1.本发明涉及唾液酸制备技术领域，尤其涉及一种提高发酵液中聚唾液酸提取率的方法。
背景技术：2.唾液酸是9-碳单糖的衍生物，学名为n-乙酰基神经氨酸，是一种天然存在的碳水化合物，唾液酸在大脑和神经系统的产生和发育中发挥非常重要的作用。唾液酸的生产方法主要包括以下几类：化学合成法、酶法合成、天然产物提取、微生物发酵法。微生物发酵法的优势在于原料廉价，反应条件温和，易于放大生产，从而可以大量生产聚唾液酸，聚唾液酸经过水解后分解为唾液酸，再经过进一步的分离纯化后得到唾液酸成品。然而，在聚唾液酸水解之前还需要先从发酵液中分离出聚唾液酸产物，但传统工艺存在分离效果不佳，导致发酵液中存在相当一部分聚唾液酸无法被提取出来，造成了目标产物的浪费。
技术实现要素：3.针对上述问题，本发明提供一种提高发酵液中聚唾液酸提取率的方法，该方法不仅能够提高发酵液中聚唾液酸的提取率以及后续提纯过程中唾液酸的提取率，而且有助于提高得到的唾液酸产品的稳定性。为实现上述发明目的，本发明公开以下技术方案：
4.一种提高发酵液中聚唾液酸提取率的方法，包括如下步骤：
5.(1)将含有聚唾液酸的发酵液过滤后取滤液，然后在所述滤液中加入甲壳素粉末后搅拌均匀，完成后加入乙醇再次搅拌，然后静置，最后进行固液分离，即得聚唾液酸粗品。
6.(2)将所述聚唾液酸粗品用水复溶，然后再次进行固液分离，以去除其中的不溶物，即得聚唾液酸溶液。
7.(3)将所述聚唾液酸溶液水解，然后对得到的水解液依次进行中和、脱色处理，然后在得到的脱色液中加入甲壳素粉末搅拌均匀，完成后加入乙醇再次搅拌，然后静置，最后进行固液分离，得唾液酸粗品。
8.(4)将所述唾液酸粗品用乙醇洗涤后干燥，即得唾液酸产品。
9.进一步地，步骤(1)中，所述滤液与甲壳素粉末的体积质量比为1l：0.1～0.13g。通过加入甲壳素粉末能够与乙醇配合，从而促进滤液中聚唾液酸形核、聚集长大、沉淀，将聚唾液酸分离出来。
10.进一步地，步骤(1)中，所述乙醇的加入量为滤液体积的3～4.2倍。
11.进一步地，步骤(1)中，所述静置时间为20～35min，以使聚唾液酸产物的析出过程充分进行。
12.进一步地，步骤(2)中，所述聚唾液酸粗品复溶在水中后形成的溶液中，聚唾液酸粗品的质量分数为2～3％，完成后过滤将不溶物滤除，得到的清液即为聚唾液酸溶液。优选地，所述水包括去离子水或蒸馏水。
13.进一步地，步骤(3)中，在所述聚唾液酸溶液中加入稀盐酸后在加热条件下进行水
解。可选地，所述加入稀盐酸后的聚唾液酸溶液中稀盐酸浓度为0.1～0.35mol/l，所述加热温度为80～85℃，时间为2～3小时。
14.进一步地，步骤(3)中，在所述水解液中加入氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾等中的至少一种进行中和，以去除水解液中残留的盐酸，使水解液保持中性。
15.进一步地，步骤(3)中，向所述中和处理得到的中和液中加入脱色剂进行脱色处理，以降低中和液中的色素等。可选地，所述脱色剂包括活性炭、硅藻土等。可选地，所述脱色剂与中和液的比例为2～5g：1l。
16.进一步地，步骤(3)中，所述脱色液与甲壳素粉末的体积质量比为1l：0.1～0.15g。
17.进一步地，步骤(3)中，所述乙醇的加入量为脱色液体积的3～4.2倍。
18.进一步地，步骤(3)中，还包括对所述脱色液进行浓缩的工序，浓缩完成后加入甲壳素粉末进行后续处理。优选地，将所述水解液加热浓缩至原体积的40～50％。
19.进一步地，步骤(3)中，所述静置时间为20～35min，以使聚唾液酸产物的析出过程充分进行。
20.进一步地，步骤(4)中，所述干燥包括真空干燥、冻干等中的任意一种。
