【】本技术要求于2022年3月24日向韩国专利局提交的韩国专利申请第10-2022-0036970号的优先权，该专利申请的全部内容在此引入本技术作为参考。本发明涉及包含质粒dna的液体剂型药物组合物。
背景技术
0、
背景技术：
1、伴有未被病毒或病毒样颗粒包装(packaged)的核酸构建物(即所谓的“裸(naked)”dna或rna构建物(constructs))的直接的生物体内(in vivo)传递的基因疗法(gene therapy)在多种疾病的治疗中有效，这已得到实质的临床验证。例如，直接肌肉内注射(intramuscular injection)表达人hgf蛋白的2个异构体(isoform)(即，也称为“vm202”的pck-hgf-x7)的dna质粒构建物(construct)在神经病理性疼痛(neuropathic pain)的治疗中有效这一点得到了验证。在二期临床试验中，向糖尿病周围神经病变(diabeticperipheral neuropathy)患者的小腿肌肉注射vm202时，示出显著减少疼痛，若以2周间隔治疗2天，则所提供的症状缓解效果足以使患者的生活质量提高3个月(kessler et al.,annals clin.transl.neurology 2(5):465-478(2015))。上述相同的dna质粒构建物还在肌萎缩侧索硬化症(als；amyotrophic lateral sclerosis)患者的治疗中表现出效果。在一期临床试验中，近一半als患者在给药vm202后保持稳定或改善的状态，在1个月、2个月及3个月中，分别有47％、50％及24％的对象(subject)表现出不减轻表示als患者的身体功能的alsfrs-r(肌萎缩侧索硬化症功能评定量表-修订版(amyotrophic lateral sclerosisfunctional rating scale-revised))分数的减少或减轻分数的提高，这比过去在对照组中观察到的更低(robert l.sufit et al.,amyotrophic lateral sclerosis andfrontoemporal degeneration 18:269-278(2017))。
2、然而，已知dna或rna构建物的物理、化学稳定性受最终制剂和剂型(formulation&dosage form)以及保管条件等的影响。通常，药物剂型为保管稳定性而以冷冻干燥剂型来提供，为了向患者给药，要利用注射用水来重构(reconstitution)。在重构这样的药物时，若不按照正确的指南去做，则无法均匀地重构药物，有引起药物的损失或给药过程中发生污染的隐患。因此，以不是冷冻干燥形态的液体剂型来提供药物时，可以提高安全性和商品竞争力。因此，需要开发稳定性和安全性优秀的基于裸dna的药物的液体剂型。
技术实现思路
0、
技术实现要素：
1、【技术问题】
2、本发明提供包含质粒dna的液体剂型。
3、【技术方案】
4、根据本发明的一实施方式，本发明提供包含质粒dna的液体剂型。
5、本说明书中的术语“液体剂型(liquid formulation)”是指包含质粒dna及至少一种药学上可接受的载体或赋形剂的如本技术中记载的液体形态的药物组合物。
6、本发明的液体剂型涉及可以与质粒dna的种类无关地使用的质粒dna的普通液体剂型，本发明的液体剂型的目的不限定于用于用作本发明的一实例的质粒dna(例如，vm202)的液体剂型。
7、在本发明的一实例中，上述质粒dna编码人hgf或其变异体。
8、在本发明的一实例中，上述质粒dna可以为vm202，但不限定于此。
9、在本发明的一实例中，上述质粒dna还包含启动子。上述启动子在上述质粒dna内与编码蛋白质核酸分子可操作地连接。在本说明书中，术语“可操作地连接”是指核酸表达调节序列(例如，启动子、信号序列或转录调节因子结合表位的阵列)与其他核酸序列之间的功能性结合，上述调节序列通过这种方式调节上述其他核酸序列的转录和/或解读。
10、例如，本发明的载体为表达载体，在以真核细胞为宿主的情况下，可以利用源自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子、β(beta)肌动蛋白启动子、人血红蛋白启动子及人肌酸启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、波西尼亚病毒7.5k启动子、sv40启动子、巨细胞病毒启动子、hsv的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、hiv的ltr启动子、莫罗尼病毒的启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(ebv)的启动子及劳斯肉瘤病毒(rsv)的启动子)，通常具有聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。
11、另一方面，本发明的表达载体可以包含可选择标记物基因和/或报告基因作为用于评估表达载体的转化与否及蛋白质表达的选择标记物。
12、可选择的标记物基因包括本发明所属技术领域中通常使用的抗生素耐药性基因，例如，有对氨苄西林、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素及四环素等具有耐药性的基因。报告基因包括荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶及绿色荧光蛋白等，但不限定于此。
13、将本发明的重组载体导入细胞内并表达的方法在本发明所属技术领域中是广为人知的。载体可以通过本发明所属技术领域的公知的方法轻松导入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞内。例如，载体可以通过物理、化学或生物学手段向宿主细胞内传递。上述物理手段包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击(particle bombardment)、微注射、电穿孔等。上述化学手段有胶体分散液系统，包括例如超大分子复合物、纳米胶囊、微滴、磁珠及水包油乳液、胶束(micelle)、混合的胶束以及包含脂质体的基于脂质的系统。并且，上述生物学手段包括上述慢病毒、逆转录病毒等dna或rna载体的使用。但不限定于此。
