吸光度为0.5，离心分离，仅分离细菌，将其重新悬浮于20ml的sb-羧苄青霉素培养液之后，放入1012pfu(噬斑形成单位)的vcsm13辅助噬菌体，缓慢搅拌，在37℃下培养。
miniprep kit)提取质粒dna(plasmid dna)之后，通过毛细管测序服务(capillary sequencing service)(macrogen co)获得碱基序列。将其变换为蛋白序列之后，根据kabat蛋白质序列数据库(kabat protein sequence database)和国际免疫遗传学信息系统(imgt，the international immunogenetics information system)分析方法，分析cdr序列。
[0104]
后述的实施例及实验例中使用的细胞株及培养液如下：在dmem(赛默飞世尔科技公司(thermofisher scientific))培养基中包括10％胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)、2mm l-谷氨酰胺(l-glutamine)、100u/ml青霉素(penicillin)、100μg/ml链霉素(streptomycin)的培养液中培养293t细胞。在rpmi1640培养基中包括10％fbs，2mm l-谷氨酰胺(l-glutamine)，100u/ml青霉素(penicillin)，100μg/ml streptomycin(thermofisher scientific)的培养液中培养nci-h929、rpmi 8226、u266b1细胞。aim-v培养基包括5％免疫细胞sr(immune cell sr)(thermofisher scientific)的培养液中培养pbmc。
[0105]
实施例3、pl-b10-bbz质粒的制备
[0106]
向集成dna技术公司(integrated dna technologies)合成订购包括b10碱基序列的基因片段(gene fragment)seq id#1和gene fragment seq id#2(表2)。利用2个基因片段(gene fragment)和引物seq id#1、#2(表3)进行重叠延伸pcr(overlap extension pcr)，获得pcr产物(pcr product)。将用限制酶xho1和ecorv处理的pcr产物(pcr product)插入到用限制酶xho1和ecorv处理的plv-cd19-bbz质粒(pnas，2016，ma jsy)中，制备plv-b10-bbz。(图2及图3)
[0107]
[表2]
[0108]
[0109][0110]
[表3]
[0111][0112]
实施例4、慢病毒载体的制备
[0113]
293t细胞放进涂布多聚赖氨酸(poly-d-lysine)的150mm培养皿(spl)中，培养24小时。第二天，换成新的293t细胞培养液之后，放入pmdl g/p(gag/pol表达)、prsv-rev(rev
表达)、pmdg.1(包膜(envelope)表达)以及plv-b10-bbz质粒和脂质体2000(lipofectamine 2000)(thermofisher scientific)进行转染(transfection)。48小时后，回收培养液，浓缩使用慢病毒浓缩试剂盒(lenti-x concentrator)(宝日医生物技术有限公司(takara inc.))生产的慢病毒载体(lentiviral vector)之后，使用4％乳糖(lactose)溶液悬浮所浓缩的慢病毒载体(lentiviral vector)。随后，利用0.2μm针筒过滤器(syringe filter)(密理博(millipore))过滤之后，在-80℃下保管。
[0114]
实施例5、t细胞转化及扩增
[0115]
将冷冻的人外周血单个核细胞(human pbmc)解冻之后，用包括clinimacs pbs/edta缓冲液(美天旎生物科技公司(miltenyi biotec))及0.5％白蛋白(绿十字株式会社(green cross))的洗涤液中洗涤2次。在洗涤的外周血单个核细胞(pbmc)中放入macs cd4微珠(microbead)和macs cd8微珠(microbead)(miltenyi biotec)，结合30分钟之后，通过quadromacstm分选仪(quadromacstm separator)(miltenyi biotec)分离t细胞。洗涤被分离的t细胞之后，悬浮于培养液中，放入t细胞激活试剂(t cell transact
tm