21.现有技术相比，本发明取得的有益效果包括：在聚唾液酸水解之前还需要先从发酵液中提取聚唾液酸产物。在对聚唾液酸水解后还需要从水解液中再次提取唾液酸。传统工艺主要采用加入乙醇等有机溶剂进行醇沉的方式实现上述目的，但这种工艺存在分离效果不佳，导致相当一部分聚唾液酸无法被提取出来的问题，造成了目标产物的浪费。为此，本发明首先在发酵液的滤液中加入了甲壳素，然后再加入乙醇进行滤液中聚唾液酸的提取，由于所述甲壳素不溶于水，其在进入滤液中后形成大量分散的异质晶核，在加入所述乙醇后，滤液中的聚唾液酸分子在异质晶核的作用下开始形核、长大、结晶聚集，不仅加快了聚唾液酸的结晶析出，而且使滤液中聚唾液酸的析出更为彻底，提高了聚唾液酸的提取率，减少了目标产物的浪费。同时，本发明在后续唾液酸提取的过程中也采用了上述的方法，从而提高了唾液酸的提取率，减少了目标产物的浪费，而且得到的唾液酸产品中均匀分布着甲壳素，其具有良好的抗菌性能，有效提高了唾液酸产品的稳定性。
具体实施方式
22.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。现通过具体实施对本发明进一步说明。
23.实施例1
24.一种提高发酵液中聚唾液酸提取率的方法的制备方法，包括步骤：
25.(1)将含有聚唾液酸的发酵液过滤去除菌体固体物后收集滤液，按照滤液与甲壳素粉末的体积/质量比＝1l：0.12g的比例，在所述滤液中加入甲壳素粉末后搅拌5min。然后加入滤液体积4倍的95％的乙醇后再次搅拌5min，然后静置30min，最后进行离心(转速8000r/min，时间10min)将沉淀物分离出来，即得聚唾液酸粗品。
26.(2)将所述聚唾液酸粗品加入去离子水中进行复溶，制备成质量分数为3％的聚唾液酸粗品溶液。搅拌10min后对溶液进行离心(转速10000r/min，时间10min)，以去除聚唾液酸粗品中的不溶物，收集离心液，即得聚唾液酸溶液。
27.(3)在所述聚唾液酸溶液中加入0.3mol/l的盐酸后在80℃下加热水解3小时。完成后在得到的水解液中加入氢氧化钠进行中和，得到中性水解液，然后在中性水解液中加入活性炭进行脱色处理(活性炭与中性水解液的比例为4g：1l)，完成后进行过滤去除中性水解液中的活性炭，得到脱色液。然后在所述脱色液中加入甲壳素粉末搅拌5min(脱色液与甲壳素粉末的体积/质量比为1l：0.13g)，然后加入脱色液体积4倍的95％的乙醇后再次搅拌5min，然后静置30min，完成后进行离心(转速10000r/min，时间10min)，收集固体物即得唾液酸粗品。
28.(4)将所述唾液酸粗品用95％的乙醇洗涤后真空干燥，即得唾液酸产品。
29.实施例2
30.一种提高发酵液中聚唾液酸提取率的方法的制备方法，包括步骤：
31.(1)将含有聚唾液酸的发酵液过滤去除菌体固体物后收集滤液，按照滤液与甲壳素粉末的体积/质量比＝1l：0.13g的比例，在所述滤液中加入甲壳素粉末后搅拌8min。然后加入滤液体积4.2倍的95％的乙醇后再次搅拌5min，然后静置20min，最后进行离心(转速8000r/min，时间10min)将沉淀物分离出来，即得聚唾液酸粗品。
32.(2)将所述聚唾液酸粗品加入去离子水中进行复溶，制备成质量分数为3％的聚唾液酸粗品溶液。搅拌10min后对溶液进行离心(转速10000r/min，时间10min)，以去除聚唾液酸粗品中的不溶物，收集离心液，即得聚唾液酸溶液。
33.(3)在所述聚唾液酸溶液中加入0.35mol/l的盐酸后在85℃下加热水解2小时。完成后在得到的水解液中加入碳酸钠进行中和，得到中性水解液，然后在中性水解液中加入活性炭进行脱色处理(活性炭与中性水解液的比例为5g：1l)，完成后进行过滤去除中性水解液中的活性炭，得到脱色液。然后在所述脱色液中加入甲壳素粉末搅拌5min(脱色液与甲壳素粉末的体积/质量比为1l：0.15g)，然后加入脱色液体积4.2倍的95％的乙醇后再次搅拌5min，然后静置35min，完成后进行离心(转速10000r/min，时间10min)，收集固体物即得唾液酸粗品。
