1.本发明属于生物医学技术领域，涉及一种用于负载干细胞的多肽水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术：2.宫腔粘连(intrauterine adhesion，iua)也称asherman综合征，是指由于宫腔创伤性手术及感染等因素导致子宫内膜基底层严重受损，形成纤维化瘢痕，引起宫腔部分或全部堵塞所致的一系列综合征，包括严重影响女性生殖功能。目前宫腔粘连切除术是治疗宫腔粘连的首选方案，然而重度宫腔粘连患者治疗后复发率较高，妊娠率较低，较难以从根本上提高生育力。
3.经血源间充质干细胞(menstrualblood-derived stromal cells，menscs)是从女性月经血中分离、培养的新型成体间充质干细胞，具有样本来源丰富、无创取材、低免疫原性、无伦理问题的突出优势，是再生医学研究和临床转化的理想干细胞来源，已被广泛用于肌肉、皮肤、心脏、肝脏、大脑、卵巢和子宫等多种组织和器官疾病的治疗研究。研究发现menscs宫腔内移植能够有效促进iua患者子宫内膜再生和宫腔形态恢复，治疗后临床妊娠率和活产率显著优于常规治疗手段，临床应用安全高效(autologous menstrual blood-derived stromal cells transplantation for severe asherman’s syndrome[j].hum reprod.2016；the multi-functional roles of menstrual blood-derived stem cells in regenerative medicine[j].stem cell res ther.2019)，为宫腔粘连这一难治性不孕症提供了新治疗策略。
[0004]
目前，经血干细胞移植技术中采用的细胞保存方法有两种：液氮中超低温保存和生理盐水制备细胞混悬液低温保存(4℃)。液氮低温储存保存时间较长，但是在细胞储存和运输过程中需要进行实时温度监控，温度失控会导致细胞迅速失活；液氮存储的干细胞移植在之前需要解冻复苏，并重新对细胞活性进行检测，操作繁琐，不易于临床应用。生理盐水和人白蛋白制备的menscs混悬液可以直接进行宫腔内灌注治疗，但是干细胞制剂存储时间较短，细胞活性在低温中(4℃)可维持12h(≥90％)，24h之后细胞活性迅速下降。此外，目前menscs治疗宫腔粘连采用细胞混悬液宫腔灌注的给药方式，局部给药存在细胞驻留时间短，治疗效果不稳定的问题。
[0005]
综上所述，如何提供一种操作简便、保存效果良好且利于给药的保存经血源间充质干细胞的方法，是经血源间充质干细胞应用领域亟需解决问题之一。
技术实现要素：[0006]
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于负载经血干细胞的多肽水凝胶及其制备方法和应用，所述多肽水凝胶具备模拟细胞外基质的仿生特性，有利于细胞粘附和生长，且可避免在运输中因剧烈晃动而造成细胞损伤，还富含生长因子，有效维持细胞活性，制备工艺简单，成本低，易于放大生产，适用于临床应用。
[0007]
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0008]
第一方面，本发明提供一种用于负载经血干细胞的多肽水凝胶，所述多肽水凝胶包括：多肽a、多肽b、富血小板血浆和胎盘羊膜提取物，所述多肽a包括自组装多肽，所述自组装多肽的一级结构式包括式(1)或式(2)，所述多肽b的一级结构式包括式(3)。
[0009]
本发明中，利用多肽、富血小板血浆和胎盘羊膜提取物组合制备多肽水凝胶，所述多肽水凝胶具有类似于细胞外基质的仿生特性，有利于细胞粘附和生长，多肽水凝胶具备良好亲水性，可避免在运输中因剧烈晃动而造成细胞损伤，含有丰富的胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖、透明质酸、碱性成纤维细胞生长因子以及转化生长因子等，能够有效维持细胞活性，安全性高，同时具有良好的生物相容性，因而可有效应用于细胞保存。
[0010]
式(1)：ac-(arg-ala-asp-ala-arg-ala-asp-ala)
n-nh2，其中n为2～8的整数。
[0011]
式(2)：ac-(lys-ala-glu-ala-lys-ala-glu-ala)
n-nh2，，其中n为2～8的整数。
[0012]
本发明中ac为n端乙酰化，nh2为c端酰胺化；多肽a是由亲水氨基酸和疏水氨基酸交替形成，其中arg、lys为带正电荷的亲水氨基酸，asp、glu为带负电的亲水氨基酸，ala为疏水氨基酸。