14、本说明书中的术语“vm202”是指包含克隆在pck载体(序列6)及pck载体中的hgf-x7(序列13)的质粒dna，也称为pck-hgf-x7。vm202根据布达佩斯条约于2002年3月12日以保藏编号kccm-10361保藏在韩国微生物保藏中心(kccm)。
15、本技术中使用的术语“hgf的异构体(isoforms of肝细胞生长因子(hepatocytegrowth factor，hgf))”是指具有至少80％与动物中自然产生的hgf多肽的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽。上述术语包括与任意全长(full length)野生型hgf多肽至少具有80％相同的氨基酸序列的多肽，包括与自然产生的hgf等位基因变异体(allelicvariant)、剪接变异体(splice variant)或缺失变异体(deletion variant)具有至少80％相同的氨基酸序列的多肽。在本发明中，hgf的异构体包括选自由全长hgf(full-lengthhgf，flhgf)、缺失的变异体hgf(deleted variant hgf，dhgf)、nk1、nk2及nk4组成的组中的2个以上异构体。根据本发明更为具体的实例，本技术记载的方法中使用的hgf的异构体包括flhgf(序列1)及dhgf(序列2)。
16、术语“人flhgf(human flhgf)”、“flhgf”及“fhgf”用来表示由人hgf蛋白的氨基酸1-728构成的蛋白质，在本技术中可以相互交换来使用。flhgf的氨基酸序在序列1中提供。
17、术语“人dhgf(human dhgf)”及“dhgf”用来表示通过人hgf基因的选择性剪接(alternative splicing)来生成的hgf蛋白的缺失的变异体，在本技术中可以相互交换来使用。具体地，“人dhgf”或“dhgf”是指全长hgf序列的α链(chain)的第一个环饼结构域(kringledomain)中缺失5个氨基酸(f、l、p、s及s)人hgf蛋白。人dhgf为723个氨基酸长度。人dhgf的氨基酸序列在序列2中提供。
18、在本发明的一实例中，上述质粒dna编码sdf-1、igf-1、c-met、其片段/异构体/变异体。
19、本发明的术语sdf-1(基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1))也称为c-x-c基序趋化因子12(cxcl12)，为通过cxcl12基因编码的趋化因子蛋白。sdf-1在许多细胞核组织中表达，分为sdf-1α(alpha)和sdf-1β(beta)。sdf-1已知起到血管新生、伤口愈合、神经发育等重要作用。
20、人sdf-1α的例示性的氨基酸序列在序列21中提供。
21、编码上述人sdf-1α的例示性的核苷酸序列在序列17中提供。
22、本发明的术语igf-1(胰岛素样生长样因子1，insulin like growth factor1)也称为生长调节素c(somatomedin c)，为结构与胰岛素相似的激素。igf-1通过在幼年时期的生长期发育与细胞增殖的促进相关联来起到重要作用。igf-1由igf1基因编码，刺激多种类型的细胞的生长并抑制细胞凋亡，已知增加细胞的蛋白质生产。
23、人igf-1的ea异构体的例示性的氨基酸序列在序列19中提供。人igf-1的ec异构体的例示性的氨基酸序列在序列20中提供。
24、本发明的术语c-met蛋白也称为酪氨酸蛋白激酶met(tyrosine-protein kinasemet)或肝细胞生长因子受体(hepatocyte growth factor receptor，hgfr)。c-met由met基因编码，为具有酪氨酸激酶活性的胚胎发育、组织形成、细胞分裂及伤口愈合所需的激酶受体。在本发明的一实例中，上述质粒dna可以为pck-sdf-1a(wo2016/048105a1)、ptx-igf-1x10(wo2020/016655a2)、pcmv3-cmet-flag(义翘神州公司(sino biological inc.)，中国(china))或它们的组合，但不限定于此。
25、在本发明的一实例中，上述ptx为源自pck的质粒载体。ptx通过pck的2个依次连续的突变诱发(mutagenesis)来生成。通过卡那霉素耐药性基因(kanamycin resistancegene)与pck的cole1之间的不必要的序列删除以及hcmv内含子序列长度的最优化来生成。
26、在本发明的一实例中，上述pcmv3为用于表达由cmv启动子诱导的哺乳动物的蛋白质的载体。
27、在本发明的一实例中，上述液体剂型包含质粒dna作为药物组合物的活性成分。上述质粒dna可以包含用于基因疗法的基因物质。具体地，上述质粒dna可以矫正缺陷基因或转录体的功能，或者编码多肽、正义寡核苷酸、反义寡核苷酸或rna(编码或非编码(non-coding)；例如，sirna(小干扰rna)、shrna(短发夹rna)、微小rna及它们的反义对应物质(例如，antagomi r))。基因疗法中使用的包含本发明所属技术领域中公知的任意质粒dna的剂型都包括本发明的范围内。
28、在本发明的一实例中，上述液体剂型包含0.01-5mg/ml浓度的质粒dna。更具体地，可以包含0.01mg/ml至5mg/ml、0.01mg/ml至3mg/ml、0.01mg/ml至2mg/ml、0.01mg/ml至1mg/ml、0.01mg/ml至0.75mg/ml、0.01mg/ml至0.6mg/ml、0.01mg/ml至0.5mg/ml的浓度、0.1mg/ml至5mg/ml、0.1mg/ml至3mg/ml、0.1mg/ml至2mg/ml、0.1mg/ml至1mg/ml、0.1mg/ml至0.75mg/ml、0.1mg/ml至0.6mg/ml、0.1mg/ml至0.5mg/ml的浓度、0.2mg/ml至5mg/ml、0.2mg/ml至3mg/ml、0.2mg/ml至2mg/ml、0.2mg/ml至1mg/ml、0.2mg/ml至0.75mg/ml、0.2mg/ml至0.6mg/ml、0.2mg/ml至0.5mg/ml的浓度、0.3mg/ml至5mg/ml、0.3mg/ml至3mg/ml、0.3mg/ml至2mg/ml、0.3mg/ml至1mg/ml、0.3mg/ml至0.75mg/ml、0.3mg/ml至0.6mg/ml、0.3mg/ml至0.5mg/ml浓度或0.5mg/ml浓度的质粒dna。