34.(4)将所述唾液酸粗品用95％的乙醇洗涤后真空干燥，即得唾液酸产品。
35.实施例3
36.一种提高发酵液中聚唾液酸提取率的方法的制备方法，包括步骤：
37.(1)将含有聚唾液酸的发酵液过滤去除菌体固体物后收集滤液，按照滤液与甲壳素粉末的体积/质量比＝1l：0.11g的比例，在所述滤液中加入甲壳素粉末后搅拌5min。然后加入滤液体积3倍的95％的乙醇后再次搅拌5min，然后静置35min，最后进行离心(转速8000r/min，时间10min)将沉淀物分离出来，即得聚唾液酸粗品。
38.(2)将所述聚唾液酸粗品加入去离子水中进行复溶，制备成质量分数为2％的聚唾液酸粗品溶液。搅拌10min后对溶液进行离心(转速10000r/min，时间10min)，以去除聚唾液酸粗品中的不溶物，收集离心液，即得聚唾液酸溶液。
39.(3)在所述聚唾液酸溶液中加入0.1mol/l的盐酸后在80℃下加热水解2小时。完成后在得到的水解液中加入碳酸氢钠进行中和，得到中性水解液，然后在中性水解液中加入活性炭进行脱色处理(活性炭与中性水解液的比例为2g：1l)，完成后进行过滤去除中性水解液中的活性炭，得到脱色液。然后在所述脱色液中加入甲壳素粉末搅拌5min(脱色液与甲壳素粉末的体积/质量比为1l：0.1g)，然后加入脱色液体积3倍的95％的乙醇后再次搅拌
5min，然后静置20min，完成后进行离心(转速10000r/min，时间10min)，收集固体物即得唾液酸粗品。
40.(4)将所述唾液酸粗品用95％的乙醇洗涤后真空干燥，即得唾液酸产品。
41.实施例4
42.一种提高发酵液中聚唾液酸提取率的方法的制备方法，包括步骤：
43.(1)将含有聚唾液酸的发酵液过滤去除菌体固体物后收集滤液，按照滤液与甲壳素粉末的体积/质量比＝1l：0.11g的比例，在所述滤液中加入甲壳素粉末后搅拌5min。然后加入滤液体积3.5倍的95％的乙醇后再次搅拌5min，然后静置30min，最后进行离心(转速8000r/min，时间10min)将沉淀物分离出来，即得聚唾液酸粗品。
44.(2)将所述聚唾液酸粗品加入去离子水中进行复溶，制备成质量分数为3％的聚唾液酸粗品溶液。搅拌10min后对溶液进行离心(转速10000r/min，时间10min)，以去除聚唾液酸粗品中的不溶物，收集离心液，即得聚唾液酸溶液。
45.(3)在所述聚唾液酸溶液中加入0.25mol/l的盐酸后在80℃下加热水解3小时。完成后在得到的水解液中加入氢氧化钠进行中和，得到中性水解液，然后在中性水解液中加入活性炭进行脱色处理(活性炭与中性水解液的比例为4g：1l)，完成后进行过滤去除中性水解液中的活性炭，得到脱色液。然后将所述脱色液加热浓缩至原体积的50％，然后在得到的浓缩液中加入甲壳素粉末搅拌5min(脱色液与甲壳素粉末的体积/质量比为1l：0.13g)，然后加入脱色液体积3.5倍的95％的乙醇后再次搅拌5min，然后静置30min，完成后进行离心(转速10000r/min，时间10min)，收集固体物即得唾液酸粗品。
46.(4)将所述唾液酸粗品用95％的乙醇洗涤后真空干燥，即得唾液酸产品。
47.实施例5
48.一种提高发酵液中聚唾液酸提取率的方法的制备方法，包括步骤：
49.(1)将含有聚唾液酸的发酵液过滤去除菌体固体物后收集滤液，按照滤液与甲壳素粉末的体积/质量比＝1l：0.12g的比例，在所述滤液中加入甲壳素粉末后搅拌8min。然后加入滤液体积4倍的95％的乙醇后再次搅拌5min，然后静置20min，最后进行离心(转速8000r/min，时间10min)将沉淀物分离出来，即得聚唾液酸粗品。