)(miltenyi biotec)和100iu/ml重组人白介素-2(recombinant human il-2)(bmi korea)激活。经过24小时后，在激活的t细胞中放入慢病毒载体(lentiviral vector)，使其成为moi＝3，过夜培养。第二天，洗涤转导的t细胞(transduced t cell)之后，放入100iu/ml重组人白介素-2(recombinant human il-2)，并放进g-rex 6m孔板(g-rex 6m plate)(威尔逊狼(wilson wolf))中，大量培养car-t细胞。通过培养液的葡萄糖(glucose)浓度变化确认细胞数。
[0116]
实验例1、抗-bcmacar表达分析
[0117]
利用流式细胞仪确认细胞表面(cell surface)的car表达。利用d-pbs洗涤2次1x106个细胞之后，与人bd fc阻断剂(human bd fc block)(bd bioscience)混合之后，常温下反应10分钟。并且，与pe-cy7小鼠抗人cd3(pe-cy7 mouse anti-human cd3)(bd bioscience)抗体一起添加生物素标记bcma(biotinylated bcma)(argo)或生物素标记抗-人fab抗体(biotinylated anti-human fab antibody)之后，常温下反应15分钟。用d-pbs洗涤(washing)2次以上试样之后，添加可固定活性染料eflour 780(fixable viability dye eflour 780)(ebioscience)和链酶亲和素-alexaalexa647(streptavidin-alexa647)(biolegend)之后，常温下反应15分钟。用d-pbs洗涤(washing)2次之后，用d-pbs进行再悬浮(resuspension)，通过bd facsverse
tm
流式细胞仪(bd facsverse
tm
flow cytometer)进行分析而确认car表达。
[0118]
利用生物素标记bcma(biotinylated bcma)的结果如图4所示，使用生物素标记抗-人fab抗体(biotinylated anti-human fab antibody)的结果如图5所示，在由包括根据本发明的实施例的抗-bcmacar的载体进行转化的t细胞(b10-bbz car-t)组中可确认上述抗-bcmacar的表达。
[0119]
实验例2、γ-干扰素释放试验(ifn-γrelease assay)
[0120]
在37℃、5％co2细胞培养器中，单独培养5.0x104个t细胞，并且24小时共培养(co-cultivation)5.0x104个t细胞和k562-mock(不表达bcma的k562细胞，1：1比率)或k562-bcma(表达bcma的k562细胞，1：1比率)。利用duoset酶联免疫吸附测定辅助试剂组合2(duoset elisa ancillary reagent kit2)(r&d system)和人γ干扰素duoset酶联免疫吸附测定试剂盒(human ifn-gamma duoset elisa)(r&d system)测定各试样的500xg中离心
分离5分钟而获得的上清液中包括的ifn-γ的量，其结果如图6所示。图6的数据分开表示只单独培养t细胞的情况(单独)、将t细胞与不表达bcma的k562细胞共培养的情况(k562-mock)、在t细胞处理刺激剂(pma/离子霉素(ionomycin))的情况(stimulation)、将t细胞与表达bcma的k562细胞共培养的情况(k562-bcma)、将从k-562-bcma组中测定的干扰素γ(ifn-gamma)量补正为作为car阳性的t细胞比率的情况(car+补正，％ifn-gamma/viable car-t)。
[0121]
其结果，对于导入抗-bcmacar的细胞组而言，相比于未导入的对照组，成为细胞毒性活性的指标的干扰素γ(ifn-gamma)的分泌在所有组中显高，尤其，可确认在上述car的靶向分子bmca中干扰素γ(ifn-gamma)的分泌特异性地高。
[0122]
实验例3、由抗-bcma(c11d5.3)和抗-bcma(b10)scfv构成的car的t细胞转导确认。
[0123]
为了评价公知的抗-bcmacar(c11d5.3)和抗-bcma(b10)car的功能差异，基于us20150051266a1专利中描述的c11d5.3 scfv碱基序列，如图7所示制作car。将由抗-bcma(c11d5.3)和抗-bcma(b10)scfv构成的car转导的第4天，利用lngfr磁珠(lngfr magnetic beads)，筛选转导的t细胞。筛选后第6天，利用apc标记lngfr ab(miltenyi biotec,clone：me20.4-1.h4,cat no、130-113-418)、生物素标记的人bcma/tnfrsf17蛋白(biotinylated human bcma/tnfrsf17 protein)、fc、avitag