29、上述质粒dna可以为2000个碱基对至15000个碱基对、2000个碱基对至10000个碱基对、2000个碱基对至9000个碱基对、2000个碱基对至8000个碱基对、2000个碱基对至7000个碱基对、2000个碱基对至6000个碱基对、2000个碱基对至5000个碱基对、3000个碱基对至15000个碱基对、3000个碱基对至10000个碱基对、3000个碱基对至9000个碱基对、3000个碱基对至8000个碱基对、3000个碱基对至7000个碱基对、3000个碱基对至6000个碱基对、3000个碱基对至5000个碱基对、4000个碱基对至8000个碱基对、4000个碱基对至7500个碱基对、4000个碱基对至6000个碱基对、6000至9000个碱基对或7000至8000个碱基对长度的多核苷酸。上述质粒dna可以为本技术中提供的范围内的长度的多核苷酸。
30、本发明的上述液体剂型用于提高质粒dna的稳定性。上述质粒dna的稳定性可以基于本发明所属技术领域中公知的方法来确定。尤其，稳定性可以基于质粒dna的立体结构(conformation)，例如，基于是以更为稳定的超级螺旋的(supercoiled)形态存在或是以不太稳定的开环型(open circle)及线性(linear)形态存在来确定。质粒dna的立体结构(conformation)可以通过含质粒dna的样品的毛细管电泳或hplc(高效液相色谱(high-pressure liquid chromatography))来确定。可以通过与开环型及线型形态比较来在多种条件下测量超级螺旋的dna含量。
31、在本发明的一实例中，上述质粒dna的至少90％形成超级螺旋(supercoiled)。在一部分实例中，上述液体组合物内的上述质粒dna的至少92.5％形成超级螺旋，但不限定于此。在一部分实例中，上述液体组合物内的上述质粒dna的至少95％形成超级螺旋。在一部分实例中，上述液体组合物内的质粒dna的至少97％形成超级螺旋。在一部分实例中，上述液体组合物内的质粒dna的至少98％形成超级螺旋。
32、在本发明的一实例中，液体组合物还包含缓冲液(buffer)来保持药物组合物的ph。上述缓冲液可以包含本发明所属技术领域中公知的缓冲化合物，例如，taps、n,n-二羟乙基甘氨酸(bicine)、三羟甲基氨基甲烷(tris)、n-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(tricine)、tapso、hepes、tes、mpos、pipes、甲胂酸盐(cacodylate)或mes。上述缓冲液可以包含柠檬酸(citric acid)、磷酸二氢钾(monopotassium phosphate)、硼酸(boric acid)或二乙基巴比妥酸(diethyl barbituric acid)。上述缓冲液可以为pbs、hepes、tris或tris/edta缓冲液。上述缓冲液可以为其他磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液(phosphate buffers)可以包含一价磷酸二氢盐(monobasic dihydrogen phosphate)与二价磷酸氢盐(dibasicmonohydrogenphosphate)的混合物。
33、上述缓冲液可以为磷酸钾(potassium phosphate)缓冲液。上述磷酸钾缓冲液能够以约30-50mm、约35-50mm、约40-50mm、约45-50mm、约30-45mm、约35-45mm、约40-45mm、约30-40mm、约35-40mm或约40mm的浓度包含磷酸钾。
34、上述液体组合物所含的缓冲液的ph可以约为7至9。在一部分实例中，上述ph可以为约7至9、约7.5至9、约8至9、约7至8.5、约7.5至8.5、约8至8.5、约7至8、约7.5至8或约8。
35、在本发明的一实例中，上述液体剂型包含约30-50mm的磷酸钾，ph约为7.5-8.5。
36、在本发明的一实例中，上述液体剂型还包含盐。上述盐可以为氯化钠(nacl)。上述氯化钠的浓度可以为约0.5-1.5％、约0.5-1.4％、约0.5-1.3％、约0.5-1.2％、约0.5-1.1％、约0.5-1.0％、约0.5-0.9％、约0.6-1.5％、约0.6-1.4％、约0.6-1.3％、约0.6-1.2％、约0.6-1.1％、约0.6-1.0％、约0.6-0.9％、约0.7-1.5％、约0.7-1.4％、约0.7-1.3％、约0.7-1.2％、约0.7-1.1％、约0.7-1.0％、约0.7-0.9％、约0.8-1.5％、约0.8-1.4％、约0.8-1.3％、约0.8-1.2％、约0.8-1.1％、约0.8-1.0％、约0.8-0.9％或0.9％。
37、在本发明的一实例中，上述液体剂型包含约40mm的磷酸钾。
38、在本发明的一实例中，上述液体剂型包含约0.9％的氯化钠。
39、在本发明的一实例中，上述液体剂型的ph约为8.0。
40、在本发明的一实例中，上述液体剂型可以包含约40mm的磷酸钾、约0.9％的氯化钠，ph可以约为8.0。
41、在本发明的一实例中，上述液体剂型中的质粒在2-8℃的温度下保管3个月、4个月、5个月或6个月后，仍保持80-100的超级螺旋百分比(sc％，supercoiled％)，保持85-100sc％、90-100sc％或95-100sc％。
42、在本发明的一实例中，上述液体剂型中的质粒在15-30℃的温度下保管至少3个月、4个月、5个月或6个月后仍保持80-100sc％、81-100sc％、82-100sc％、83-100sc％、84-100sc％。上述保管温度为15-30℃、16-30℃、17-30℃、18-30℃、19-30℃、20-30℃、21-30℃、22-30℃、23-30℃、24-30℃、25-30℃、15-28℃、16-28℃、17-28℃、18-28℃、19-28℃、20-28℃、21-28℃、22-28℃、23-28℃、24-28℃、25-28℃、15-27℃、16-27℃、17-27℃、18-27℃、19-27℃、20-27℃、21-27℃、22-27℃、23-27℃、24-27℃、25-27℃、15-26℃、16-26℃、17-26℃、18-26℃、19-26℃、20-26℃、21-26℃、22-26℃、23-26℃、24-26℃、25-26℃或25℃，但不限定于此。本发明的上述液体剂型为了提高质粒dna的稳定性而包含含有稳定化量的糖的水溶液。上述糖可以为蔗糖、海藻糖、甘露醇或山梨糖醇。