50.(2)将所述聚唾液酸粗品加入去离子水中进行复溶，制备成质量分数为3％的聚唾液酸粗品溶液。搅拌10min后对溶液进行离心(转速10000r/min，时间10min)，以去除聚唾液酸粗品中的不溶物，收集离心液，即得聚唾液酸溶液。
51.(3)在所述聚唾液酸溶液中加入0.15mol/l的盐酸后在85℃下加热水解2小时。完成后在得到的水解液中加入碳酸钠进行中和，得到中性水解液，然后在中性水解液中加入活性炭进行脱色处理(活性炭与中性水解液的比例为5g：1l)，完成后进行过滤去除中性水解液中的活性炭，得到脱色液。然后将所述脱色液加热浓缩至原体积的40％，然后在得到的浓缩液中加入甲壳素粉末搅拌5min(脱色液与甲壳素粉末的体积/质量比为1l：0.14g)，然后加入脱色液体积4倍的95％的乙醇后再次搅拌5min，然后静置35min，完成后进行离心(转速10000r/min，时间10min)，收集固体物即得唾液酸粗品。
52.(4)将所述唾液酸粗品用95％的乙醇洗涤后真空干燥，即得唾液酸产品。
53.实施例6
54.一种提高发酵液中聚唾液酸提取率的方法的制备方法，包括步骤：
55.(1)将含有聚唾液酸的发酵液过滤去除菌体固体物后收集滤液，然后加入滤液体积4倍的95％的乙醇后再次搅拌5min，然后静置30min，最后进行离心(转速8000r/min，时间10min)将沉淀物分离出来，即得聚唾液酸粗品。
56.(2)将所述聚唾液酸粗品加入去离子水中进行复溶，制备成质量分数为3％的聚唾液酸粗品溶液。搅拌10min后对溶液进行离心(转速10000r/min，时间10min)，以去除聚唾液酸粗品中的不溶物，收集离心液，即得聚唾液酸溶液。
57.(3)在所述聚唾液酸溶液中加入0.3mol/l的盐酸后在80℃下加热水解3小时。完成后在得到的水解液中加入氢氧化钠进行中和，得到中性水解液，然后在中性水解液中加入活性炭进行脱色处理(活性炭与中性水解液的比例为4g：1l)，完成后进行过滤去除中性水解液中的活性炭，得到脱色液。然后加入脱色液体积4倍的95％的乙醇后再次搅拌5min，然后静置30min，完成后进行离心(转速10000r/min，时间10min)，收集固体物即得唾液酸粗品。
58.(4)将所述唾液酸粗品用95％的乙醇洗涤后真空干燥，即得唾液酸产品。
59.性能测试
60.对各实施例的聚唾液酸的提取率和唾液酸的提取率进行测试，其中，所述聚唾液酸的提取率是指从滤液中提取出的聚唾液酸粗品质量占滤液中聚唾液酸总质量的百分比；所述唾液酸的提取率是指唾液酸粗品质量占水解液中唾液酸总质量的百分比，结果如表1所示。
61.表1
[0062][0063]
从表1的检测结果可以看出，实施例6在进行聚唾液酸和唾液酸的提取中进采用了乙醇进行醇沉，未在加入乙醇前加入甲壳素，导致聚唾液酸的提取率和唾液酸的提取率明显低于实施例1至实施例5。这是由于甲壳素不溶于水，其在进入滤液中后形成大量分散的异质晶核，在加入所述乙醇后，滤液中的聚唾液酸分子在异质晶核的作用下开始形核、长大、结晶聚集，不仅加快了聚唾液酸的结晶析出，而且使滤液中聚唾液酸的析出更为彻底，提高了聚唾液酸的提取率，唾液酸提取过程中也是同理，减少了目标产物的浪费。另外，最终得到的唾液酸产品中均匀分布着甲壳素，其具有良好的抗菌性能，有效提高了唾液酸产品的稳定性。
[0064]
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种提高发酵液中聚唾液酸提取率的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将含有聚唾液酸的发酵液过滤后取滤液，然后在所述滤液中加入甲壳素粉末后搅拌均匀，完成后加入乙醇再次搅拌，然后静置，最后进行固液分离，即得聚唾液酸粗品；(2)将所述聚唾液酸粗品用水复溶，然后再次进行固液分离，即得聚唾液酸溶液；(3)将所述聚唾液酸溶液水解，然后对得到的水解液依次进行中和、脱色处理，然后在得到的脱色液中加入甲壳素粉末搅拌均匀，完成后加入乙醇再次搅拌，然后静置，最后进行固液分离，得唾液酸粗品；(4)将所述唾液酸粗品用乙醇洗涤后干燥，即得唾液酸产品。