[0013]
本发明具体实施例中，序列中氨基酸序列重复数n可以为2，形成具有16个氨基酸组成的离子互补性多肽，使多肽分子间相互作用更加牢固，形成更加稳定有序的自组装结构。
[0014]
式(3)：arg-gly-asp。
[0015]
优选地，所述多肽水凝胶中所述多肽a的浓度为0.28～1.60mg/ml，包括但不限于0.29mg/ml、0.30mg/ml、0.35mg/ml、0.38mg/ml、0.4mg/ml、0.9mg/ml、1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml或1.5mg/ml。
[0016]
优选地，所述多肽水凝胶中所述多肽b的浓度为0.07～0.4mg/ml，0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml或0.3mg/ml。
[0017]
优选地，所述多肽水凝胶中所述富血小板血浆的体积比是2％～10％(例如可以是3％、4％、5％、6％、7％、8％或9％)，所述富血小板血浆含有1
×
109/l～30
×
109/l浓度的血小板，包括但不限于2
×
109/l、4
×
109/l、8
×
109/l、10
×
109/l、12
×
109/l、15
×
109/l、18
×
109/l、25
×
109/l、26
×
109/l、27
×
109/l或28
×
109/l。
[0018]
优选地，所述多肽水凝胶中胎盘羊膜提取物的浓度为2.5～4mg/ml，包括但不限于2.6mg/ml、2.7mg/ml、2.8mg/ml、3mg/ml、3.2mg/ml、3.4mg/ml、3.6mg/ml、3.8mg/ml或3.9mg/ml。
[0019]
本发明中，市售的富血小板血浆成品，如人源血小板裂解物；市售的胎盘羊膜提取物或者羊膜匀浆液，或采用本领域常用方法进行提取的富血小板血浆和胎盘羊膜提取物均适用于本发明。
[0020]
本发明中，富血小板血浆(prp)的制备可参考文献(effects ofplatelet-rich plasma on the activity ofhuman menstrual blood-derived stromal cells in vitro.stem cell res ther.2018)，胎盘羊膜提取物的制备方法可以包括以下步骤：
[0021]
(1)取胎盘羊膜，使用生理盐水冲洗，刮去羊膜的海绵层；
[0022]
(2)使用0.5～2％triton处理8～16h，去离子水浸泡10～60min；
[0023]
(3)使用0.1～0.4％edta处理5～12h；
[0024]
(4)使用dnase酶处理1～6h后转移至pbs中放置1～2h；
[0025]
(5)使用去离子水清洗并进行干燥，得到脱细胞羊膜；
[0026]
(6)使用前取适量脱细胞羊膜称重，将羊膜放置于生理盐水中浸泡48～96h，达到2～20mg/ml的终浓度；
[0027]
(7)采用匀浆仪进行匀浆处理，1～2万转/分钟匀浆2～3次，离心1～2min；
[0028]
(8)得到的匀浆液500
×
g～600
×
g离心30～40min；
[0029]
(9)取上清液过滤，调节ph至7～7.5，即得到胎盘羊膜提取物。
[0030]
本发明中，所述胎盘羊膜提取物可来源于人胎盘羊膜。
[0031]
第二方面，本发明中提供第一方面所述的用于负载经血干细胞的多肽水凝胶的制备方法，所述方法包括：
[0032]
将多肽a的溶液和多肽b的溶液混合，得到混合液，将所述混合液与富血小板血浆和胎盘羊膜提取物混合，得到所述多肽水凝胶。
[0033]
第三方面，本发明提供第一方面所述的用于负载经血干细胞的多肽水凝胶在细胞保存中的应用。
[0034]
本发明中，所述多肽水凝胶具备细胞外基质的仿生特性，利于细胞粘附和生长，有效避免细胞损伤，富含生长因子，能够有效保持细胞活性，因而可有效保存细胞，理论上，任意动物活细胞均可适用，不作特殊限制。
[0035]
本发明中，所述细胞可以选自经血源间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胚胎干细胞、胎盘间充质干细胞、子宫内膜干细胞或诱导多能干细胞中任意一种或至少两种的组合。
[0036]
第四方面，本发明提供第一方面所述的用于负载经血干细胞的多肽水凝胶在制备细胞制剂中的应用。
[0037]