43、因此，本发明的上述液体剂型还可以包含蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇、亮氨酸或它们的组合。
44、在本发明的一实例中，上述液体剂型还包含约1-2％的蔗糖、海藻糖约0.5-2％的海藻糖、约0.01-1％的山梨糖醇、约0.05-0.5％的亮氨酸或它们的组合。在本发明的一实例中，上述液体剂型包含约1.5％的蔗糖、约0.5～1.5％的海藻糖、约0.05～0.25％的山梨糖醇、约0.1～0.5％的亮氨酸或它们的组合。
45、在本发明再一实施方式的质粒dna的液体剂型中，本发明的液体剂型还可以在上述一实施方式的液体剂型中包含约0.15至1.5％的甘露醇。
46、在本发明的一实例中，上述液体剂型包含约0.15％至1.5％、约0.15％至1.25％、约0.15％至1.0％、约0.15％至0.75、约0.15％至0.5％、约0.15％至0.25％、约0.25％至1.5％、约0.25％至1.25％、约0.25％至1.0％、约0.25％至0.75、约0.25％至0.5％、约0.3％至1.25％、约0.3％至1.0％、约0.3％至0.75、约0.3％至0.5％、约0.5％至1.25％、约0.5％至1.0％、约0.5％至0.75％、约1.5％、约1.25％、约1.0％、约0.75％、约0.5％或约0.25％浓度的甘露醇，但不限定于此。
47、在本说明书中，上述本发明一实施方式的液体剂型命名为b剂型。
48、在本发明的一实例中，上述液体剂型中的质粒dna在2-8℃的温度下保管至少3个月、4个月、5个月或6个月后仍保持90-100sc％。
49、在本发明的一实例中，上述液体剂型中的质粒dna在15-30℃的温度下保管至少3个月、4个月、5个月或6个月后仍保持60-100、70-100、75-100、76-100、77-100、78-100、79-100或80-100sc％。上述保管温度为15-30℃、16-30℃、17-30℃、18-30℃、19-30℃、20-30℃、21-30℃、22-30℃、23-30℃、24-30℃、25-30℃、15-28℃、16-28℃、17-28℃、18-28℃、19-28℃、20-28℃、21-28℃、22-28℃、23-28℃、24-28℃、25-28℃、15-27℃、16-27℃、17-27℃、18-27℃、19-27℃、20-27℃、21-27℃、22-27℃、23-27℃、24-27℃、25-27℃、15-26℃、16-26℃、17-26℃、18-26℃、19-26℃、20-26℃、21-26℃、22-26℃、23-26℃、24-26℃、25-26℃、15-25℃、16-25℃、17-25℃、18-25℃、19-25℃、20-25℃、21-25℃、22-25℃、23-25℃、24-25℃或25℃，但不限定于此。
50、在本发明另一实施方式的质粒dna的液体剂型中，本发明的液体剂型在上述一实施方式的液体剂型中包含约0.001至0.3％的甘露醇、约0.05至0.5％的山梨糖醇、约0.05至0.5％的蔗糖、约0.15至3％的海藻糖、约0.01至1％的亮氨酸(leucine)或它们的组合。
51、在本说明书中，上述本发明一实施方式的液体剂型命名为c剂型。
52、在本发明的一实例中，上述液体剂型可以包含约0.001％至0.3％、约0.005％至0.3％、约0.01％至0.3％、约0.02％至0.3％、约0.03％至0.3％、约0.04％至0.3％、约0.05％至0.3％、约0.001％至0.25％、约0.005％至0.25％、约0.01％至0.25％、约0.02％至0.25％、约0.03％至0.25％、约0.04％至0.25％、约0.05％至0.25％、约0.001％至0.2％、约0.005％至0.2％、约0.01％至0.2％、约0.02％至0.2％、约0.03％至0.2％、约0.04％至0.2％、约0.05％至0.2％、约0.001％至0.15％、约0.005％至0.15％、约0.01％至0.15％、约0.02％至0.15％、约0.03％至0.15％、约0.04％至0.15％、约0.05％至0.15％、约0.001％至0.1％、约0.005％至0.1％、约0.01％至0.1％、约0.02％至0.1％、约0.03％至0.1％、约0.04％至0.1％、约0.05％至0.1％、约0.001％至0.075％、约0.005％至0.075％、约0.01％至0.075％、约0.02％至0.075％、约0.03％至0.075％、约0.04％至0.075％、约0.05％至0.075％、约0.001％至0.07％、约0.005％至0.07％、约0.01％至0.07％、约0.02％至0.07％、约0.03％至0.07％、约0.04％至0.07％、约0.05％至0.07％、约0.001％至0.06％、约0.005％至0.06％、约0.01％至0.06％、约0.02％至0.06％、约0.03％至0.06％、约0.04％至0.06％、约0.05％至0.06％、约0.001％至0.05％、约0.005％至0.05％、约0.01％至0.05％、约0.02％至0.05％、约0.03％至0.05％、约0.04％至0.05％、约0.01％、约0.03％、约0.05％、约0.07％、约0.075％或约0.1％浓度的甘露醇，但不限定于此。
53、在本发明的一实例中，上述液体剂型包含约0.05％至0.5％、约0.075％至0.5％、约0.1％至0.5％、约0.125％至0.5％、约0.15％至0.5％、约0.2％至0.5％、约0.25％至0.5％、约0.3％至0.5％、约0.35％至0.5％、约0.4％至0.5％、约0.05％、0.075％、约0.1％或约0.15％浓度的山梨糖醇，但不限定于此。