2.根据权利要求1所述的提高发酵液中聚唾液酸提取率的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述滤液与甲壳素粉末的体积质量比为1l：0.1～0.13g。3.根据权利要求1所述的提高发酵液中聚唾液酸提取率的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述乙醇的加入量为滤液体积的3～4.2倍。4.根据权利要求1所述的提高发酵液中聚唾液酸提取率的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述聚唾液酸粗品复溶在水中后形成的溶液中，聚唾液酸粗品的质量分数为2～3％，完成后过滤将不溶物滤除，得到的清液即为聚唾液酸溶液；优选地，所述水包括去离子水或蒸馏水。5.根据权利要求1所述的提高发酵液中聚唾液酸提取率的方法，其特征在于，步骤(3)中，在所述聚唾液酸溶液中加入稀盐酸后在加热条件下进行水解；优选地，所述加入稀盐酸后的聚唾液酸溶液中稀盐酸浓度为0.1～0.35mol/l，所述加热温度为80～85℃，时间为2～3小时。6.根据权利要求1所述的提高发酵液中聚唾液酸提取率的方法，其特征在于，步骤(3)中，在所述水解液中加入氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾中的至少一种进行中和。7.根据权利要求1所述的提高发酵液中聚唾液酸提取率的方法，其特征在于，步骤(3)中，向所述中和处理得到的中和液中加入脱色剂进行脱色处理；优选地，所述脱色剂包括活性炭、硅藻土中的任意一种；优选地，所述脱色剂与中和液的比例为2～5g：1l。8.根据权利要求1所述的提高发酵液中聚唾液酸提取率的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述脱色液与甲壳素粉末的体积质量比为1l：0.1～0.15g；优选地，步骤(3)中，所述乙醇的加入量为脱色液体积的3～4.2倍；优选地，步骤(3)中，还包括对所述脱色液进行浓缩的工序，浓缩完成后加入甲壳素粉末进行后续处理；更优选地，将所述水解液加热浓缩至原体积的40～50％。9.根据权利要求1-8任一项所述的提高发酵液中聚唾液酸提取率的方法，其特征在于，步骤(1)、(3)中，所述静置时间为20～35min。10.根据权利要求1-8任一项所述的提高发酵液中聚唾液酸提取率的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述干燥包括真空干燥、冻干中的任意一种。
技术总结本发明公开一种提高发酵液中聚唾液酸提取率的方法，包括：(1)将含有聚唾液酸的发酵液过滤后取滤液，然后在所述滤液中加入甲壳素粉末、乙醇后静置，最后进行固液分离，得聚唾液酸粗品。(2)将所述聚唾液酸粗品用水复溶，然后再次进行固液分离，即得聚唾液酸溶液。(3)将所述聚唾液酸溶液水解，然后对得到的水解液依次进行中和、脱色处理，然后在得到的脱色液中加入甲壳素粉末搅拌均匀，完成后加入乙醇搅拌，然后静置，最后进行固液分离，得唾液酸粗品。(4)将所述唾液酸粗品用乙醇洗涤后干燥，即得唾液酸产品。该方法不仅能够提高发酵液中聚唾液酸的提取率以及后续提纯过程中唾液酸的提取率，而且有助于提高得到的唾液酸产品的稳定性。而且有助于提高得到的唾液酸产品的稳定性。
技术研发人员：卢健行 尹训娟 尹朝 韩宁 徐艳
受保护的技术使用者：山东润德生物科技有限公司
技术研发日：2022.07.15
技术公布日：2022/11/1