本发明中，所述细胞可以选自所述细胞包括经血源间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胚胎干细胞、胎盘间充质干细胞、子宫内膜干细胞或诱导多能干细胞中任意一种或至少两种的组合。
[0038]
第五方面，本发明提供一种细胞制剂，所述细胞制剂包括第一方面所述的用于负载经血干细胞的多肽水凝胶和活细胞。
[0039]
本发明中，所述细胞可以选自所述活细胞包括经血源间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胚胎干细胞、胎盘间充质干细胞、子宫内膜干细胞或诱导多能干细胞中任意一种或至少两种的组合。
[0040]
优选地，所述制剂中活细胞的活细胞的代次为p2～p6，数量为1
×
106～5
×
106个。
[0041]
优选地，所述细胞制剂还包括防腐剂、抗氧化剂和抗菌剂中任意一种或至少两种的组合。
[0042]
优选地，所述抗氧化剂包括益多酚、茶多酚、维生素c或维生素e中任意一种或至少两种的组合。
[0043]
优选地，所述抗菌剂包括卡波姆、壳聚糖或纳米银中任意一种或至少两种的组合。
[0044]
第六方面，本发明提供一种第五方面所述的细胞制剂的制备方法，所述方法包括：
[0045]
将多肽a的溶液和多肽b的溶液混合得到凝胶母液，对凝胶母液进行稀释得到凝胶
工作液，将富血小板血浆、抗氧化剂、抗菌剂和活细胞混合，得到细胞混合液，将所述凝胶工作液、细胞混合液和胎盘羊膜提取物混合，得到所述细胞制剂。
[0046]
优选地，所述凝胶工作液中多肽a和多肽b的浓度分别为0.56～3.20mg/ml(例如可以是0.58mg/ml、0.6mg/ml、0.9mg/ml、1mg/ml、1.2mg/ml、1.5mg/ml、1.8mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、2.6mg/ml、2.8mg/ml、3mg/ml或3.1mg/ml)和0.14～0.80mg/ml(例如可以是0.15mg/ml、0.16mg/ml、0.18mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.65mg/ml、0.7mg/ml、0.72mg/ml、0.76mg/ml或0.78mg/ml)。
[0047]
优选地，所述细胞混合液中活细胞数量为1
×
106～5
×
106个。
[0048]
优选地，所述细胞混合液中富血小板血浆的体积百分比是2％～10％，其中包含1
×
109/l～30
×
109/l浓度的血小板。
[0049]
优选地，所述细胞混合液、胎盘羊膜提取物和凝胶工作液的体积比为1:1:2～1:2:2。
[0050]
第七方面，本发明提供第一方面所述的用于负载经血干细胞的多肽水凝胶或第五方面所述的细胞制剂在制备干细胞治疗药物中的应用。
[0051]
本发明中，所述细胞可以选自所述活细胞包括经血源间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胚胎干细胞、胎盘间充质干细胞、子宫内膜干细胞或诱导多能干细胞中任意一种或至少两种的组合。
[0052]
本发明的用于负载经血干细胞的多肽水凝胶具备细胞外基质的仿生特性，利于细胞粘附和生长，能够有效保护细胞及维持细胞活性，且具有良好生物相容性，可作为有效的药物载体，例如干细胞药物，如为宫腔粘连预防与治疗提供新型干细胞治疗药物缓释支架，多肽水凝胶能够有效提高经血源间充质干细胞(menscs)在体外的存活率，4℃保存7天，细胞活率仍超过90％，使用时无需复苏，同时具有良好的生物相容性，可提升menscs在子宫内的驻留时间，对于女性iua疾病具有明显治疗效果，方便保存运输和临床推广。
[0053]
第八方面，本发明提供一种干细胞治疗药物，所述干细胞治疗药物包括第五方面所述的细胞制剂。
[0054]
优选地，所述干细胞治疗药物还包括辅料。
[0055]
优选地，所述辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、防腐剂、抗氧化剂、抗菌剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂或ph调节剂中的任意一种或至少两种的组合。
[0056]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0057]