54、在本发明的一实例中，上述液体剂型包含蔗糖约0.05％至0.5％、约0.075％至0.5％、约0.1％至0.5％、约0.125％至0.5％、约0.15％至0.5％、约0.2％至0.5％、约0.25％至0.5％、约0.3％至0.5％、约0.35％至0.5％、约0.4％至0.5％、约0.05％、0.075％、约0.1％、0.15％、约0.2％或约0.3％浓度的蔗糖，但不限定于此。
55、在本发明的一实例中，上述液体剂型包含约0.15％至3％、约0.15％至2.5％、约0.15％至2％、约0.15％至1.75％、约0.15％至1.5％、约0.15％至1.25％、约0.15％至1％、约0.15％至0.8％、约0.15％至0.75％、约0.15％至0.7％、约0.15％至0.6％、约0.15％至0.5％、约0.25％至3％、约0.25％至2.5％、约0.25％至2％、约0.25％至1.75％、约0.25％至1.5％、约0.25％至1.25％、约0.25％至1％、约0.25％至0.8％、约0.25％至0.75％、约0.25％至0.7％、约0.25％至0.6％、约0.25％至0.5％、约0.5％至3％、约0.5％至2.5％、约0.5％至2％、约0.5％至1.75％、约0.5％至1.5％、约0.5％至1.25％、约0.5％至1％、约0.5％至0.8％、约0.5％至0.75％、约0.5％至0.7％、约0.5％至0.6％、约0.75％至3％、约0.75％至2.5％、约0.75％至2％、约0.75％至1.75％、约0.75％至1.5％、约0.75％至1.25％、约0.75％至1％、约0.75％至0.8％、约1％至3％、约1％至2.5％、约1％至2％、约1％至1.75％、约1％至1.5％、约1％至1.25％、约1.25％至3％、约1.25％至2.5％、约1.25％至2％、约1.25％至1.75％、约1.25％至1.5％、约1.5％至3％、约1.5％至2.5％、约1.5％至2％、约1.5％至1.75％、0.5％、约1.0％、约1.25％、约1.5％、约2％、约2.5％或约3％浓度的海藻糖，但不限定于此。
56、在本发明的一实例中，上述液体剂型包含约0.01％至1％、约0.01％至0.9％、约0.01％至0.8％、约0.01％至0.7％、约0.01％至0.6％、约0.01％至0.5％、约0.01％至0.4％、约0.01％至0.3％、约0.01％至0.2％、约0.01％至0.1％、约0.03％至1％、约0.03％至0.9％、约0.03％至0.8％、约0.03％至0.7％、约0.03％至0.6％、约0.03％至0.5％、约0.03％至0.4％、约0.03％至0.3％、约0.03％至0.2％、约0.03％至0.1％、约0.05％至1％、约0.05％至0.9％、约0.05％至0.8％、约0.05％至0.7％、约0.05％至0.6％、约0.05％至0.5％、约0.05％至0.4％、约0.05％至0.3％、约0.05％至0.2％、约0.05％至0.1％、约0.075％至1％、约0.075％至0.9％、约0.075％至0.8％、约0.075％至0.7％、约0.075％至0.6％、约0.075％至0.5％、约0.075％至0.4％、约0.075％至0.3％、约0.075％至0.2％、约0.075％至0.1％、约0.08％至1％、约0.08％至0.9％、约0.08％至0.8％、约0.08％至0.7％、约0.08％至0.6％、约0.08％至0.5％、约0.08％至0.4％、约0.08％至0.3％、约0.08％至0.2％、约0.08％至0.1％、约0.09％至1％、约0.09％至0.9％、约0.09％至0.8％、约0.09％至0.7％、约0.09％至0.6％、约0.09％至0.5％、约0.09％至0.4％、约0.09％至0.3％、约0.09％至0.2％、约0.09％至0.1％、约0.01％、约0.03％、约0.05％、约0.075％、约0.08％、约0.09％、约0.1％、约0.2％或约0.3％浓度的亮氨酸，但不限定于此。
57、在本发明的一实例中，上述液体剂型包含约0.05％的甘露醇、约0.15％的山梨糖醇、约0.3％的蔗糖、约1.5％的海藻糖、约0.1％的亮氨酸或它们的组合。
58、在本发明的一实例中，上述液体剂型中的质粒dna在2-8℃的温度下保管至少3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月或9个月后仍保持90-100、91-100、92-100、93-100或94-100sc％。
59、在本发明的一实例中，上述液体剂型中的质粒dna在15-30℃的温度下保管至少3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月或9个月后仍保持80-100、81-100、82-100、83-100、84-100、85-100sc％。上述保管温度为15-30℃、16-30℃、17-30℃、18-30℃、19-30℃、20-30℃、21-30℃、22-30℃、23-30℃、24-30℃、25-30℃、15-28℃、16-28℃、17-28℃、18-28℃、19-28℃、20-28℃、21-28℃、22-28℃、23-28℃、24-28℃、25-28℃、15-27℃、16-27℃、17-27℃、18-27℃、19-27℃、20-27℃、21-27℃、22-27℃、23-27℃、24-27℃、25-27℃、15-26℃、16-26℃、17-26℃、18-26℃、19-26℃、20-26℃、21-26℃、22-26℃、23-26℃、24-26℃、25-26℃、15-25℃、16-25℃、17-25℃、18-25℃、19-25℃、20-25℃、21-25℃、22-25℃、23-25℃、24-25℃或25℃，但不限定于此。
60、在本发明还一实施方式的质粒dna的液体剂型中，上述液体剂型还包含甘露醇约0.001至0.3％的甘露醇、约0.05至0.5％的山梨糖醇、约0.05至0.5％的蔗糖、约0.15至3％的海藻糖、约0.045-0.055％的亮氨酸或它们的组合。