tm
、streptavidin-pe-cy7，染色t细胞之后，确认通过流式细胞仪转导的细胞的％。其结果，可确认转导的t细胞的纯度为70％以上，lngfr和car几乎以1：1表达(图7)。
[0124]
实验例4、由抗-bcma(c11d5.3)和抗-bcma(b10)scfv构成的car被转导的t细胞的细胞毒性评价。
[0125]
在37℃、5％co2条件下，48小时共培养用于表达bcma、gfp的多发性骨髓瘤细胞株rpmi8226细胞(rpmi8226-gl)1x105个和mock t细胞、抗-bcma(b10)car t细胞、抗-bcma(c11d5.3)car t细胞0.5x105个、0.1x105个。在48小时内，隔着2个小时测定gfp荧光值，以0小时为基准进行归一化(normalization)，评价细胞毒性。测定结果，抗-bcma(b10)car t细胞呈现与抗-bcma(c11d5.3)car t细胞类似的细胞毒性(图8)。
[0126]
实验例5、抗-bcma(c11d5.3)car-t和抗-bcma(b10)car-t的生物体内抗癌功效评价。
[0127]
将1x107个rpmi8226-gl注射s.ceh之后，第12天，静脉注射1x106、0.5x106、0.25x106个car-t细胞，每隔一周通过测定肿瘤细胞表达的荧光素酶活性(luciferase activity)的方法评价了抗癌功效。实验结果，注射的car-t细胞的量上显著观察到细胞毒性，抗-bcma(c11d5.3)car-t细胞和抗-bcma(b10)car-t细胞之间的抗癌功效类似(图9至图12)。
[0128]
综上所述，这些结果显示，根据本发明的表达抗-bcmacar的t细胞具有对bcma特异的高细胞毒性活性，并呈现能与功效突出的现有bcma car相提并论的高的体外(in vitro)及体内(in vivo)抗癌功效。
[0129]
前述本发明的说明用于例示，本发明所属技术领域的普通技术人员应当要理解，在不变更本发明的技术思想或必需特征的情况下能够以其他具体方式容易变形。故而，应当要理解，以上描述的实施例在所有方面上是例示性的，而并不是限定性的。例如，以单一型说明的各结构要素还可以分散实施，同样，以分散方式说明的结构要素也能够以结合形
态实施。
[0130]
本发明的范围取决于所附的权利要求书，应当要解释为从权利要求书的意义及范围以及其等同概念中导出的所有变更或变形的实施方式包括在本发明的范围内。
技术特征：1.一种分离的bcma结合蛋白，其为包括与bcma特异结合的抗原结合结构域的bcma结合蛋白，其特征在于，所述抗原结合结构域包括：i)重链可变结构域的互补性决定结构域1，其包括seq id no.1的氨基酸序列或在seq id no.1具有80％以上的同源性的氨基酸序列；ii)重链可变结构域的互补性决定结构域2，其包括seq id no.2的氨基酸序列或在seq id no.2具有80％以上的同源性的氨基酸序列；以及iii)重链可变结构域的互补性决定结构域3，其包括seq id n o.3的氨基酸序列或在seq id no.3具有80％以上的同源性的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的分离的bcma结合蛋白，其特征在于，所述抗原结合结构域还包括：i)轻链可变结构域的互补性决定结构域1，其包括seq id no.4的氨基酸序列或在seq id no.4具有80％以上的同源性的氨基酸序列；ii)轻链可变结构域的互补性决定结构域2，其包括seq id no.5的氨基酸序列或在seq id no.5具有80％以上的同源性的氨基酸序列；以及iii)轻链可变结构域的互补性决定结构域3，其包括seq id n o.6的氨基酸序列或在seq id no.6具有80％以上的同源性的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的分离的bcma结合蛋白，其特征在于，所述bcma结合蛋白包括：重链可变结构域序列，其包括seq id no.7的氨基酸序列或在seq id no.7具有80％以上的同源性的氨基酸序列；以及轻链可变结构域，其包括seq id no.8的氨基酸序列或在seq id no.8具有80％以上的同源性的氨基酸序列。4.根据权利要求3所述的分离的bcma结合蛋白，其特征在于，所述bcma结合蛋白还包括连接子，所述连接子、vh及vl自n末端至c末端方向，按照选自vh-连接子-vl或vl-连接子-vh中的任一个顺序排列。5.根据权利要求1所述的分离的bcma结合蛋白，其特征在于，所述bcma结合蛋白包括seq id no.9的氨基酸序列或在seq id no.9具有80％以上的同源性的氨基酸序列。6.根据权利要求1所述的分离的bcma结合蛋白，其特征在于，所述bcma结合蛋白选自由如下组分组成的组中：i)选自iga、igd、ige、igg及igm中的免疫球蛋白；ii)选自fv、fab、fab