(1)本发明的负载经血干细胞的多肽水凝胶具有类似于细胞外基质的仿生特性，有利于细胞粘附和生长，且亲水性好，可避免在运输中因剧烈晃动而造成细胞损伤，含有丰富的胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖、透明质酸、碱性成纤维细胞生长因子以及转化生长因子等，有效维持细胞活性，制备工艺简单，成本低，易于放大生产，适用于临床应用；
[0058]
(2)本发明制备的多肽水凝胶能够显著提高menscs在体外的存活率，4℃保存7天，细胞活率仍超过90％，使用时无需复苏，方便保存运输和临床推广，安全性高，同时具有良好的生物相容性，可提升menscs在子宫内的驻留时间，对于女性iua疾病具有明显治疗效果。
附图说明
[0059]
图1为经血源间充质干细胞培养图，比例尺为100μm；
[0060]
图2a为经血源间充质干细胞表型(cd90、cd44、cd73、cd105)鉴定结果图；
[0061]
图2b为经血源间充质干细胞表型(cd45、cd38、cd11b、hla-dr、cd19、cd34)鉴定结果图；
[0062]
图3为多肽水凝胶细胞制剂图；
[0063]
图4为不同多肽水凝胶细胞制剂弹性模量图；
[0064]
图5为实施例3中agm、gm与sm组保存时间7天的细胞活率结果图；
[0065]
图6为实施例3中agm、gm与sm组保存时间17天的细胞活率变化结果图；
[0066]
图7为p3代新鲜menscs细胞和实施例3中agm组保存第7d的menscs细胞的群体倍增时间结果图；
[0067]
图8为p3代新鲜menscs细胞的细胞周期结果图；
[0068]
图9为实施例3中agm组保存第7d的menscs细胞的细胞周期结果图。
具体实施方式
[0069]
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
[0070]
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
[0071]
本发明具体实施例中，以经血源间充质干细胞(menscs)为例验证本发明的多肽凝胶的效果。
[0072]
实施例1
[0073]
本实施例进行经血源间充质干细胞分离培养和鉴定。
[0074]
1.制备自体血清
[0075]
静脉采血法采集宫腔粘连患者自体外周血，收集总量为20ml左右，采集的血液样本于4℃冰箱静置12h后，3000rpm离心处理10min，取上层血清，将血清置于56℃恒温水浴箱中，经过30min的灭活后，将得到的血清于-20℃冰箱保存，备用。
[0076]
2.经血源间充质干细胞的分离培养
[0077]
使用月经杯收集无菌经血样本，于48h内使用样本密度分离液(深圳达科为，7912011)进行单核细胞的分离，详细步骤请参考使用分离液说明书。将得到的细胞沉淀用完全培养基(含10％自体血清的dmem/f12培养液)重悬，接种于培养瓶中置于5％co2、37℃饱和湿度的培养箱内培养，每2天全量更换为新鲜配制的5ml完全培养液，培养过程中显微镜镜下观察，如图1所示，可见经血源间充质干细胞成短棒状或梭型，有较长的突起，明亮立体，三天换液，培养扩增至p3代。
[0078]
3.经血源间充质干细胞的表型鉴定
[0079]
取p3代5
×
105细胞悬液标记cd34、cd38、cd45、cd19、cd11b、hla-dr、cd44、cd73、cd90和cd105抗体，4℃冰箱避光孵育30min，pbs洗去未结合抗体，以相应的同型对照抗体作
为阴性对照组，使用cytoflex流式细胞仪(beckman)检测分析，cytexpert软件进行细胞表型鉴定，如图2a和2b所示，结果显示cd90、cd44、cd105、cd73均≥95％，cd34、cd38、cd45、cd19、cd11b、hla-dr均≤2％，鉴定本株细胞系为间充质干细胞。
[0080]
实施例2
[0081]
本实施例制备多肽水凝胶和干细胞制剂。
[0082]
1.制备凝胶工作液
[0083]
(1)取自组装短肽(ac-arg-ala-asp-ala-arg-ala-asp-ala-arg-ala-asp-ala-arg-ala-asp-ala-nh2)冻干粉10mg(abmole，m10196)溶于1ml无菌去离子水，并用超声波清洗机37℃超声处理30min充分溶解，得到浓度为10mg/ml(m/v)的多肽母液a；
[0084]
(2)取多肽b(arg-gly-asp)冻干粉10mg(sigma,a8052)溶于1ml无菌去离子水，并用超声波清洗机37℃超声处理30min充分溶解，得到浓度为10mg/ml(m/v)的多肽母液b；
[0085]
(3)将多肽母液a和多肽母液b按照4:1的体积比混合均匀，得到浓度为10mg/ml(m/v)混合水凝胶母液；