61、在本发明的一实例中，上述液体剂型可以包含约0.001至0.3％、约0.005至0.3％、约0.01至0.3％、约0.02至0.3％、约0.03至0.3％、约0.04至0.3％、约0.05至0.3％、约0.001至0.25％、约0.005至0.25％、约0.01至0.25％、约0.02至0.25％、约0.03至0.25％、约0.04至0.25％、约0.05至0.25％、约0.001至0.2％、约0.005至0.2％、约0.01至0.2％、约0.02至0.2％、约0.03至0.2％、约0.04至0.2％、约0.05至0.2％、约0.001至0.15％、约0.005至0.15％、约0.01至0.15％、约0.02至0.15％、约0.03至0.15％、约0.04至0.15％、约0.05至0.15％、约0.001至0.1％、约0.005至0.1％、约0.01至0.1％、约0.02至0.1％、约0.03至0.1％、约0.04至0.1％、约0.05至0.1％、约0.001至0.075％、约0.005至0.075％、约0.01至0.075％、约0.02至0.075％、约0.03至0.075％、约0.04至0.075％、约0.05至0.075％、约0.001至0.07％、约0.005至0.07％、约0.01至0.07％、约0.02至0.07％、约0.03至0.07％、约0.04至0.07％、约0.05至0.07％、约0.001至0.06％、约0.005至0.06％、约0.01至0.06％、约0.02至0.06％、约0.03至0.06％、约0.04至0.06％、约0.05至0.06％、约0.001至0.05％、约0.005至0.05％、约0.01至0.05％、约0.02至0.05％、约0.03至0.05％、约0.04至0.05％、约0.01％、约0.03％、约0.05％、约0.07％、约0.075％或约0.1％浓度的甘露醇，但不限定于此。
62、在本发明的一实例中，上述液体剂型包含约30-39mm、约31-39mm、约32-39mm、约33-39mm、约34-39mm、约34-39mm、约35-39mm、约36-39mm、约37-39mm、约30-38.5mm、约31-38.5mm、约32-38.5mm、约33-38.5mm、约34-38.5mm、约34-38.5mm、约35-38.5mm、约36-38.5mm、约37-38.5mm、约30-38mm、约31-38mm、约32-38mm、约33-38mm、约34-38mm、约34-38mm、约35-38mm、约36-38mm、约37-38mm、约30-37.5mm、约31-37.5mm、约32-37.5mm、约33-37.5mm、约34-37.5mm、约34-37.5mm、约35-37.5mm、约36-37.5mm、约37-37.5mm、约30-37.3mm、约31-37.3mm、约32-37.3mm、约33-37.3mm、约34-37.3mm、约34-37.3mm、约35-37.3mm、约36-37.3mm、约37-37.3mm、约36mm、约37mm、约37.3mm、约37.5mm、约38mm或约39mm浓度的磷酸钾。
63、在本发明的一实例中，上述液体剂型包含约0.8-1.5％、约0.85-1.5％、约0.9-1.5％、约0.95-1.5％、约0.97-1.5％、约0.975-1.5％、约0.98-1.5％、约0.8-1.25％、约0.85-1.25％、约0.9-1.25％、约0.95-1.25％、约0.97-1.25％、约0.975-1.25％、约0.98-1.25％、约0.8-1.2％、约0.85-1.2％、约0.9-1.2％、约0.95-1.2％、约0.97-1.2％、约0.975-1.2％、约0.98-1.2％、约0.8-1.1％、约0.85-1.1％、约0.9-1.1％、约0.95-1.1％、约0.97-1.1％、约0.975-1.1％、约0.98-1.1％、约0.8-1.0％、约0.85-1.0％、约0.9-1.0％、约0.95-1.0％、约0.97-1.0％、约0.975-1.0％、约0.98-1.0％、约0.8％、约0.9％、约0.95％或约1.0％浓度的氯化钠。但不限定于此。
64、在本发明的一实例中，上述液体剂型包含约37mm的磷酸钾、约1.0％的氯化钠、约0.05％的甘露醇、约0.15％的山梨糖醇、约0.3％的蔗糖、约1.5％的海藻糖、约0.05％的亮氨酸或它们的组合，ph约为8.0。
65、在本说明书中，上述本发明一实施方式的液体剂型命名为d剂型。
66、在本发明的一实例中，上述液体剂型中的质粒dna在2-8℃的温度下保管至少3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月或9个月后仍保持90-100、91-100、92-100、93-100、94-100、95-100、95-100、96-100sc％。
67、在本发明的一实例中，上述液体剂型中的质粒dna在15-30℃的温度下保管至少3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月或9个月后仍保持80-100、81-100、82-100、83-100、84-100、85-100、86-100、87-100、88-100或89-100sc％。上述保管温度为15-30℃、16-30℃、17-30℃、18-30℃、19-30℃、20-30℃、21-30℃、22-30℃、23-30℃、24-30℃、25-30℃、15-28℃、16-28℃、17-28℃、18-28℃、19-28℃、20-28℃、21-28℃、22-28℃、23-28℃、24-28℃、25-28℃、15-27℃、16-27℃、17-27℃、18-27℃、19-27℃、20-27℃、21-27℃、22-27℃、23-27℃、24-27℃、25-27℃、15-26℃、16-26℃、17-26℃、18-26℃、19-26℃、20-26℃、21-26℃、22-26℃、23-26℃、24-26℃、25-26℃、15-25℃、16-25℃、17-25℃、18-25℃、19-25℃、20-25℃、21-25℃、22-25℃、23-25℃、24-25℃或25℃，但不限定于此。
68、在本发明的一实例中，本发明一实施方式的上述液体剂型(a剂型至d剂型)抑制质粒dnasc％的变化。
69、在本发明的具体实例中，上述液体剂型组合物中包含的质粒dnasc％以最初测量值为基准，在2-8℃的温度下保管至少3个月、4个月、5个月或6个月后仍保持80-100％、85-100％、90-100％或95-100％的测量值。例如，在本发明的液体剂型组合物所包含的质粒dnasc％的最初测量值为90sc％的情况下，在2-8℃的温度下保管6个月后，在上述液体剂型中重新测量的质粒dnasc％可以为72sc％至90sc％。上述“最初测量值”是指向本发明的液体剂型加入质粒dna后马上测量的质粒dnasc％。