′
、f(ab
′
)2、vhh、vnar中的天然抗体片段；iii)选自scfv、dsfv、ds-scfv、(scfv)2、双链抗体、三链抗体、四链抗体、五链抗体中的工程抗体；iv)fc、一种以上的重链不变结构域、多聚化结构域、化学连接子或与其组合连接的ii)或iii)；v)抗-bcma嵌合抗原受体。7.根据权利要求6所述的分离的bcma结合蛋白，其特征在于，所述抗-bcma嵌合抗原受体还包括细胞内信号传递结构域，所述细胞内信号传递结构域包括来源于选自cd3ζ、fcγ
r、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、ox40(cd134)、cd27、cd28、il-2rβ、il-15r-α、cd40、myd88、dap10、dap12、mhc class i分子、tnf受体蛋白、免疫球蛋白-类似蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、slam蛋白、活化nk细胞受体、btla、toll配体受体、cd2、cd7、cd30、cd40、cds、icam-1、b7-h3、gitr、baffr、light、hvem(lightr)、kirds2、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、itgb7、nkg2d、nkg2c、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a及cd83特异配体中的任一个以上的信号传递结构域。8.根据权利要求6所述的分离的bcma结合蛋白，其特征在于，所述抗-bcma嵌合抗原受体还包括跨膜结构域，所述跨膜结构域来源于选自t细胞受体(tcr)α链、tcrβ链、cd3ζ、cd3ε、cd28、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、cd278及cd314中的任一个。9.根据权利要求6所述的分离的bcma结合蛋白，其特征在于，所述抗-bcma嵌合抗原受体还包括铰链结构域，所述铰链结构域位于所述bcma结合蛋白与跨膜结构域之间，来源于选自cd8、fcγii iα及igg1中的任一个。10.根据权利要求6所述的分离的bcma结合蛋白，其特征在于，所述抗-bcma嵌合抗原受体在n末端还包括信号肽，所述信号肽来源于选自cd8、igg1重链、igk轻链及gm-csf的任一个。11.根据权利要求6所述的分离的bcma结合蛋白，其特征在于，所述抗-bcma嵌合抗原受体包括seq id no.15的氨基酸序列或在seq id no.15具有80％以上的同源性的氨基酸序列。12.一种分离的核酸，其特征在于，对权利要求1所述的bcma结合蛋白进行编码。13.一种细胞，其特征在于，其包括对权利要求12所述的bcma结合蛋白进行编码的核酸。14.一种细胞，其特征在于，对权利要求1所述的bcma结合蛋白进行表达。15.一种具有抗癌效果的组合物，其特征在于，包括权利要求13或14所述的细胞。
技术总结本发明的一实施例涉及抗-BCMA结合蛋白，更详细地，提供一种分离的BCMA结合蛋白，其包括与BCMA特异结合的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包括：i)重链可变结构域的互补性决定结构域1(VH-CDR1)，其包括SEQ ID NO.1的氨基酸序列或在SEQ ID NO.1具有80％以上的同源性的氨基酸序列；ii)重链可变结构域的互补性决定结构域2(VH-CDR2)，其包括SEQ ID NO.2的氨基酸序列或在SEQ ID NO.2具有80％以上的同源性的氨基酸序列；以及iii)重链可变结构域的互补性决定结构域3(VH-CDR3)，其包括SEQ ID NO.3的氨基酸序列或在SEQ ID NO.3具有80％以上的同源性的氨基酸序列。上的同源性的氨基酸序列。上的同源性的氨基酸序列。
技术研发人员：沈炫辅 金炯彻 金美京
受保护的技术使用者：梨花女子大学校产学协力团
技术研发日：2021.03.15
技术公布日：2022/11/1