[0086]
(4)调整混合水凝胶母液ph值为7.4，制备好的水凝胶母源可于4℃保存，需要使用时，提前用去离子水稀释1:6，稀释成1.4mg/ml的水凝胶工作液，0.22μm过滤器过滤。
[0087]
2.制备胎盘羊膜提取物
[0088]
(1)无菌剥离胎盘羊膜，生理盐水反复冲洗，刮除表面粘液及残留血渍；
[0089]
(2)钝性分离，刮去羊膜的海绵层，获得光滑、半透明的羊膜。
[0090]
(3)1％triton处理12h，去离子水浸泡30min；
[0091]
(4)0.25％edta处理8h；
[0092]
(5)dnase酶处理4h后转移至pbs中放置1h；
[0093]
(6)去离子水中反复清洗3次后放入冷冻干燥机中8h，环氧乙烷灭菌处理，-80℃保存；
[0094]
(7)使用前剪取适量脱细胞羊膜称重，将羊膜放置于生理盐水中浸泡72h，达到10mg/ml的终浓度；
[0095]
(8)采用匀浆仪(hty-761)进行匀浆处理，2万转/分钟匀浆3次，时间是1min；
[0096]
(9)得到的匀浆液600
×
g离心30min；
[0097]
(10)上清液用0.22μm滤器过滤，调节ph至7.2，即得到胎盘羊膜提取物，置于4℃冰箱保存。
[0098]
3.制备自体富血小板血浆(prp)
[0099]
prp的制备方法参考文献(effects ofplatelet-rich plasma on the activity of human menstrual blood-derived stromal cells in vitro.stem cell res ther.2018)，从单采血小板中提取prp(浓度为12.5
×
10
11
/l，为了活化，以1:20的体积比添加20％cacl2(sigma-aldrich)和1000u/ml凝血酶(t8020，solarbio)，将混合物在37℃下孵育1h，然后在4℃下孵育12h，为了收集活化的prp，凝胶状混合物在4℃下以5000rpm的转速离心30min，吸出上清液并通过0.22μm过滤器过滤，然后分装并储存在-80℃，以避免反复冻融。
[0100]
将所述工作液、胎盘羊膜提取物和prp按需求混合即可制备本发明多肽水凝胶。
[0101]
4.细胞混悬液的制备
[0102]
收集p3的menscs，细胞数为1
×
106，将细胞混悬于110μl生理盐水中，占比88％，再加入10％prp提供生长因子和细胞因子，加入1％的益多酚作为抗氧化剂，加入1％卡波姆作为抗菌消炎物质。
[0103]
5.多肽水凝胶细胞制剂的制备
[0104]
向细胞混悬液中依次加入羊膜提取物、水凝胶工作液，体积比为1:1:2，充分混匀触发交联，放置于37℃，5％co2细胞培养箱中30min，即制备形成凝胶制剂，倒置后粘附于西林瓶而不下流，如图3所示，将水凝胶母液采用不同比例进行稀释成工作液时，最终凝胶制剂的弹性模量(g’)不同，使用动态流变仪测试凝胶制剂的弹性模量，如图4所示，水凝胶工作液比例为1:6时，其最终凝胶制剂的弹性模量为1200pa左右，硬度适宜细胞的存活。
[0105]
实施例3
[0106]
本实施例检测多肽水凝胶保存细胞活率。
[0107]
对比本发明制备的多肽水凝胶、不含胎盘羊膜提取物的多肽水凝胶(制备方法参照实施例2，区别仅在于不添加羊膜提取物组分，等比例替换为生理盐水，即向细胞混悬液中依次加入生理盐水、水凝胶工作液，体积比为1:1:2，充分混匀触发交联)和普通生理盐水加白蛋白保存的干细胞活性。实验组1为本发明制备多肽水凝胶细胞制剂500μl含1
×
106个menscs，用agm组表示；实验组2为不含胎盘羊膜提取物的多肽水凝胶细胞制剂，同样为500μl含1
×
106个menscs，用gm组表示；对照组是生理盐水加白蛋白制剂500μl含1
×
106个menscs，用sm组表示，每组设置3个样本重复，温度模拟临床运输4℃，保存时间组别为13组，分别为：0.5d(天)、1d、1.5d、2d、3d、4d、5d、7d、9d、11d、13d、15d、17d，离心回收细胞后使用台盼蓝染色计数细胞活率，公式为：(正常细胞数/总细胞数)
×