70、在本发明的其他实例中，上述液体剂型组合物所包含的质粒dnasc％以最初测量值为基准，在15-30℃的温度下保管至少3个月、4个月、5个月或6个月后仍保持70-100％、75-100％、80-100％、81-100％、82-100％、83-100％、84-100％或85-100％的测量值。
71、例如，在本发明的液体剂型组合物所包含的质粒dnasc％的最初测量值为90sc％的情况下，在30℃的温度下保管6个月后重新测量的质粒dnasc％可以为63sc％至90sc％。
72、上述保管温度为15-30℃、16-30℃、17-30℃、18-30℃、19-30℃、20-30℃、21-30℃、22-30℃、23-30℃、24-30℃、25-30℃、15-28℃、16-28℃、17-28℃、18-28℃、19-28℃、20-28℃、21-28℃、22-28℃、23-28℃、24-28℃、25-28℃、15-27℃、16-27℃、17-27℃、18-27℃、19-27℃、20-27℃、21-27℃、22-27℃、23-27℃、24-27℃、25-27℃、15-26℃、16-26℃、17-26℃、18-26℃、19-26℃、20-26℃、21-26℃、22-26℃、23-26℃、24-26℃、25-26℃、15-25℃、16-25℃、17-25℃、18-25℃、19-25℃、20-25℃、21-25℃、22-25℃、23-25℃、24-25℃或25℃，但不限定于此。
73、在本发明的又一实施方式中，上述液体剂型以单位剂量形态制备为小瓶(vial)、安瓿(ampule)、瓶(bottle)或预灌封注射器(pre-filled syringe)。
74、本发明一实施方式的液体剂型可以为治疗多种疾病而向哺乳动物对象(mammalian subject)给药。本发明的液体剂型可以通过多种输送方法来给药，例如，口服(orally)或胃肠外(parenteral)途径，例如，可以通过静脉内(intravenous)、肌肉内(intramuscular)、心内膜内(intraendocardial)、心肌内(intramyocardial)、心包内(intrapericardial)、心室内(intraventricular)、关节内(intraarticular)、皮内(intradermal)、脑内(intracerebral)、肾内(intrarenal)、肝内(intrahepatic)、脾脏内(intrasplenic)、淋巴管内(intralymphatic)、皮下(subcutaneous)、腹腔内(intraabdominal)、睾丸内(intratesticular)、卵巢内(intraovarian)、子宫内(intrauterine)、胸骨(sternal)、气管内(intratracheal)、胸腔内(intraplueral)、胸廓内(intrathoracic)、硬膜内(intradural)、脊柱内(intraspinal)、骨髓内(intramedullary)、壁内(intramural)、绒毛膜内(intrascorionic)及动脉内注射(arterial injection)或注入(infusion)或直肠(rectal)、鼻腔内(intranasal)、吸入(inhalational)或通过眼球内(intraocular)的局部(topically)给药来给药。在特定实例中，输送方法为肌肉内、心肌内、静脉内、脑内或肾内。
75、在本发明的一实例中，核酸构建物通过液体药物组合物的注射来给药。在具体的实例中，多核苷酸构建物通过肌肉内注射来给药。典型地，多核苷酸构建物通过肌肉内注射来给药至受到影响的部位。在一部分实例中，多核苷酸构建物向对象的四肢(limbs)、心脏或其他身体部位的肌肉给药。
76、在一部分实例中，上述构建物通过皮下(subcutaneously)或皮内(intradermally)来注射。在一部分实例中，上述多核苷酸构建物通过血管内输送来给药。在特定实例中，上述构建物通过逆行静脉注射(retrograde intravenous injection)来注射。
77、应该理解的是，本发明的液体剂型的组合物典型的每天服用量应参考包括所要治疗的状态、选择的给药途径、患者个人的年龄、性别及体重以及患者症状的严重程度在内的多种相关因素来确定，能够以单次剂量或多次剂量来给药。多核苷酸构建物以治疗有效量来给药。
78、在本技术记载的方法的一部分实例中，多核苷酸构建物以1μg至200mg、1mg至200mg、1mg至100mg、1mg至50mg、1mg至20mg、5mg至10mg、16mg、8mg或4mg的总剂量给药。
79、在典型的实例中，总剂量分为多个单独注射剂量。在一部分实例中，总剂量分为多个相同的注射剂量。在一部分实例中，总剂量分为不相同的注射剂量。
80、在以多种方式分割的剂量(divided dose)实例中，总剂量在4个、8个、16个、24个或32个不同的注射部位给药。
81、在一部分实例中，注射剂量为0.1-5mg。在特定实例中，注射剂量为0.1mg、0.15mg、0.2mg、0.25mg、0.3mg、0.35mg、0.4mg、0.45mg或0.5mg。
82、总给药剂量可以在一次访问期间或两次以上的访问期间给药。
83、在典型的分割的剂量实例中，所有多个注射剂量在相隔1小时以内给药。在一部分实例中，所有多个注射剂量在相隔1.5小时、2小时、2.5小时或3小时以内给药。
84、在本方法的多种实例中，无论以单剂量(unitary dose)给药还是以分为多个注射剂量的方式来给药，总剂量的多核苷酸构建物仅需向对象给药一次。
85、在一部分实例中，经过一次、两次、三次或四次访问向多个注射部位的总剂量的多核苷酸的给药可以包括单个周期。尤其，可以包括经过两次访问将32mg、16mg、8mg或4mg的多核苷酸构建物向多个注射部位给药的单个周期。两次访问的间隔可以为3天、5天、7天、14天、21天或28天。
86、在一部分实例中，周期可以重复。周期可以重复两次、三次、四次、五次、六次或以上。
87、在一部分实例中，周期可以在之前周期后的1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或以上的时间点重复。
