本发明涉及发酵产物检测方法，尤其是涉及一种六神曲发酵产物含量的检测方法。
背景技术：
1、六神曲又名神曲，是一味应用历史悠久的传统中药曲剂，由辣蓼、青蒿、苍耳、赤小豆、苦杏仁、麦麸和面粉按照一定比例混合后经自然发酵制成”，具有健脾和胃、消食调中等功效。
2、目前，对于六神曲传统发酵炮制过程的控制多凭借主观经验，没有可量化的统一质量标准，因此难以控制和评价六神曲的质量。由于青蒿和辣蓼是六神曲的主要中药组分，现有技术中有将其主要成分青蒿素、芦丁、槲皮素等成分的含量作为六神曲质量的评价指标。如专利cn107037159a中公开的一种六神曲发酵过程在线质量检测方法，采用高效液相色谱法测定样品中青蒿素、槲皮素、芦丁和苦杏仁苷的含量，作为六神曲发酵过程的质量指标。
3、由于六神曲发酵产物成分复杂，因此在使用高效液相色谱法对发酵产物中的目标成分进行检测前需要先通过预处理工艺对其进行提取，而青蒿素一般使用石油醚进行提取，芦丁和槲皮素等成分则一般通过醇类进行提取，如文献“hplc测定六神曲中青蒿素,芦丁和槲皮素含量”中国酿造10(2014):5中公开的方法。
4、因此，现有技术中使用高效液相色谱法对六神曲发酵产物中的青蒿素、芦丁、槲皮素等成分含量进行检测时，若想获得较精确的检测结果，就需要分别用不同的溶剂对青蒿素和其他成分进行提取，然后再分别测定其含量，操作步骤繁琐。而若使用专利cn107037159a中的方法，使用甲醇进行提取后同时测量青蒿素、芦丁、槲皮素和苦杏仁苷的含量，由于醇类溶剂对青蒿素的提取效果不佳，则会导致检测结果的精确性下降。
技术实现思路
1、本发明是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种六神曲发酵产物含量的检测方法，采用三元低共熔溶剂对发酵后的六神曲样品进行提取，可以对青蒿素、芦丁、槲皮素均具有良好的提取效果，结合高效液相色谱法，可实现对青蒿素、芦丁、槲皮素含量的同时及高精确度检测。
2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
3、一种六神曲发酵产物含量的检测方法，包括以下步骤：
4、s1：用低共熔溶剂对发酵后的六神曲样品进行超声提取，离心取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤后，用甲醇定容，得到待测液；所述的低共熔溶剂包括摩尔比为1:1.5～5:0.5～1的三甲基苄基氯化铵、柠檬酸及丙烯脲；
5、s2：采用高效液相色谱法对待测液进行检测，得到六神曲样品中的青蒿素、芦丁和槲皮素的含量。
6、由于青蒿素与芦丁、槲皮素的分子结构和性能存在较大差异，现有技术中的溶剂难以对其同时具有良好的提取效果。因此本发明针对青蒿素、芦丁和槲皮素的性质，开发了特定的三元低共熔溶剂，用其对六神曲样品进行提取，可以对青蒿素、芦丁、槲皮素均具有良好的提取效果，实现对青蒿素、芦丁和槲皮素含量的同时及高精确度检测。
7、本发明中的低共熔溶剂以三甲基苄基氯化铵为氢键受体，柠檬酸和丙烯脲为氢键供体，可在常温下稳定存在，用其对六神曲样品进行提取时，三甲基苄基氯化铵中的苯环可以与芦丁和槲皮素中的苯环形成π-π作用力，从而对芦丁和槲皮素具有较好的提取能力；而丙烯脲则有与青蒿素相似的环结构，可以提高溶剂对青蒿素的提取能力；用丙烯脲和柠檬酸共同作为氢键供体，可以在与三甲基苄基氯化铵形成稳定的三元低共熔溶剂的同时，使低共熔溶剂对青蒿素、芦丁、槲皮素均具有良好的提取效果，结合高效液相色谱法，可实现对六神曲发酵产物含量的简便、精确检测。
8、优选地，s1中低共熔溶剂的制备方法为：将三甲基苄基氯化铵、柠檬酸及丙烯脲按比例混合，在80～90℃的水浴中磁力搅拌1～2h，得到澄清透明的均质溶液，即为所述低共熔溶剂。
9、优选地，s1中超声提取时六神曲样品和低共熔溶剂的质量体积比为1g:5～15ml，超声提取温度为30～60℃，超声提取时间20～40min。
10、优选地，s1中超声提取时的超声功率为1000～2000w，频率40～60khz。
11、优选地，s1中离心时的转速为2500～3500rpm，离心时间5～10min。
12、优选地，s2中高效液相色谱法测试时采用梯度洗脱，梯度洗过时使用的流动相a为甲醇，流动相b为ph＝5.8的磷酸盐缓冲液，洗脱梯度如下：
13、0～10min，20～30％体积分数的流动相a，70～80％体积分数的流动相b；
14、10～15min，30～45％体积分数的流动相a，55～70％体积分数的流动相b；
15、15～20min，45～60％体积分数的流动相a，40～55％体积分数的流动相b；
16、20～25min，60～80％体积分数的流动相a，20～40％体积分数的流动相b。
17、优选地，s2中高效液相色谱法使用的色谱柱为c18柱，柱温25～35℃。
18、优选地，s2中高效液相色谱法的检测波长为260～280nm。
19、优选地，s2中高效液相色谱法的流速为0.9～1.1ml/min。
20、优选地，s2中高效液相色谱法的进样量为10～30μl。
21、因此，本发明具有如下有益效果：
22、(1)以三甲基苄基氯化铵为氢键受体，柠檬酸和丙烯脲为氢键供体，制得在常温下稳定存在的三元低共熔溶剂；
23、(2)用三元低共熔溶剂对发酵后的六神曲样品进行提取，结合高效液相色谱法，可实现对青蒿素、芦丁、槲皮素含量的同时及高精确度检测。
1.一种六神曲发酵产物含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，s1中低共熔溶剂的制备方法为：将三甲基苄基氯化铵、柠檬酸及丙烯脲按比例混合，在80～90℃的水浴中磁力搅拌1～2h，得到澄清透明的均质溶液，即为所述低共熔溶剂。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，s1中超声提取时六神曲样品和低共熔溶剂的质量体积比为1g:5～15ml，超声提取温度为30～60℃，超声提取时间20～40min。
4.根据权利要求1或3所述的检测方法，其特征在于，s1中超声提取时的超声功率为1000～2000w，频率40～60khz。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，s1中离心时的转速为2500～3500rpm，离心时间5～10min。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，s2中高效液相色谱法测试时采用梯度洗脱，梯度洗过时使用的流动相a为甲醇，流动相b为ph＝5.8的磷酸盐缓冲液，洗脱梯度如下：0～10min，20～30％体积分数的流动相a，70～80％体积分数的流动相b；
7.根据权利要求1或6所述的检测方法，其特征在于，s2中高效液相色谱法使用的色谱柱为c18柱，柱温25～35℃。
8.根据权利要求1或6所述的检测方法，其特征在于，s2中高效液相色谱法的检测波长为260～280nm。
9.根据权利要求1或6所述的检测方法，其特征在于，s2中高效液相色谱法的流速为0.9～1.1ml/min。
10.根据权利要求1或6所述的检测方法，其特征在于，s2中高效液相色谱法的进样量为10～30μl。