100％，使用graphpad prism 8进行细胞活率统计分析，组间多重比较统计分析采用单因素方差分析，*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001被认为具有统计学意义，研究结果表明：干细胞制剂放置0.5d时，三组活性无差异；放置2d时，sm组的细胞活性降低一半，放置到第7d时sm组细胞已全部死亡；agm组和gm组放置时间超过5d时，开始出现显著差异(p《0.001)；当放置到第7d时，agm组的细胞活率超过90％，此时仍可用于临床宫腔灌注使用，而gm组的细胞活率已经降低到70％，不符合临床使用标准(如图5)。此外，如图6所示，随着保存时间的增加，agm组保存的menscs活率明显高于gm组，说明含胎盘羊膜提取物的凝胶制剂可以明显提高即用型经血干细胞的生物活性。
[0108]
实施例4
[0109]
本实施例检测多肽水凝胶细胞制剂细胞群体倍增时间。
[0110]
收集p3代新鲜menscs细胞和实施例3中agm组保存第7d的细胞，分别以1
×
104/ml的密度，每孔1ml接种到24孔板，置于培养箱中，每隔3天进行全量换液，24h后各取3孔细胞消化计数，1～8d内每天重复消化细胞并计数，8d后绘制生长曲线，根据药典法计算群体倍增时间，重复三次后群体倍增时间检测结果如表1所示，细胞生长曲线代表图如图7，与新鲜细胞相比，第7天时agm组凝胶制剂细胞的群体倍增时间无显著差异(p＞0.05)，表明本发明使用多肽水凝胶保存细胞，能够有效维持细胞活性，保存7天后的倍增活性与新鲜细胞相似。
[0111]
表1
[0112]
重复次数新鲜细胞(h)agm保存7d细胞(h)
131.031.5233.634.0332.132.9平均值32.2332.8
[0113]
实施例5
[0114]
本实施检测多肽水凝胶细胞制剂细胞周期。
[0115]
收集p3代新鲜menscs细胞和实施例3中agm组保存第7d的细胞，各取1
×
106个细胞，用0.5ml预冷的pbs重悬细胞，加入1.2ml预冷的无水乙醇(乙醇终浓度70％)，吹打混匀以免细胞团聚，4℃固定过夜，离心(300
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g，5min)收集固定的细胞，pbs清洗细胞一次，向细胞沉淀中加入500μl pi染色剂，流式细胞仪收集检测3万个细胞，结果用modfit fl拟合分析，根据增殖指数(proliferous index,pi)计算公式：pi＝(s+g2/m)/(g0/g1+s+g2/m)计算，重复三次后细胞周期检测结果如表2，新鲜细胞和agm组第7天的细胞周期拟合分析代表图分别如图8、图9所示，其中rcs值小于3.0提示拟合的曲线与真实结果的吻合程度良好，％cv小于8.0％提示s期所占比率计算准确，debris和aggregates小于20％提示碎片和粘连体占比正常，三次重复的结果显示新鲜细胞与agm保存7d细胞的增殖指数无显著差异(p＞0.05)，表明agm组第7天保存效果良好。
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表2
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重复次数新鲜细胞agm保存7d细胞126.3825.30226.8225.53327.6026.92平均值26.9325.92
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综上所述，本发明的多肽水凝胶具有类似于细胞外基质的仿生特性，有利于细胞粘附和生长且亲水性好，可避免在运输中因剧烈晃动而造成细胞损伤，含有丰富的生长因子，有效维持细胞活性，能够显著提高menscs在体外的存活率，4℃保存7天，细胞活率仍超过90％，使用时无需复苏，方便保存运输和临床推广，安全性高，同时具有良好的生物相容性，可提升menscs在子宫内的驻留时间，对于女性iua疾病具有明显治疗效果。
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申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
技术特征：1.一种用于负载干细胞的多肽水凝胶，其特征在于，所述多肽水凝胶包括：多肽a、多肽b、富血小板血浆和胎盘羊膜提取物；所述多肽a包括自组装多肽，所述自组装多肽的一级结构式包括式(1)或式(2)；式(1)：ac-(arg-ala-asp-ala-arg-ala-asp-ala)
n-nh2，其中n为2～8的整数；式(2)：ac-(lys-ala-glu-ala-lys-ala-glu-ala)