88、在一部分实例中，在后续周期中给药的总剂量与之前周期给药的总剂量相同。在一部分实例中，后续周期中给药的总剂量不同于之前周期中给药的总剂量。
89、在目前优选的具体例中，核酸构建物在每个受影响的四肢(limbs)给药8mg的剂量，相同地分为多个肌肉内注射及多个访问，任意单个访问中的多个注射分别在不同的注射部位进行。在特定实例中，核酸构建物在每个受影响的四肢给药8mg的剂量，均等地分为第0天每个四肢4mg的第一剂量及第14天每个四肢4mg的第二剂量，其中，第一剂量及第二剂量分别相同地分为多个注射剂量。
90、实际给药的量、速度及给药的经时根据所要治疗的肌病的属性及疾病的严重程度的不同而不同。在典型的实例中，多核苷酸构建物以减少肌病的症状，例如，减少疼痛的有效量来给药。在一部分实例中，上述量在给药1周内对减少症状有效。在一部分实例中，上述量在给药后2周、3周或4周内对于减少症状有效。
91、质粒dna可以根据所治疗的状态同时或依次、单独或与其他质粒dna一同组合来给药。
92、在一部分实例中，液体剂型的药物组合物包含编码人hgf的质粒dna。液体剂型的药物组合物可以为治疗多种疾病，例如，过去证明可以通过给药质粒dna来治疗的疾病而给药。质粒dna可以编码人hgf等治疗基因。这些疾病包括缺血性或肝疾病、冠状动脉疾病(coronary artery disease，“cad”)、肌萎缩侧索硬化症(amytrophic lateralsclerosis，“als”)、外周动脉疾病(peripheral artery disease，“糖尿病性溃疡(diabetic ulcer)”)及糖尿病性周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy，“dpn”)或由疾病、外伤、感染或维生素缺乏状态引起的神经病(neuropathy)，但不限定于此。例如，神经病会由糖尿病、维生素缺乏、自身免疫疾病、遗传或遗传障碍、淀粉样变性(amyloidosis)、尿毒症(uremia)、毒素(toxins)或毒(poisons)、外伤(trauma)或伤害(injury)、肿瘤(tumors)诱发或为特发性(idiopathic)。本技术中提供的参考文献的全文作为参考包括在本技术中。
93、【发明的效果】
94、本发明的包含质粒dna的液体剂型在作为药物有效成分的质粒dna的保管稳定性方面表现出优秀的功效，可以有效用作产品的稳定性及安全性优秀的药物组合物。
1.质粒dna的液体剂型，其特征在于，
2.根据权利要求1所述的质粒dna的液体剂型，其特征在于，上述液体剂型包含40mm的磷酸钾。
3.根据权利要求1所述的质粒dna的液体剂型，其特征在于，上述液体剂型包含0.9％的氯化钠。
4.根据权利要求1所述的质粒dna的液体剂型，其特征在于，上述液体剂型的ph为8.0。
5.根据权利要求1所述的质粒dna的液体剂型，其特征在于，上述液体剂型中的质粒dna在20-30℃的温度下保管6个月后仍保持80-100sc％。
6.根据权利要求1所述的质粒dna的液体剂型，其特征在于，上述液体剂型还包含蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇、亮氨酸或它们的组合。
7.根据权利要求1所述的质粒dna的液体剂型，其特征在于，上述液体剂型还包含1-2％的蔗糖、0.5-2％的海藻糖、0.01-1％的山梨糖醇、0.05-0.5％的亮氨酸或它们的组合。
8.根据权利要求1所述的质粒dna的液体剂型，其特征在于，包含0.01-5mg/ml浓度的上述质粒dna。
9.根据权利要求1所述的质粒dna的液体剂型，其特征在于，上述液体剂型还包含0.15％至1.5％的甘露醇。
10.根据权利要求9所述的质粒dna的液体剂型，其特征在于，上述液体剂型中的质粒dna在2-8℃的温度下保管至少6个月后仍保持90-100sc％。
11.根据权利要求9所述的质粒dna的液体剂型，其特征在于，上述液体剂型中的质粒dna在15-30℃的温度下保管至少3个月、4个月、5个月或6个月后仍保持60-100sc％。
12.根据权利要求1所述的质粒dna的液体剂型，其特征在于，上述液体剂型还包含0.001％至0.3％的甘露醇、0.05％至0.5％的山梨糖醇、0.05％至0.5％的蔗糖、0.15％至3％的海藻糖、0.01％至1％的亮氨酸或它们的组合。
13.根据权利要求12所述的质粒dna的液体剂型，其特征在于，上述液体剂型中的质粒dna在2-8℃的温度下保管至少3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月或9个月后仍保持90-100sc％。
14.根据权利要求12所述的质粒dna的液体剂型，其特征在于，上述液体剂型中的质粒dna在20-30℃的温度下保管至少3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月或9个月后仍保持80-100sc％。
15.根据权利要求1所述的质粒dna的液体剂型，其特征在于，上述液体剂型还包含0.001％至0.3％的甘露醇、0.05％至0.5％的山梨糖醇、0.05％至0.5％的蔗糖、0.15％至3％的海藻糖、0.045-0.055％的亮氨酸或它们的组合。
16.根据权利要求15所述的质粒dna的液体剂型，其特征在于，上述液体剂型包含37-37.3mm的磷酸钾。
17.根据权利要求15所述的质粒dna的液体剂型，其特征在于，上述液体剂型包含0.975-1.0％的氯化钠。
18.根据权利要求15所述的质粒dna的液体剂型，其特征在于，上述液体剂型中的质粒dna在2-8℃的温度下保管至少3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月或9个月后仍保持90-100sc％。
19.根据权利要求15所述的质粒dna的液体剂型，其特征在于，上述液体剂型中的质粒dna在20-30℃的温度下保管至少3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月或9个月后仍保持80-100sc％。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的质粒dna的液体剂型，其特征在于，上述液体剂型制备为小瓶、安瓿、瓶或预灌封注射器。