n-nh2，其中n为2～8的整数；所述多肽b的一级结构式包括式(3)；式(3)：arg-gly-asp。2.根据权利要求1所述的用于负载干细胞的多肽水凝胶，其特征在于，所述多肽水凝胶中所述多肽a的浓度为0.28～1.60mg/ml；优选地，所述多肽水凝胶中所述多肽b的浓度为0.07～0.4mg/ml；优选地，所述多肽水凝胶中所述富血小板血浆的体积百分比为2％～10％，所述富血小板血浆含有1
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109/l～30
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109/l浓度的血小板；优选地，所述多肽水凝胶中所述胎盘羊膜提取物的浓度为2.5～4mg/ml。3.权利要求1或2所述的用于负载干细胞的多肽水凝胶的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将多肽a的溶液和多肽b的溶液混合，得到混合液，将所述混合液与富血小板血浆和胎盘羊膜提取物混合，得到所述多肽水凝胶。4.权利要求1或2所述的用于负载干细胞的多肽水凝胶在细胞保存中的应用；优选地，所述细胞包括经血源间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胚胎干细胞、胎盘间充质干细胞、子宫内膜干细胞或诱导多能干细胞中任意一种或至少两种的组合。5.权利要求1或2所述的用于负载干细胞的多肽水凝胶在制备细胞制剂中的应用；优选地，所述细胞包括经血源间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胚胎干细胞、胎盘间充质干细胞、子宫内膜干细胞或诱导多能干细胞中任意一种或至少两种的组合。6.一种细胞制剂，其特征在于，所述细胞制剂包括权利要求1或2所述的用于负载干细胞的多肽水凝胶和活细胞；优选地，所述活细胞包括经血源间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胚胎干细胞、胎盘间充质干细胞、子宫内膜干细胞或诱导多能干细胞中任意一种或至少两种的组合；优选地，所述细胞制剂还包括防腐剂、抗氧化剂和抗菌剂中任意一种或至少两种的组合；优选地，所述抗氧化剂包括益多酚、茶多酚、维生素c或维生素e中任意一种或至少两种的组合；优选地，所述抗菌剂包括卡波姆、壳聚糖或纳米银中任意一种或至少两种的组合。7.根据权利要求6所述的细胞制剂，其特征在于，所述制剂中活细胞的代次为p2～p6，数量为1
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106～5
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106个。8.一种权利要求6或7所述的细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将所述多肽a的溶液和多肽b的溶液混合得到凝胶母液，对凝胶母液进行稀释得到凝胶
工作液，将富血小板血浆、抗氧化剂、抗菌剂和活细胞混合，得到细胞混合液，将所述凝胶工作液、细胞混合液和胎盘羊膜提取物混合，得到所述细胞制剂。9.权利要求1或2所述的多肽水凝胶或权利要求6或7所述的细胞制剂在制备干细胞治疗药物中的应用。10.一种干细胞治疗药物，其特征在于，所述干细胞治疗药物包括权利要求6或7所述的细胞制剂；优选地，所述干细胞治疗药物还包括辅料；优选地，所述辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、防腐剂、抗氧化剂、抗菌剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂或ph调节剂中的任意一种或至少两种的组合。
技术总结本发明公开了一种用于负载干细胞的多肽水凝胶及其制备方法和应用。所述多肽水凝胶包括：多肽A、多肽B、富血小板血浆和胎盘羊膜提取物，所述自组装多肽的一级结构式包括式(1)或式(2)，所述多肽B的一级结构式包括式(3)。本发明的用于负载干细胞的多肽水凝胶具有细胞外基质的仿生特性，有利于细胞粘附和生长，可有效避免细胞损伤，含有丰富的生长因子，有效维持细胞活性，能够显著提高MenSCs在体外的存活率，使用时无需复苏，方便保存运输和临床推广，同时具有良好的生物相容性，可提升MenSCs在子宫内的驻留时间，对于女性IUA疾病具有明显治疗效果。疗效果。疗效果。
技术研发人员：谭季春 杨祖 张斯文 高姗 赵馨杨 郑贝贝
受保护的技术使用者：苏州元生细胞生物科技有限公司
技术研发日：2022.07.25
技术公布日：2022/11/1
